流感病毒神经氨酸酶的表达及其在药物筛选中的应用

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2009, 29 (5)
杨令芝 等 : 流感病毒神经氨酸酶的表达及其在药物筛选中的应用
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( Invitrogen ) ; CCK28 ( Dojindo, Japan ) ; 黑 色 96 孔 板 ( greiner cellstar) 。 1. 2 仪 器 超级酶标仪 ( Synergy HT, blo2tek, USA ) 1. 3 方 法 1. 3. 1 H5N1流感病毒神经氨酸酶的克隆与表达 重 组质粒的构建 :将 A /V iet Nam /1194 /2004 ( H5N1)毒株 神经氨酸酶的基因序列经过密码子优化 , 使其适合哺 乳动物细胞内高水平表达 [11 ] 。一种保持其原有氨基酸 序列不变 (奥司他韦敏感型 ) ,一种将 274 位的组氨酸 突变为酪氨酸 (奥司他韦耐药型 ) ,基因序列由人工合 成 ( TaKaRa) ,分别命名为 NA s和 NA r,通过 B am H I和 X ba l I酶切 ,酶切产物连接到用相同酶切的 pcDNA4 / TO 质粒中 ,连接产物转化到 TOP10 感受态细胞后 ,涂 布 Amp icillin抗性平板培养 14 ～18 小时 ,挑取单个菌 落 ,经过菌落 PCR 鉴定并抽取质粒酶切鉴定后 ,对克隆 的神经氨酸酶基因进行测序 ( TaKaRa) 。重组质粒鉴定 正确后进行表达鉴定并在 T2REx293 细胞中建立稳定 细胞株 。 稳 定 细 胞 株 的 建 立 : 采 用 lipofectam ine 2000 ( Invitrogen ) 将 重 组 质 粒 NA s 和 NA r 及 空 载 体 pcDNA4 / TO 分别转染到 T2REx293 细胞 , 48 h 后将细 胞按 1 ∶12 传代并加入 200 μg /m l Zeocin 进行克隆筛 选 。每 3天换液 ,维持相同浓度的 Zeocin,直至单个稳 定细胞克隆形成 ;然后挑取单克隆 ,扩大培养后用四环 素诱导表达并 W estern blotting鉴定 。阳性克隆扩大培 养冻存 ,或继续培养用于药物筛选 。细胞培养基为含 10%胎牛血清 ( Hyclone) , 100 μg /m l青霉素 , 100μg /m l 链霉素的高糖 DM EM 培养基 ( Hyclone) , 在 37℃, 5% CO2 条件下培养 。 神经氨酸酶的表达 : 100 mm 培养皿中接种稳定细 胞株 3 ×106 个细胞 ,经 1μg /m l四环素诱导 24h,用 1m l 上样缓冲液裂解 (不含还原剂 ) ,经 PAGE 电泳分离后 进行蛋白转印 ,转印膜用兔抗流感病毒神经氨酸酶的 多克隆抗体和 HRP标记的羊抗兔 IgG二抗进行免疫印 迹分析 。 1. 3. 2 H5N1流感病毒神经氨酸酶活性的鉴定 神经 氨酸酶活性鉴定 :将 3 ×106 个稳定细胞接种 100mm 培 养皿 , 24 h后加入 1 μg /m l四环素诱导 ,继续培养 24 ～ 36 h,收取细胞用 1m l含 0. 1% Triton2X100的 PBS裂解 细胞 。制备 H1N1流感病毒 (A /W S /33)鸡胚培养的尿 囊培养液 1 m l ( 0. 1% Triton2X100) 。用含 0. 1% Tr2′22 ( 422methylumbelliferyl ) 2α2D 2N 2 acetylneuram inic acid (MUNANA , Sigma) ; 22N 2吗啡林 2 乙磺酸 (MES , Sigma) ;天然产物 (海洋微生物发酵产 物 )及中药提取物由本院黄志伟研究员和陈小平研究 员提供 ;黄芩甙和黄芩素 (西安小草植物科技有限责任 公司 ) ; 兔 抗 流 感 病 毒 神 经 氨 酸 酶 的 多 克 隆 抗 体 ( p rosci) ; A /W S /33 和 A /V ictoria /3 /75病毒株 (本实验 室保存 ) ; T2REx293 cell line ( Invitrogen) ; pcDNA4 / TO 质 粒 ( Invitrogen ) ; TPCK2胰 蛋 白 酶 ( Sigma ) ; Zeocin
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中国生物工程杂志 China B iotechnology
Vol. 29 No. 5 2009
经氨酸酶的二聚体形式 (图 1a) 。 2. 2 稳定细胞株表达 H5N1 流感病毒神经氨酸酶的
活性鉴定 在研究中 , 1 个 100mm 培养皿的 NA s或 NA r稳定 细胞 (长满单层 , 约 7 ×106 个细胞 ) 经诱导后配制成 50m l酶液仍具有很好的酶活性 ,其 S /B (信号背景比 ) 分别为 47. 9和 34. 6,因此可用于神经氨酸酶抑制剂化 合物的筛选 。通过神经氨酸酶活性测定方法 ,测得 NA s 和 NA r的荧光强度均值分别为 10947 和 7901, 结合 W estern blot结果 (图 1a) ,利用 Quantity one分析 , NA s 和 NA r的表达量约为 1. 1∶1,表明 NA r可能由于 274位 的组氨酸突变为酪氨酸后 ,其酶活性比 NA s有所降低 。 图 1b 显示 NA s对奥司他韦敏感 , NA r对奥司他韦耐 药 。同时通过奥司他韦抑制实验 ,用 NA s和 NA r稳定 细胞制备 和 全 病 毒 制 备 的 酶 液 测 得 羧 酸 奥 司 他 韦 的 IC50值见表 1。
X100的 PBS将上述两种酶液按 5 倍梯度稀释 ,制备不 同浓度的神经氨酸酶液 ,不表达神经氨酸酶的细胞和 正常鸡胚尿囊液作为阴性对照 。参考 Su 等 [12 ]的神经 氨酸酶活性测定方法 ,取 30 μl酶液 ,加入反应底物 (终 浓 度 33 mmol /L M ES 缓 冲 液 , 4 mmol /L CaCl2 , 20 μmol /L 底物 MUNANA ) ,动力法在 360的激发光和 460 的发射光下测定荧光强度 。选取在 30m in内荧光强度 呈直线上升的稀释度作为药物筛选的酶液浓度 。 奥司他韦抑制活性的测定 : 将羧酸奥司他韦 ( GS 4071即奥司他韦的活性形式 )用水倍比稀释 ,取 10 μl; 加入合适稀释度的酶液 30 μl;加入 60 μl反应底物 ,室 温反应 15 m in, 加 入 终 止 液 150 μl ( 14 mmol /L 的 NaOH 溶液 ,含 83%的乙醇 ) ;混匀后在 360的激发光和 460的发射光下测定荧光强度 。以上反应均在黑色 96 孔板中进行 。 1. 3. 3 天然提取物及中药成分的筛选 用上述奥司 他韦抑制活性的测定方法 ,如果中药成分水溶性不好 , 可用 DMSO 溶解和倍比稀释 , 相应的对照也用 DMSO 稀释 。药物筛选时奥司他韦用作阳性对照 。 1. 3. 4 黄芩素 、黄芩甙抑制流感病毒噬斑实验 配制 含 0. 9%的琼脂 ,将 5. 4 ×1025 pfu每细胞的病毒接种到含 有单层 MDCK细胞的十二孔板中 ,感染 1h后 ,在单层细 胞上覆盖含不同浓度药物营养琼脂培养基 。 72 h 后细胞 用甲醛固定 15m in,结晶紫染色 20m in,观察噬斑。 1. 3. 5 中药成分抑制流感病毒复制的 IC50 按 2 × 104 个细胞 /孔将 MDCK细胞接种 96 孔板 ; 2 ×10 - 3 pfu 每细胞流感病毒 (A /W S /33 和 A /V ictoria /3 /75 ) 感染 液 : 0. 3% BSA , 1 μg /m l的 TPCK2胰蛋白酶 , 100μg /m l 青霉素 , 100 μg /m l链霉素的高糖 DMEM 培养基 ;待细 胞长满单层 ,加入含流感病毒的感染液 , 37℃, 5% CO2 条件下感染 3 h;去掉感染液并用 PBS洗细胞 2 次 ,加 入 100 μl含不同浓度化合物的病毒感染液 , 37℃, 5% CO2 条件下培养 ,观察细胞状态 ,待病毒感染孔 (不加 化合物 )的细胞完全死亡后用 CCK28测定细胞活力 。 1. 3. 6 数 据 分 析 数 据 用 GraphPad Prism Dermo 分析 。
H 5N 1 亚型禽 流 感 病 毒 虽 然 目 前 只 能 通 过 禽 类 传 染给人 ,但这种病毒一旦与人类流感病毒株发生基因 重组 ,就可能跨越种属界限 , 变成人传染人的流感病 毒 ,严重威胁人类的生命健康 [1～3 ] 。因此预防和控制禽 流感疫情的爆发是目前的首要任务 。 流感病毒神经氨酸酶 ( neuram inidase, NA ) 是流感 病毒表面的一种糖蛋白 ,由病毒 RNA 第六节段编码 , 具有糖苷外切酶活性 ,它可以裂解细胞表面流感病毒 受体末端的唾液酸残基 ,使子代病毒颗粒从感染细胞 膜上释放 ,促进流感病毒在呼吸道扩散 ,与病毒的宿主 嗜性及毒力有关 [4, 5 ] ,因此神经氨酸酶是抗流感药物研 发的重要靶标 。目前临床上使用的神经氨酸酶抑制剂 扎那米韦和奥司他韦在流感的预防和治疗中发挥了重 要作用 。但是扎那米韦和奥司他韦在临床上的使用有 一定的局限性 ,如扎那米韦的口服利用度低 ,体内分布 容积小 ,肾脏清除快 ,只能作为局部用药 ; 奥司他韦在 使用过程中 ,临床上出现了大量耐药病毒株 [6, 7 ] 。这使 得设计合成或从化合物库中筛选既对敏感株又对耐药 株有效的新型神经氨酸酶抑制剂成为当前研究的热点
摘要 A 型流感病毒 H5N1 神经氨酸酶奥司他韦敏感型及耐药突变型基因经优化后 ,克隆于 pcDNA4 / TO 表达载体 ,并转染 T2REx293建立稳定细胞株 ,经四环素诱导能特异表达神经氨酸酶 , 其活性被特异性抑制剂奥司他韦所抑制 。利用该稳定细胞株制备的神经氨酸酶 ,对 3000多种天 然产物和中药提取物进行了筛选 ,结果显示黄芩甙和黄芩素对奥司他韦敏感型神经氨酸酶和耐 药型神经氨酸酶具有相似的抑制作用 。该神经氨酸酶制备方法安全 、简便 、稳定 ,有利于建立神 经氨酸酶抑制剂的高通量筛选方法 。 关键词 流感病毒 神经氨酸酶 神经氨酸酶抑制剂 黄芩甙 黄芩素 中图分类号 Q786