绿脓杆菌检验技术.ppt

操作步骤
检样前化妆品的处理 接样于营养肉汤增菌，37℃， 12h，140rpm培养 分离培养，挑取培养物接于十 六烷基三甲基溴化铵平 板， 37℃，18-24h
染色镜检
配十六烷基三甲基溴化铵培 养基（选择性培养基，大肠杆菌
不能生长，革兰氏阳性菌生长完 全受到抑制）
配绿脓菌素测定用培养基， 明胶培养基，硝酸盐蛋白胨 水培养基，普通琼脂斜面培 养基
(2)分区划线法。此法适用于含菌多的检测标本，如 粪便，喀痰、细菌固体培养物等。
①划线前的操作同平行划线法。先在平板的一端将标 本涂开并在平板的1/5～1/4面积上划密集的平行线， 接种环火焰灭菌。
②将平板转约70°角，待接种环冷却后，使接种环通 过已划线的1区5～7次，以后即不与1区接触作连续 密集划线，约占平板面积的1/4，接种环再通过火 焰灭菌。
为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环 靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀 死残留的细菌。
2．干燥：放空气中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于 火焰上部的热气层中烘烤，但切勿将涂膜烤焦。
3．固定：用染色夹子夹住涂片，在火焰的最热部分连续通 过三次，以固定之。此时杀死大部分细菌，并使标本固定 于玻片上，以免在染色或水洗过程中被冲掉。
细菌的分离培养
原理： 通过划线，将混杂的细菌在平板表面逐一分散，经培养 后，各自形成菌落(colony)。根据菌落形态、特征挑选 单个菌落，移种培养后，即得到纯种细菌。
方法： 平板划线法有几种，可根据不同情况选用其中一种。 (1)平行划线法 此法适用于含菌不多的液体标
本，如脑脊液(CSF)、腹水、分泌物、脓汁以及 稀薄的菌液等。 ①左手斜持平板底，右手持接种环。接种环在火焰 上灭菌，冷却后，沾取一接种环标本，先在平板 的一端涂开，并从此处开始向下划密集的平行线， 约占平板面积的一半。 ②将平板转180°角，从平板另一端开始也划密集 的平行线，直到划满平板的剩余部分。 将平板底放入盖内，接种环火焰灭菌后放下，将 平板倒置，37℃培养。
加热溶解 调pH 分装试管 高压 成高层 3.硝酸盐蛋白胨水培养基300ml
加热溶解 调pH 分装有小倒管的试管 直立制成高层 4.普通琼脂斜面培养基300ml
加热溶解 调pH 分装试管 高压 面
制成斜 直立制
高压 制成斜
注意事项
1. 培养基溶解时，加有琼脂的培养基易 沸，应注意看守。
2. 注意调节培养基的pH。 3. 称牛肉膏用玻片，称甘油用小烧杯。 4. 加热后应补足液量。 5. 注意做好标记。
③再转平板约70°，如上法在第3区划线，此后接种 环不再灭菌。
④重复上述操作在第4区划线，划满余下的培养基表 面。将平板底放入盖内，接种环灭菌后放下，置 37℃培养。
实验二 染色镜检及五项指标试 验
革兰氏染色方法
涂片→干燥→固定→染色→镜检
1．涂片：取一洁净的载玻片，用记号笔在载玻片做好标记， 并在载玻片中间滴一小滴生理..盐水，以无菌接种环挑取 少量菌体涂片，玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。
有气体（+） 无气体（-）
溶解成液状（+） 生长（+） 未溶解（-）
实验一 培养基的制备及细菌的 分离培养
实验目的
掌握培养基制备的原理和方法 掌握细菌的分离培养 了解灭菌方法
实验原理
不同的微生物生长繁殖都需要提供一定的营养条件， 在实验室中，微生物的营养是由培养基来提供的。培养基是 按照微生物生长繁殖所需要的营养物质，用人工方法配制而 成的营养基质。
4．染色：
①初染:将结晶紫染液加于涂膜上，1min。
②媒染:水洗后加芦戈氏碘液处理，1min。
③脱色：水洗后用95％乙醇脱色，并摇动玻片，直至流下 的液体无色为止，约需0.5min。
④复染：水洗后加石炭酸复红稀释液染色，1min。
⑤水洗，用滤纸吸干，待标本充分干燥后进行镜检。
5．镜检：
干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染 成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏 阴性菌（G-）。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过 于密集的细菌，常常呈假阳性。
除营养条件以外，微生物必须在最适酸碱度范围内才表 现出最大生命力，因此，应针对不同的微生物将培养基的pH 值调节到适当范围。
操作步骤
按培养基 配方称量
加水加
调节
热熔化 → pH值
分装 包装
灭菌 备用
操作步骤
1.绿脓菌素测定用培养基300ml 加热溶解 调pH 分装试管 高压
面 2.明胶培养基300ml
。
注意事项：
酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如脱色过度， 则革兰氏阳性菌可能被误染为革兰氏阴性菌，如脱色 不够，则革兰氏阴性菌可能被误染为革兰氏阳性菌， 所以脱色时间要很好掌握。脱色时间的长短还受涂片 厚薄的影响，一般涂片时取菌要少，涂片薄而均匀为 好。
被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因 会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的陈旧培养物也有 出现革兰氏阴性的几率，所以被检菌的菌龄一般最好 在18~24h之内。
革兰氏染色方法操 作步骤
盐生 水理
涂片
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接 种 环
自然干燥
固定
结草 晶酸 紫铵
干燥 镜检
复染 1min
复
95%
红
脱色
乙醇
0.5min
媒染 1min
操作步骤
氧化4酶2 ℃生长 试验 试验
绿脓菌素 试验
特征性检验
硝酸盐还原 产气试验
明胶液化 试验
取菌接+ 菌1滴 二甲基对
42 ℃ 24h 苯二胺
接菌，37 ℃ 24h +氯仿 移出+盐酸
接菌 37 ℃ 24h
接菌 37 ℃ 24h
紫红色（+） 紫红色（+） 不变不色生（长-）（-） 不变色（-）
化妆品中铜绿假单胞菌
（Pseudomonas aeruginosa）
的检测
目的：
1.了解化妆品中铜绿假单胞菌检测的基本过程。
2.掌握几种培养基的配置方法。
3.掌握铜绿假单胞菌的鉴定及生化特征。
原理：
铜绿假单胞菌为需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌， 有鞭毛，在普通培养基上生长良好，菌落大小不一， 平均直径2mm～3mm，扁平，边缘不整齐，且常呈相 互融合状态。氧化酶阳性，能产生绿脓菌素，此外 还能液化明胶，还原硝酸盐产生氮气，在42℃条件 下可以生长，可与类似菌区别。