无菌操作技术
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? 操作：
? 一般将与接种材料直接接触的部分，在酒精源自文库的外焰上 灼烧充分，一般达到尖端部分烧红为止，可有效杀菌。
? 适用范围：
? 主要适用于金属器械。
植物组织培养精品课程
3、过滤灭菌
分为：空气过滤灭菌、液体过滤灭菌。
植物组织培养精品课程
4、射线灭菌
?射线灭菌直接、容易，可杀死空气中的微生物。 ?适用范围：常用于培养室、接种室的空气紫外线
植物组织培养精品课程
一、组培灭菌方法
（一）物理灭菌
?
利用高温、射线
等杀菌或滤膜过滤除菌
等物理措施而实现无菌
目的。
? 1、高温湿热灭菌
? 条件：在0.105MPA 下，温度121℃下，保 持15-20分钟。
? 适用范围：培养基、无
菌水、接种工具、玻璃 器皿等均用高压蒸汽灭 菌。
植物组织培养精品课程
2、灼烧灭菌
叶片带油脂、蜡质、茸毛，可用毛笔蘸肥皂水刷洗；较大叶 片可剪成若干带叶脉的叶块，大小以能放入冲洗用容器 即可。
一般不用修整，直接冲洗消毒。
果实、种子、 一般不用修整，直接冲洗消毒。种子、胚或胚乳培养时，对 胚、胚乳 于种皮较硬的种子，可去除种皮或预先用低浓度的盐酸 浸泡或机械磨损。
植物组织培养精品课程
照射灭菌。
植物组织培养精品课程
（二）化学方法
主要应用于外植体、实验室的灭菌 一、实验室灭菌 二、外植体灭菌 1、灭菌剂的要求 （1）有良好的灭菌效果； （2）不损伤植物材料或轻微损伤； （3）容易被清洗或能自行分解。
植物组织培养精品课程
各种消毒剂的特点
消毒剂 次氯酸钙 次氯酸钠
H 2O 2 氯化汞
酒精
使用 浓度%
9～10
去除 难易
易
消毒 消毒时间 min 效果
5～30
很好
是否毒害 植物
低毒
2
易
5～30
很好
无
10～12 最易
5～15
好
无
0.1～1 较难
2～10
最好
剧毒
70～75 易
0.2～2
好
有
植物组织培养精品课程
项目3-2 外植体的选择与处理
技能目标：
? 能够准确识别植物器官，并正确选择外植体 . ? 外植体修整、预处理和消毒方式恰当、有效，操作规范、
山西林院
熟练。
植物组织培养精品课程
一、外植体的修整方法
外植体类型 根及地下部
器官
茎尖、茎段 叶片
花器
修整方法
剪除老根、烂根；切除损伤及污染严重部位；用软毛刷刷洗， 去除泥土、虫卵等附属物；幼根剪或切成 1至几厘米长的 根段
剪或切除枝条上的叶片、叶柄及刺、卷须等附属物；软质枝 条用软毛刷蘸肥皂水刷洗、硬质枝条用刀刮除枝条表面 的蜡质、油质、茸毛等；枝条剪成带 2～3个茎节的茎段， 长约4～5cm。
①流水冲洗后用肥皂、洗衣粉或吐温洗涤；② 70% 酒精浸泡数秒；③根据材 料老嫩和枝条的坚实程度，用 2～10% 的次氯酸钠溶液 (加或不加吐温－ 80) 浸泡10～15min ，或者用 0.1% ～0.2% 的升汞消毒 3～10min ；④无菌水漂洗 3～5次。
花药 胚及胚乳
果实及种 子
①70% 酒精浸泡数秒；②无菌水冲洗 2～3次；③饱和漂白粉滤液中浸泡 10min; ④无菌水漂洗 2～3次。
2. 外植体消毒
（1）以小组为单位，识别各种灭菌剂，并配制各种消毒液。 （2）根据不同的外植体类型，对外植体消毒处理，并比较不同灭菌剂
的灭菌效果。
植物组织培养精品课程
不同外植体的消毒方法
外植体
根及地下 部
茎尖、茎 段及 叶片
消毒方法
流水冲洗；②纯酒精漂洗；③用 0.1% ～0.2% 升汞液浸 5～10min 或2% 次氯酸 钠溶液浸泡 10～15min; ④无菌水漂洗 3～5次。
方法一：①成熟或未成熟的种子消毒后剥离出胚或胚乳。 方法二：①去除种皮后，用 4% ～8% 的次氯酸钠溶液浸泡 8～10min ；②无菌
水漂洗 3～5次。
①根据果实和种子清洁度，流水冲洗 10～20min 或更长时间；② 70% 酒精漂洗 几秒到几十秒钟 (取决于果实和种子的成熟度与果皮、种皮的厚薄 )；③果 实用2% 次氯酸钠溶液浸泡 10min 后，无菌水冲洗 2～3次；④种子用 10% 的 次氯酸钠溶液浸泡 20～30min ，或用0.1% 升汞溶液浸泡 5～15min 后，无菌 水漂洗 3～5次。
植物组织培养精品课程
项目3-3 无菌操作
技能要求
? 操作程序正确，接种用具摆放合理，操作规范、准 确、协调、迅速；
? 容器内的外植体布局合理；
植物组织培养精品课程
三、重瓣长寿花初代接种操作流程
1 接种室、 超净台灭菌、
清洗材料
接种室
2手及台面消毒 培养材料灭菌
3灼烧灭菌 接种工具
6瓶口火焰灭菌 封口
山西林院
项目三 无菌操作技术
植物组织培养精品课程
项目导入
项目名称：重瓣长寿花的初代接种 项目合作单位：山西林业职业技术学院园艺系
太原市金语华科贸有限公司
植物组织培养精品课程
重瓣长寿花
项目3-1 灭菌技术
? 问题： ? 如何区分有菌和无菌？无菌操作技术的主要
环节包括哪些？ ? 项目解析： 1 能准确区分有菌和无菌的概念。（理解） 2 重瓣长寿花外植体的选择和处理。（掌握） 3 实验室消毒。（掌握） 4 重瓣长寿花初代接种操作技术。（掌握）
5接种
4材料修剪
7标识
植物组织培养精品课程
培养室
8摆放培养瓶
重瓣长寿花初代接种操作流程图片
植物组织培养精品课程
重瓣长寿花初代接种操作流程图片
植物组织培养精品课程
重瓣长寿花初代接种操作流程图片
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项目展示
?重瓣长寿花初代接种的成活率 （每位同学接种外植体20 ～30 个）。
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? 一般将与接种材料直接接触的部分，在酒精源自文库的外焰上 灼烧充分，一般达到尖端部分烧红为止，可有效杀菌。
? 适用范围：
? 主要适用于金属器械。
植物组织培养精品课程
3、过滤灭菌
分为：空气过滤灭菌、液体过滤灭菌。
植物组织培养精品课程
4、射线灭菌
?射线灭菌直接、容易，可杀死空气中的微生物。 ?适用范围：常用于培养室、接种室的空气紫外线
植物组织培养精品课程
一、组培灭菌方法
（一）物理灭菌
?
利用高温、射线
等杀菌或滤膜过滤除菌
等物理措施而实现无菌
目的。
? 1、高温湿热灭菌
? 条件：在0.105MPA 下，温度121℃下，保 持15-20分钟。
? 适用范围：培养基、无
菌水、接种工具、玻璃 器皿等均用高压蒸汽灭 菌。
植物组织培养精品课程
2、灼烧灭菌
叶片带油脂、蜡质、茸毛，可用毛笔蘸肥皂水刷洗；较大叶 片可剪成若干带叶脉的叶块，大小以能放入冲洗用容器 即可。
一般不用修整，直接冲洗消毒。
果实、种子、 一般不用修整，直接冲洗消毒。种子、胚或胚乳培养时，对 胚、胚乳 于种皮较硬的种子，可去除种皮或预先用低浓度的盐酸 浸泡或机械磨损。
植物组织培养精品课程
照射灭菌。
植物组织培养精品课程
（二）化学方法
主要应用于外植体、实验室的灭菌 一、实验室灭菌 二、外植体灭菌 1、灭菌剂的要求 （1）有良好的灭菌效果； （2）不损伤植物材料或轻微损伤； （3）容易被清洗或能自行分解。
植物组织培养精品课程
各种消毒剂的特点
消毒剂 次氯酸钙 次氯酸钠
H 2O 2 氯化汞
酒精
使用 浓度%
9～10
去除 难易
易
消毒 消毒时间 min 效果
5～30
很好
是否毒害 植物
低毒
2
易
5～30
很好
无
10～12 最易
5～15
好
无
0.1～1 较难
2～10
最好
剧毒
70～75 易
0.2～2
好
有
植物组织培养精品课程
项目3-2 外植体的选择与处理
技能目标：
? 能够准确识别植物器官，并正确选择外植体 . ? 外植体修整、预处理和消毒方式恰当、有效，操作规范、
山西林院
熟练。
植物组织培养精品课程
一、外植体的修整方法
外植体类型 根及地下部
器官
茎尖、茎段 叶片
花器
修整方法
剪除老根、烂根；切除损伤及污染严重部位；用软毛刷刷洗， 去除泥土、虫卵等附属物；幼根剪或切成 1至几厘米长的 根段
剪或切除枝条上的叶片、叶柄及刺、卷须等附属物；软质枝 条用软毛刷蘸肥皂水刷洗、硬质枝条用刀刮除枝条表面 的蜡质、油质、茸毛等；枝条剪成带 2～3个茎节的茎段， 长约4～5cm。
①流水冲洗后用肥皂、洗衣粉或吐温洗涤；② 70% 酒精浸泡数秒；③根据材 料老嫩和枝条的坚实程度，用 2～10% 的次氯酸钠溶液 (加或不加吐温－ 80) 浸泡10～15min ，或者用 0.1% ～0.2% 的升汞消毒 3～10min ；④无菌水漂洗 3～5次。
花药 胚及胚乳
果实及种 子
①70% 酒精浸泡数秒；②无菌水冲洗 2～3次；③饱和漂白粉滤液中浸泡 10min; ④无菌水漂洗 2～3次。
2. 外植体消毒
（1）以小组为单位，识别各种灭菌剂，并配制各种消毒液。 （2）根据不同的外植体类型，对外植体消毒处理，并比较不同灭菌剂
的灭菌效果。
植物组织培养精品课程
不同外植体的消毒方法
外植体
根及地下 部
茎尖、茎 段及 叶片
消毒方法
流水冲洗；②纯酒精漂洗；③用 0.1% ～0.2% 升汞液浸 5～10min 或2% 次氯酸 钠溶液浸泡 10～15min; ④无菌水漂洗 3～5次。
方法一：①成熟或未成熟的种子消毒后剥离出胚或胚乳。 方法二：①去除种皮后，用 4% ～8% 的次氯酸钠溶液浸泡 8～10min ；②无菌
水漂洗 3～5次。
①根据果实和种子清洁度，流水冲洗 10～20min 或更长时间；② 70% 酒精漂洗 几秒到几十秒钟 (取决于果实和种子的成熟度与果皮、种皮的厚薄 )；③果 实用2% 次氯酸钠溶液浸泡 10min 后，无菌水冲洗 2～3次；④种子用 10% 的 次氯酸钠溶液浸泡 20～30min ，或用0.1% 升汞溶液浸泡 5～15min 后，无菌 水漂洗 3～5次。
植物组织培养精品课程
项目3-3 无菌操作
技能要求
? 操作程序正确，接种用具摆放合理，操作规范、准 确、协调、迅速；
? 容器内的外植体布局合理；
植物组织培养精品课程
三、重瓣长寿花初代接种操作流程
1 接种室、 超净台灭菌、
清洗材料
接种室
2手及台面消毒 培养材料灭菌
3灼烧灭菌 接种工具
6瓶口火焰灭菌 封口
山西林院
项目三 无菌操作技术
植物组织培养精品课程
项目导入
项目名称：重瓣长寿花的初代接种 项目合作单位：山西林业职业技术学院园艺系
太原市金语华科贸有限公司
植物组织培养精品课程
重瓣长寿花
项目3-1 灭菌技术
? 问题： ? 如何区分有菌和无菌？无菌操作技术的主要
环节包括哪些？ ? 项目解析： 1 能准确区分有菌和无菌的概念。（理解） 2 重瓣长寿花外植体的选择和处理。（掌握） 3 实验室消毒。（掌握） 4 重瓣长寿花初代接种操作技术。（掌握）
5接种
4材料修剪
7标识
植物组织培养精品课程
培养室
8摆放培养瓶
重瓣长寿花初代接种操作流程图片
植物组织培养精品课程
重瓣长寿花初代接种操作流程图片
植物组织培养精品课程
重瓣长寿花初代接种操作流程图片
植物组织培养精品课程
项目展示
?重瓣长寿花初代接种的成活率 （每位同学接种外植体20 ～30 个）。
植物组织培养精品课程