分子生物学之转化技术

本方法需要的缓冲液和溶液
• 二甲基亚砜（） • 二甲基亚砜的氧化产物是转化的抑制物，为避免上述问题，
应购买高质量的。 • 转化缓冲液（见后面） • 用前置于冰上预冷至0 C。 • 培养基：，，。 • 专用设备： • 液氮 • 18 C 摇床。 • 42 C恒温水浴。
操作步骤
• 1.制备转化缓冲液（用前冰上预冷。）用超纯水（－Q过滤水）配制。
• 试剂
需要量／L
终浓度
• 2.4H2O
10.88g
55
• 2.2H2O
2.20g
15
•
18.65g
250
• (0.5M, 6.7)
20
10
• H2O
补至1L
• C. 用预先处理的滤膜（ 0.45 m孔径）过滤除菌，分成小份于－20 C 保存。
操作步骤（续）
• 2. 挑取一个经37 C 培养16－20h平面上的单菌落（2－3直径），接种至250 锥形瓶中的25 培养液或 培养液中，37 C 摇床（250－300）培养6－8h。
方法获得高转化效率的关键因素
• 1、使用高纯度的水和二甲基亚砜，实验过 程中尽可能使用新买的试剂和培养基。
• 2、细菌的生长状态。接种的细菌应用直接 取自冻存于-70℃的储备菌中直接培养获得。 而不能使用在实验室中连续传代或存放于4 ℃或室温的培养物。
• 3、试验中所使用的玻璃和塑料器皿应清洗 干净，并用超纯水充满，再经高温高压消 毒。
转化法
• 20世纪70年代晚期和80年代早期， 在冷泉港实 验室和哈佛大学做研究生的时候，他做出了以前 从未听说过的转化效率，并且以后他的方法被标 准化了, 称为转化法。
• 如果足够细心，用的方法可获得高达5X108的转 化效率。可事实上只有少数人能够重复出本人的 高转化效率。
• 由于该方法对操起技巧和细心程度要求较高，重 复性低，这里不做介绍。有兴趣的同学可参考分 子克隆上的步骤进行尝试。
2转化法获得高转化效率的关键
• 1、制备感受态所用的水最好用超纯水，尽可能使用新买的生化试剂配 制培养基、化学溶液和制备感受态。如果可能，最好用国外的原装试剂 来配制培养基和化学溶液。
• 2、本方法中的2应该用2·2H202应该用2·6H2O,这样可获得最佳的转化 结果。另外2和2最好都用国外产的试剂，以保证最佳转化效率。
• 2 200 （ 1%, 0.5%, 1%, 7.0）
• 370C 550=0.5
•,
• 5,000 10
• 100 (100 2/10 , 7.5)
•
5
• 4,000 10
• 100 (100 2/10 , 7.5)
• 20
• 4000 10
• 10 (8.5 1.5 )
• 200 , -700C
20 200 ( ) , 370C, .
培养基的配制
• 培养基的配制:
• 配制每升培养基,在950 去离子水中加入：
• 胰化蛋白胨（）20 g
• 酵母提取物
5g
•
0.5g
• 摇动容器使溶质完全溶解。加10 250 溶液（将1.86g 用100 去离子水溶解即 配成250 溶液）。用5 M 调值至7.0。用去离子水定容至1L。在15 （1.052）高 压下蒸汽灭菌20 . 该溶液在使用前，加入 5 灭菌的2 M 2 [2 M 2 溶液的配制方 法如下：用90去离子水溶解19 g 2, 用去离子水调整体积为100 ,在15 (1.052)高 压下蒸汽灭菌20 ]。
中快速冷冻感受态细胞。贮存于－70 C 备用。 • 用液氮冷冻可提高转化效率约5倍。一般分装成每份50 l感受态细胞足
够用了，但如果需要更大量的转化菌落（如构建文库），每一小份感受 态细胞的量可能需要加大些，如100－200 l 。 • 4、需要时，从－70 C冰箱中取出一管感受态细胞，把管握于手心， 融化细胞。细胞一经融化，立即把管转移至冰浴中，在冰上放置10 。 • 5、用一冷的无菌吸头把感受态细胞转移到冷却的无菌聚丙烯管中，放 置在冰浴上。（不用玻璃管是因为它们会降低转化效率约10倍。）
操作、设计与技能
转化技术(一)
1
细菌转化技术
2
酵母转化技术
细菌转化技术
• 一、化学转化法； • 2转化法、22转化法、方法、方法等；
• 二、物理转化法： • 电击转化法、基因枪转化法等；超声波转
化法、激光转化法等；
化学转化法概述
• 用简单的盐溶液（如2等）处理大肠杆菌细胞，使其细胞膜的通透性 发生了暂时性的改变,成为能允许外源分子进入的感受态细胞( )。这 种转化外源的方法称为化学法。现在大部分应用于细菌转化的化学方 法都基于和的实验结果，他们发现细菌用冰冷的2处理后，在37˚C或 42˚C加热能够被噬菌体转染。同样的方法随后也被应用于以质粒和大 肠杆菌染色体转化细菌。对于每微克超螺旋，这种简单而有效的方法 通常能产生105和106个大肠杆菌的转化克隆，这种转化效率对于很 多常规的工作如质粒转化或载体的构建已经足够了。然而当可能得到 的每一个克隆都相当重要时，例如，构建文库或只有很少的目的外源 可以利用时，较高的转化效率是必需的。通过对最初的2转化方法的 一系列改良，现在的化学转化方法由每微克超螺旋质粒通常可获得数 量为106-109的转化子，实验方法的改进使转化效率不再是分子克隆 中的一个限制因素而被取消了。化学转化法简便易行,不需要特殊的试 剂和仪器，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受 态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(可 保存半年而转化效率没有明显的下降),因此目前化学转化法是分子生 物学实验室使用最广泛的一种转化方法。
物理转化法
• 当大肠杆菌暴露在电荷中时，其细胞膜会不稳定而诱导形成暂时孔洞， 于是分子可由该孔进入细胞。这种电击的方法最初是用来诱导进入真 核细胞的，随后又被用于质粒转化大肠杆菌和其他细菌。这是转化细 菌的最简单、最快捷、最有效和重复性最好的方法。
• 通过优化各种参数包括电场的强度、电脉冲长度，的浓度和电击缓冲 液的组成能够获得每微克超过1010个转化子的转化效率。对于2.6-85 的质粒，其转化效率可达到每微克质粒获得6×10101×107个转化子。 这比通过化学方法制备的感受态细胞的最高转化效率高10-20倍以上。 如此高的转化效率对于构建大而高度复杂的文库尤为有用。电穿孔方 法适用于实验室普遍使用的大多数大肠杆菌菌株。
• 1. : • • 1M 2 12 • 1M , 7.5 1.2 • H2O 120 • • • 3. : • • 42.5 + 7.5
:Biblioteka Baidu
2. :
1M 2 15 1M , 7.5 1.5 H2O 150
50-100 1-5 , 30
420C 30 . 250 500 ( )
370C 45 1 225
• A. 0.5M (6.7)[哌嗪’-双(2-乙磺酸)]溶液的配制:将15.1g 溶于80超纯水中,用5 M 调值至 6.7，最后加纯水，定容至100。用预先处理的滤膜(0.45 m孔径)过滤除菌。分成小份于 －20 0C保存。
• B. 转化缓冲液的配制:将下列组分溶于800纯水中，然后加20 0.5 M 的 （6.7），加纯水定 容至1L。
• 培养基：
• 培养基除含有 20 葡萄糖外，其他成分与培养基相同。培养基经高压灭菌后冷至 60 C或60 C以下，加20除菌的1 M葡萄糖溶液（1M 葡萄糖溶液的配制 方法是： 用90 去离子水溶解18 g葡萄糖，完全溶解后， 用去离子水定容至 100 ，用0.22 m滤器过滤除菌）。
• 培养基极易染菌，所以配好后一定要分装成小份，每次取一份使用，其余放4°C 保存。
• 3、细菌的生长状态：由于未知的原因，最高的转化效率总是用直接取 自冻存于-70 C的储备液中直接培养获得的，因此，不应使用在实验 室中连续传代或存放于4 C或室温的培养物。
• 4、玻璃和塑料器皿的清洁。 微量的洗涤剂或其他化学物质会大幅度地 降低细胞转化效率，因此最好建立一批只用于制备感受态细胞而不用于 其他目的的玻璃容器，这些玻璃器皿应用手来刷洗，并且用纯水（－Q 水或相当的水）充满，再经高温高压消毒。水在玻璃器皿使用前应倒掉。
• 转化效率介于107－108左右，比传统的氯化钙法高10－100倍。类似 于分子克隆第三版上的2转化法，但有些区别。
• 2转化法优点：
• 重复性好，对操作技术要求不高，对纯度、试剂质量要求不高（但是熟 练而细心的操作、纯的样品和高质量的试剂仍然能获得最好的结果）；
• 2转化法缺点：
• 转化效率不高，一般仅用于载体构建，不用于建库。
转化
• 一定要做阳性和阴性对照。 • 1.将要转化的片段加入到装有感受态细胞的管中（50 l感受态细胞需要25）,体积不应超
过感受态细胞的5％，轻轻旋转几次混匀内容物。实验中至少设对照管：一个含有感受态 细胞和已知量的超螺旋质粒，另一管只有感受态细胞。混匀内容物，冰浴30。 • 2.将管放入预加温至42 C 的循环水浴中，恰恰放置90s,不要摇动。 • 热激是一个关键步骤，准确地达到热激温度非常重要。 • 3. 快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1－2. • 4. 每管加800 l 培养基（或），用水浴将培养基加温至37 C 的摇床上，温育45，使 细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。 • 为最大限度地提高转化率，复苏期中应温和地摇动细胞（<225）。 • 如果带有 互补，按以下方案进行。 • 5. 将适当体积 （每个 90 平板达200 l ）已转化的感受态细胞转移到含 20 4 和 相应抗 生素的培养基上。 • 玻璃涂棒要先在乙醇中浸泡，然后在酒精灯上灼烧，待它凉至室温后，才可将转化菌轻轻 地铺在琼脂板表面。 • 如检查氨苄青霉素抗性，用转化菌铺平板时密度应较低（每个90平板不超过104菌落）
方法制备超级感受态方法
• 用化学方法制备超级感受态的方法主要有：的方法和的方法。 • 采用的方法一般可以达到5 108个转化克隆／ g超螺旋质粒，而采用
的方法一般可以达到1 108 -3 108个转化克隆／ g超螺旋质粒。 • 与上一种制备超级感受态的的方法相比，方法的优点在于并不过分地讲
究细节，但是重复性更好。这一方法与其他方法有所不同的是细菌在18 0C进行培养而不是通常的37 0C。否则这个方法就没有什么特别之处。 没人知道为何在低温进行细菌培养会影响转化效率。也许是18 0C时合 成的菌膜成份和物理性状更有利于获取，也许是低温使有利于高效转化 的生长时相延长了。 • 在18 0C进行细菌培养并非易事，大多数实验室都没有这种摇床。将摇 床置于4 0C冷室，用温控器加温至18 0C是一个解决问题的方法。也可 使培养物的温度维持在20－23 0C，这样做并不会造成转化效率降低。 这一温度在很多实验室其实是室温。在这一温度范围，细菌生长得很慢， 倍增时间大约为2.5-4h。如此缓慢的生长可能会导致培养失败，尤其是 在晚间较迟的时侯，这时细菌的600 吸收值似乎永远不能达到理想的0.6。 解决这个问题的方法是晚上就进行培养，第二天一早收获细菌。
• 3. 晚上约6点，将上述初始培养物接种于三个盛有250 培养液的1L 锥形瓶中， 第一个加10,第二个加4,第三个加2,于18－22 C 中速摇床过夜。
• 4.次日早上,测量三瓶培养物的600值，每45测定一次。 • 5. 当有一瓶的培养物600＝0.55时，将培养瓶置于冰上10，弃去另两瓶培养物。 • 6. 于4 C 以 2500g(相当于 转头，3900)离心10 收集菌体。 • 7. 倒去培养液，将离心管倒扣在吸水纸上2 以吸干剩余液体，用一个真空吸引器
最经典、最可靠的化学转化法：2 法
• 2转化法的效率：
• 5 106 -2 107个转化克隆／ g超螺旋质粒。(转化效率的计算： 0.1标准质粒如18转化感受态细胞后，通常得到1转化液。涂布100 l 长出100个菌落，则转化效率为：100X10X104=107转化克隆／ g超 螺旋质粒)
• 改良的2转化法（个人方法）：
将贴附在管壁上的培养基吸干。 • 8. 加 80 预冷的转化缓冲液重悬细菌沉淀。轻轻旋转，不要用振荡器或吹吸。 • 9. 于4 C 2500g 离心10 收集菌体。 • 10. 倒去上层培养液， 将离心管倒扣在吸水纸上2 以吸干剩余液体，用一个真空
吸引器将附着在管壁上的培养基吸干。
冻存感受态细胞
• 1、用20 预冷的转化缓冲液轻轻重悬沉淀。 • 2、加1.5 。轻轻混匀细菌悬液，放置冰上10 。 • 3、迅速将悬液分装到冷却的无菌微量离心管中，封紧管口，没入液氮