荧光标记蛋白的发展
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微镜、荧光计、荧光激活细胞分选仪等 就可实现
4，GFP目前存在的不足 ( 1) 检测灵敏度还有待提高, 而且其 荧光信号强度方面的非线性性质使得 定量非常困难。
( 2) 新生GFP 折叠和加工成为具有荧 光活性形式的过程十分缓慢, 使得某 些快速过程如转录的激活过程还难以 用该方法进行研究。
( 3) 紫外激发对某些GFP 有光漂白和 光破坏作用, 导致荧光信号快速丧失。 ( 4) 多数生物具有微弱的自发荧光现 象, 并有着类似的激发和发射波长, 这 些荧光背景会影响某些GFP 的检测。
Monday, May 13, 2019
蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝 色），子链的一部分直接从中间穿过 （绿色），发色团刚好在罐头盒的中 间，它被保护起来以免受周围环境的 影响。这种保护对于发射荧光是必需 的。
3，与其他报告基因不同的性质 ①从生化角度来讲, 所有已知的荧光素 酶都是氧化酶, 它利用分子氧来氧化底 物, 使产物分子处于一种激发态而发光。 这种酶/底物的相互作用是生物发光的普 遍模式。
记 蛋 白 的 基 因
Monday, May 13, 2019
如图所示为肽链的形成过程
肽链经过 弯曲、折 叠、多条 肽链的重 叠等形成 蛋白质。
所以，如若 一开始便把 荧光标记蛋 白的基因插 入到某一特 定基因内， 则新的基因 会合成荧光 融合蛋白
如左图所示，当体内物质融合了荧光蛋 白后会发出荧光，用显微镜、荧光计、 荧光激活细胞分选仪等就可以看见，若 在靠近体表处且光源强烈则肉眼可视。
GFP
1，GFP的发现 GFP是从一种生活在北太平洋寒冷水域的 水母体内发现的。这种水母体内含有一种 生物发光蛋白质——aequorin，它本身发 蓝光。GFP能把这种光转变成绿色，也就 是当水母容光焕发的时候我们实际看到的 颜色。受到Ca2+或紫外线激活时, 水母中 的发光蛋白Aequorin 被激活, 产生蓝光, GFP 能够吸收蓝光( 395nm 处有最大光 吸收) , 发射绿色( 或黄绿色) 荧光
光发射波长改变。 与第一代荧光蛋白相比，它们的优势在于能脉冲标记细胞或分子亚群，从而实现复
杂的动力学时空分析
②典例：PAGFP，mRFP1，KFP1，Dronpa等 ③缺点：其中一些蛋白光转换效率不高，亮度较低，会迅速淬灭，或者需要多聚化。
此外，光转换通常伴随着第一种颜色的丧失，这样不得不借助计算机方法来查 看整个群体。
概述：PRIME技术使用一种比GFP小 得多的蓝色荧光探针。与GFP不同的是， 新探针一开始并不与目的蛋白相连。它 是在后来通过一种全新的酶而附在蛋白 上。这种全新的酶被称为荧光基团连接 酶。
Monday, May 13, 2019
原 理 ：
原理：在导入目的 基因的同时也将编 码这种酶的基因导 入细胞。还在目的 基因上加上了一个 短的标签（13个 氨基酸），此标签 让连接酶识别蛋白
Monday, May 13, 2019
FHP（fluorescent highlighter proteins光激活蛋白即第二类荧光蛋白）
GPAC 及
（Green ＿photoactivatable ＿ Cherry光激活绿樱桃）
1，第二类荧光蛋白，FHP ①特点 这些荧光蛋白在适当的刺激下会经历结构的改变，从而打开荧光这个开关，或者荧
LOGO
荧光标记蛋白的发展
华中农业大学 工商管理0901 李佳佳
荧光标记蛋白技术实际上是也是一种标记技术。就如同最早用P标记脱氧核糖核 酸用S标记蛋白质是一样。
左图所示为验证 DNA和蛋白质谁 是遗传物质的实 验
Monday, May 13, 2019
可荧 作光 为标 报记 告蛋 基白 因在 ，生 提物 供研 细究 胞反 内面 物的 质作 的用 跟： 踪荧 定光 位标
Monday, May 13, 2019
2,GPAC 构成： 这是一个融合蛋白，它融合了红色荧光蛋白（RFP）单体Cherry和GFP的光激 活变异体。这种融合蛋白能够在表达标志物的细胞中持续发出红色荧光，而绿 色荧光只有在405-nm光激发下才会发出。 特点： ①表达GPAC的细胞在光激活前后都表现出强的红色信号，而绿色荧光只持续 数小时。 ②将某一特定蛋白放置在GPAC的N端或C端，均不影响其活性，也不会显著 影响胞内蛋白的定位或功能。即便融合伴侣需要大量的翻译后加工和修饰， GPAC仍可容忍。 不足：荧光标签相对较大，超过了50 kDa，这样，与GPAC融合的蛋白在用于 功能研究前就必须进行仔细的验证 其杰出性体现在：在时空动力学监测中突出了光转换的部分。
而GFP 是第一个例外, 它的27kDa 的单 体由238 个氨基酸构成, 本身就是一个
生物发光系统。其荧光机制是自身含有 的, 绿色荧光的发射仅需分子氧的存在, 而无需其他外源辅因子
②GFP 的表达无种属特异性。不管细胞 的种类和位置如何, 都能够自主表达; ③GFP 还能克服穿透、毒素、光漂白等 不利因素[1]。GFP 的荧光可以耐受福尔 马林的固定, 因而可以制成长期保存的 标本; ④对细胞内GFP 的检测非常简单, 用显
Monday, May 13, 2019
2，GFP发光原理 GFP控制光的部位是其自身的一部分， 仅由氨基酸构建而成，该部位含有一 段三个氨基酸组成的特殊序列：丝氨 酸－酪氨酸－甘氨酸（有时丝氨酸会 被相似的苏氨酸取代）。当蛋白质链 折叠时，这段短片段就被深埋在蛋白 质内部，然后，发生一系列化学反应： 甘氨酸与丝氨酸之间形成化学键，生 成一个新的闭合环，随后这个环会自 动脱水。最终，经过大约一个小时的 反应，周围环境中的的氧气攻击酪氨 酸的一个化学键，形成一个新的双键 并合成荧光发色团。
例如，要研究细胞内某蛋白质的 游走状态，则用荧光蛋白标记后， 其所处位置清晰可见。
Monday, May 13, 2019
技术变革
①最早为水母体中提取的GFP
②在适当刺激下会改变结构从而发出或改变荧光
的第二类荧光蛋白FHP及其典例GPAC
③最新的PRIME技术
Monday, May 13, 2019
随后，目的蛋白质与 荧光基团蛋白质同时 产生
Monday, May 13, 2019
当7-香豆素这 种蓝色荧光探 针进入细胞后， 连接酶将它与 目的蛋白上的 短标签相连。 这便使融合荧 光蛋白发出可 见荧光
优点： ①使用这种方法后，标有荧光探针的肌动 蛋白能在细胞中自由游走，并穿过细胞核。 ②此方法能应用于细胞内特定区域的蛋白， 比如细胞核、细胞膜或细胞溶质。在连接 酶上加入一段信号肽，指导它到达特定区 域。之后，酶将荧光探针与此区域的蛋白 相连。
Monday, May 13, 2019
Fra Baidu bibliotek PRIME技术
开发此技术的原因：无论是GPAC 还是GFP，他们都有一个缺点，蛋 白过大。一旦荧光探针过大，它们 就有可能干扰蛋白的正常功能，或 妨碍它们到达目的地。 如：238个氨基酸的GFP干扰了一 些蛋白的功能，比如肌动蛋白actin。 此蛋白参与了细胞分裂、运动及通 讯。然而研究人员发现，与GFP的 融合对肌动蛋白的功能和运输有着 不利影响。
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4，GFP目前存在的不足 ( 1) 检测灵敏度还有待提高, 而且其 荧光信号强度方面的非线性性质使得 定量非常困难。
( 2) 新生GFP 折叠和加工成为具有荧 光活性形式的过程十分缓慢, 使得某 些快速过程如转录的激活过程还难以 用该方法进行研究。
( 3) 紫外激发对某些GFP 有光漂白和 光破坏作用, 导致荧光信号快速丧失。 ( 4) 多数生物具有微弱的自发荧光现 象, 并有着类似的激发和发射波长, 这 些荧光背景会影响某些GFP 的检测。
Monday, May 13, 2019
蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝 色），子链的一部分直接从中间穿过 （绿色），发色团刚好在罐头盒的中 间，它被保护起来以免受周围环境的 影响。这种保护对于发射荧光是必需 的。
3，与其他报告基因不同的性质 ①从生化角度来讲, 所有已知的荧光素 酶都是氧化酶, 它利用分子氧来氧化底 物, 使产物分子处于一种激发态而发光。 这种酶/底物的相互作用是生物发光的普 遍模式。
记 蛋 白 的 基 因
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如图所示为肽链的形成过程
肽链经过 弯曲、折 叠、多条 肽链的重 叠等形成 蛋白质。
所以，如若 一开始便把 荧光标记蛋 白的基因插 入到某一特 定基因内， 则新的基因 会合成荧光 融合蛋白
如左图所示，当体内物质融合了荧光蛋 白后会发出荧光，用显微镜、荧光计、 荧光激活细胞分选仪等就可以看见，若 在靠近体表处且光源强烈则肉眼可视。
GFP
1，GFP的发现 GFP是从一种生活在北太平洋寒冷水域的 水母体内发现的。这种水母体内含有一种 生物发光蛋白质——aequorin，它本身发 蓝光。GFP能把这种光转变成绿色，也就 是当水母容光焕发的时候我们实际看到的 颜色。受到Ca2+或紫外线激活时, 水母中 的发光蛋白Aequorin 被激活, 产生蓝光, GFP 能够吸收蓝光( 395nm 处有最大光 吸收) , 发射绿色( 或黄绿色) 荧光
光发射波长改变。 与第一代荧光蛋白相比，它们的优势在于能脉冲标记细胞或分子亚群，从而实现复
杂的动力学时空分析
②典例：PAGFP，mRFP1，KFP1，Dronpa等 ③缺点：其中一些蛋白光转换效率不高，亮度较低，会迅速淬灭，或者需要多聚化。
此外，光转换通常伴随着第一种颜色的丧失，这样不得不借助计算机方法来查 看整个群体。
概述：PRIME技术使用一种比GFP小 得多的蓝色荧光探针。与GFP不同的是， 新探针一开始并不与目的蛋白相连。它 是在后来通过一种全新的酶而附在蛋白 上。这种全新的酶被称为荧光基团连接 酶。
Monday, May 13, 2019
原 理 ：
原理：在导入目的 基因的同时也将编 码这种酶的基因导 入细胞。还在目的 基因上加上了一个 短的标签（13个 氨基酸），此标签 让连接酶识别蛋白
Monday, May 13, 2019
FHP（fluorescent highlighter proteins光激活蛋白即第二类荧光蛋白）
GPAC 及
（Green ＿photoactivatable ＿ Cherry光激活绿樱桃）
1，第二类荧光蛋白，FHP ①特点 这些荧光蛋白在适当的刺激下会经历结构的改变，从而打开荧光这个开关，或者荧
LOGO
荧光标记蛋白的发展
华中农业大学 工商管理0901 李佳佳
荧光标记蛋白技术实际上是也是一种标记技术。就如同最早用P标记脱氧核糖核 酸用S标记蛋白质是一样。
左图所示为验证 DNA和蛋白质谁 是遗传物质的实 验
Monday, May 13, 2019
可荧 作光 为标 报记 告蛋 基白 因在 ，生 提物 供研 细究 胞反 内面 物的 质作 的用 跟： 踪荧 定光 位标
Monday, May 13, 2019
2,GPAC 构成： 这是一个融合蛋白，它融合了红色荧光蛋白（RFP）单体Cherry和GFP的光激 活变异体。这种融合蛋白能够在表达标志物的细胞中持续发出红色荧光，而绿 色荧光只有在405-nm光激发下才会发出。 特点： ①表达GPAC的细胞在光激活前后都表现出强的红色信号，而绿色荧光只持续 数小时。 ②将某一特定蛋白放置在GPAC的N端或C端，均不影响其活性，也不会显著 影响胞内蛋白的定位或功能。即便融合伴侣需要大量的翻译后加工和修饰， GPAC仍可容忍。 不足：荧光标签相对较大，超过了50 kDa，这样，与GPAC融合的蛋白在用于 功能研究前就必须进行仔细的验证 其杰出性体现在：在时空动力学监测中突出了光转换的部分。
而GFP 是第一个例外, 它的27kDa 的单 体由238 个氨基酸构成, 本身就是一个
生物发光系统。其荧光机制是自身含有 的, 绿色荧光的发射仅需分子氧的存在, 而无需其他外源辅因子
②GFP 的表达无种属特异性。不管细胞 的种类和位置如何, 都能够自主表达; ③GFP 还能克服穿透、毒素、光漂白等 不利因素[1]。GFP 的荧光可以耐受福尔 马林的固定, 因而可以制成长期保存的 标本; ④对细胞内GFP 的检测非常简单, 用显
Monday, May 13, 2019
2，GFP发光原理 GFP控制光的部位是其自身的一部分， 仅由氨基酸构建而成，该部位含有一 段三个氨基酸组成的特殊序列：丝氨 酸－酪氨酸－甘氨酸（有时丝氨酸会 被相似的苏氨酸取代）。当蛋白质链 折叠时，这段短片段就被深埋在蛋白 质内部，然后，发生一系列化学反应： 甘氨酸与丝氨酸之间形成化学键，生 成一个新的闭合环，随后这个环会自 动脱水。最终，经过大约一个小时的 反应，周围环境中的的氧气攻击酪氨 酸的一个化学键，形成一个新的双键 并合成荧光发色团。
例如，要研究细胞内某蛋白质的 游走状态，则用荧光蛋白标记后， 其所处位置清晰可见。
Monday, May 13, 2019
技术变革
①最早为水母体中提取的GFP
②在适当刺激下会改变结构从而发出或改变荧光
的第二类荧光蛋白FHP及其典例GPAC
③最新的PRIME技术
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随后，目的蛋白质与 荧光基团蛋白质同时 产生
Monday, May 13, 2019
当7-香豆素这 种蓝色荧光探 针进入细胞后， 连接酶将它与 目的蛋白上的 短标签相连。 这便使融合荧 光蛋白发出可 见荧光
优点： ①使用这种方法后，标有荧光探针的肌动 蛋白能在细胞中自由游走，并穿过细胞核。 ②此方法能应用于细胞内特定区域的蛋白， 比如细胞核、细胞膜或细胞溶质。在连接 酶上加入一段信号肽，指导它到达特定区 域。之后，酶将荧光探针与此区域的蛋白 相连。
Monday, May 13, 2019
Fra Baidu bibliotek PRIME技术
开发此技术的原因：无论是GPAC 还是GFP，他们都有一个缺点，蛋 白过大。一旦荧光探针过大，它们 就有可能干扰蛋白的正常功能，或 妨碍它们到达目的地。 如：238个氨基酸的GFP干扰了一 些蛋白的功能，比如肌动蛋白actin。 此蛋白参与了细胞分裂、运动及通 讯。然而研究人员发现，与GFP的 融合对肌动蛋白的功能和运输有着 不利影响。
Monday, May 13, 2019