第三章 分子生物学常用技术和基本原理
常用分子生物学技术的原理及其应用
分子生物学技术是生物学领域中的重要工具，广泛应用于基础研究、医学诊断、药物研发等领域。
以下是常用的分子生物学技术及其原理和应用：1. PCR技术：PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的方法，基本原理是通过DNA聚合酶酶在体外模拟DNA的复制过程，从而快速扩增目标DNA片段。
PCR技术在基因克隆、基因检测、DNA指纹分析等领域有着广泛的应用。
2. 基因克隆技术：基因克隆是将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA 中，构建重组DNA分子的过程。
通过基因克隆技术可以获得大量目的基因的DNA序列，用于研究基因功能、表达调控等方面。
3. 蛋白质表达与纯化技术：蛋白质表达技术是将外源基因导入宿主细胞中，使其表达目的蛋白质的过程。
通过蛋白质表达与纯化技术，可以获得大量纯净的蛋白质样品，用于研究蛋白质结构、功能等。
4. 基因编辑技术：基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等，可以实现对基因组特定区域的精准编辑。
基因编辑技术在疾病治疗、植物育种等领域有着巨大的潜力。
5. RNA干扰技术：RNA干扰是一种通过RNA介导的基因沉默机制，可使目标基因的mRNA水平下降，从而抑制基因表达。
RNA干扰技术在基因功能研究、疾病治疗等方面具有重要应用价值。
6. 蛋白质亲和纯化技术：蛋白质亲和纯化技术利用蛋白质与其结合物质之间的特异性相互作用，实现对目标蛋白质的选择性富集和纯化。
该技术在药物筛选、蛋白质相互作用研究等领域有着广泛应用。
7. 基因芯片技术：基因芯片是一种高通量的生物芯片技术，可同时检测上千个基因的表达水平。
基因芯片技术广泛应用于基因表达谱分析、疾病诊断、药物研发等领域。
8. 蛋白质组学技术：蛋白质组学技术主要包括蛋白质质谱分析、蛋白质组芯片等，用于研究蛋白质在生物体内的表达水平、翻译后修饰等。
蛋白质组学技术在疾病诊断、药物靶点鉴定等方面有着重要应用。
以上是常用的分子生物学技术及其原理和应用。
常用分子生物学技术的原理及其应用
常用分子生物学技术的原理及其应用概述分子生物学技术是现代生物学研究中应用广泛的一系列技术方法。
这些技术能够帮助科学家从分子水平上理解生物学系统的结构和功能，并促进相关研究的进展。
本文将介绍几种常用的分子生物学技术，并详细探讨它们的原理和应用。
1. 聚合酶链式反应（PCR）•原理：聚合酶链式反应（PCR）是一种体外合成DNA的方法，通过循环性反应使DNA的数量迅速扩增。
该技术主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA双链被加热使其解旋成两条单链。
在退火步骤中，引物与模板DNA序列互补碱基配对。
在延伸步骤中，热稳定DNA聚合酶将新的DNA链延伸。
•应用：PCR技术在生物学研究和临床诊断中有着广泛的应用。
它可以用于基因克隆、基因突变分析、DNA测序、DNA指纹鉴定等。
此外，PCR还常用于检测病原体、肿瘤标记物以及遗传性疾病的诊断。
2. 凝胶电泳•原理：凝胶电泳是一种分离DNA和蛋白质的常见方法。
该技术基于物质在电场中的迁移速度不同，利用电势差将分子分离开来。
DNA片段在凝胶中迁移速度与其大小有关，大片段迁移较慢，小片段迁移较快。
•应用：凝胶电泳广泛应用于DNA分析、蛋白质分析以及核酸杂交等实验中。
在分子生物学研究中，凝胶电泳可用于确认PCR扩增产物的大小，并进行DNA片段的分离和纯化。
此外，它还可以检测基因突变、遗传关系等。
3. 蛋白质电泳•原理：蛋白质电泳是一种分离和分析蛋白质的技术。
该技术基于蛋白质的大小、电荷和形状差异，利用电势差将蛋白质分离开来。
在电泳过程中，蛋白质样品被加载到聚丙烯酰胺凝胶中，并通过电场迁移。
•应用：蛋白质电泳在生物学研究和临床诊断中具有重要作用。
它可以用于鉴定蛋白质在细胞中的表达水平、研究蛋白质结构和功能以及检测特定蛋白质的存在与否。
此外，蛋白质电泳还用于分离和纯化重组蛋白质。
4. 核酸杂交•原理：核酸杂交是一种通过互补碱基配对而发生的分子相互作用。
通过标记的探针DNA或RNA与靶序列相互结合形成稳定的双链或三链结构，从而可进行检测和定位。
分子生物学的基本原理与方法
分子生物学的基本原理与方法分子生物学是研究生物分子结构、功能和相互作用的学科，是现代生物学的重要分支。
本文将介绍分子生物学的基本原理和常用的实验方法。
一、分子生物学的基本原理分子生物学的基本原理是基于遗传物质DNA的复制、转录和翻译过程。
DNA是生物体内的遗传物质，它携带了生物个体的遗传信息。
DNA的复制是指DNA分子通过自我复制过程，使得每个新合成的DNA分子与原始DNA分子具有相同的遗传信息。
转录是指DNA通过酶的作用，产生RNA分子的过程。
转录产生的RNA可以是信使RNA （mRNA）、转运RNA（tRNA）或核糖体RNA（rRNA），这些RNA 分子在翻译过程中发挥重要的作用。
翻译是指RNA分子通过核糖体的作用，将RNA上的密码子翻译成氨基酸序列，合成蛋白质。
分子生物学的基本原理还包括基因的表达调控机制。
基因表达是指基因通过转录和翻译过程产生蛋白质的过程。
在这个过程中，细胞内的信号分子会识别和结合到基因的启动子区域，调控基因的转录水平。
转录因子是一种可以结合到启动子区域的蛋白质，它们可以促进或抑制基因的转录过程。
此外，还有一些表观遗传学的机制，如DNA甲基化和组蛋白修饰等，也参与了基因的表达调控。
二、分子生物学的基本方法1. DNA提取：DNA提取是从生物体组织或细胞中分离纯化DNA的过程。
常用的DNA提取方法包括酚-氯仿法、盐析法和柱层析法等。
2. 聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种用于增加DNA片段数量的方法，它可以在体外通过模拟DNA复制过程，快速地合成大量特定DNA序列。
PCR可以应用于基因检测、DNA序列扩增和基因克隆等领域。
3. 凝胶电泳：凝胶电泳是分子生物学中常用的实验方法，可以将DNA、RNA或蛋白质根据其大小和电荷迁移率分离。
通过观察样品在凝胶上的迁移情况，可以判断目标分子的大小和纯度。
4. 蛋白质表达与纯化：蛋白质表达与纯化是分子生物学中用于获得特定蛋白质的方法。
常用分子生物学技术的原理及应用
常用分子生物学技术的原理及应用一、PCR技术1.PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种常用的分子生物学技术，主要用于扩增DNA片段。
2.PCR技术的原理是通过添加DNA模板、引物和DNA聚合酶，以及一系列特定的温度循环，迅速扩增目标DNA序列。
3.PCR技术的应用广泛，如基因克隆、基因突变分析、疾病诊断等。
二、蛋白质电泳技术1.蛋白质电泳技术是用于分离和定量蛋白质的常用方法。
2.蛋白质电泳技术包括SDS-PAGE和蛋白质西方印迹等。
3.SDS-PAGE是一种蛋白质分子量分析方法，通过凝胶电泳分离蛋白质。
4.蛋白质西方印迹则用于检测特定蛋白质的表达，并通过特异性抗体与该蛋白质结合，产生特定的信号。
三、原位杂交技术1.原位杂交技术是研究基因表达和基因组结构的重要工具。
2.原位杂交技术通过结合特异性探针和标记物，用于检测目标序列在组织或细胞中的分布。
3.原位杂交技术有多种类型，如荧光原位杂交（FISH）和非放射性原位杂交等。
4.原位杂交技术在遗传学研究、疾病诊断和生物学研究中得到广泛应用。
四、基因克隆技术1.基因克隆技术是将特定DNA片段插入到载体DNA中的技术。
2.基因克隆技术的关键步骤包括：DNA片段的切割、载体DNA的选择和连接、转化等。
3.基因克隆技术在基因工程、重组蛋白质的表达以及基因功能研究等方面具有重要应用。
五、DNA测序技术1.DNA测序技术是用于确定DNA序列的方法。
2.DNA测序技术包括Sanger测序和高通量测序等。
3.Sanger测序是一种经典的测序方法，逐个位置确定DNA序列。
4.高通量测序技术通过并行测序大量的DNA片段，实现快速高效的DNA测序，并被广泛应用于基因组学研究、药物研发等领域。
六、蛋白质质谱技术1.蛋白质质谱技术是分析蛋白质结构和功能的重要方法。
2.蛋白质质谱技术包括质谱仪的使用和蛋白质样品的制备等。
3.蛋白质质谱技术能够快速鉴定蛋白质样品中的蛋白质组分，并定量分析特定蛋白质的表达水平。
分子生物学的原理和实验技术
分子生物学自20世纪50年代以来经历 了飞速的发展，包括DNA双螺旋结构 的发现、基因工程的诞生、人类基因 组计划的完成等重大里程碑事件。
研究对象与内容
研究对象
分子生物学主要研究生物体内的 核酸（DNA和RNA）和蛋白质等 大分子物质。
研究内容
包括基因的结构与功能、基因表 达的调控、DNA复制与修复、 RNA的转录后加工与调控、蛋白 质的合成与功能等。
蛋白质定量与检测
利用BCA法、Bradford法等方法对蛋白质进行定量，并通过 Western blot等技术检测特定蛋白质的表达。
蛋白质相互作用研究
利用免疫共沉淀（Co-IP）、酵母双杂交等技术研究蛋白质之间的 相互作用。
细胞培养与转染技术
细胞培养
在人工环境下培养细胞，提供适 宜的营养物质和生长条件，维持
随着大数据时代的到来，生物信息学分析方法在分子生物学研究中的地位愈发重要。未 来需要发展更加高效、准确的算法和工具，以应对不断增长的数据分析需求。
THANKS
感谢观看
细胞的生长和增殖。
细胞转染
将外源DNA或RNA导入真核细 胞中，实现基因的表达或调控。 常用的转染方法包括脂质体转染
、电穿孔转染等。
细胞筛选与鉴定
利用选择性培养基、抗体筛选等 方法对转染后的细胞进行筛选和 鉴定，获得具有特定表型的细胞
株。
04
分子生物学在医学领域应用
基因诊断原理与方法
基因诊断原理
蛋白质合成与功能
转录与翻译
01
DNA中的遗传信息通过转录生成RNA，再经过翻译合成蛋白质
。
蛋白质的结构与功能
02
蛋白质的结构决定其功能，包括催化、运输、免疫等。
分子生物学 常用分子生物学技术的原理及应用
（三）基因突变
利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的 基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。
T G C
（四）DNA序列测定
将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工 作大为简化，也提高了测序的速度；
待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进 行序列测定，也可直接测定。
（五）基因突变分析
PCR与其他技术的结合可以大大提高基 因突变检测的敏感性 。
▪ 分子杂交： 不同来源的单链核苷酸链根据碱基互补原则形成
杂种双链的过程。
▪ 分子杂交的目的： 检测DNA和RNA
▪ 探针： 分子杂交中和待测核苷酸链碱基互补的被标记的
核苷酸链。
待测DNA或RNA
探针
碱基对间氢键
增色效应： DNA变性伴随260nm吸收值增高
减色效应： DNA复性伴随260nm吸收值降低
Taq
5’
Taq
5’
R
R
R Taq
R
Taq
R
l
R
3’
Extension Step
1. Strand Displacement
3’
5’
2. Cleavage
3’
5’ 3. Polymerization
3’
Complete
4. Detection
5’ 3’
PCR衍生技术
▪ 反向PCR ▪ 逆转录PCR ▪ 原位PCR ▪ 重组PCR ▪ 不对称PCR ▪ 多重PCR
酵母双杂交系统的建立基于对真核生物转录激 活因子结构与功能的认识
真核生物转录激活因子
DNA结合结构域 转录激活结构域
BD
AD
组件式：结构可互相分开 功能互相独立 空间较近时表现活性 中间序列对活性无影响
分子生物学
专题三分子生物学实验室的基本常用技术1 核酸的纯化分离提取的核酸样品，分为DNA和RNA，由于不同的实验要求，需用不同的方法进一步纯化，核酸纯化的主要目标是去除其中的蛋白、多酚、多糖、盐离子等杂质。
核酸纯化的方法很多，不同的方法对应于不同的研究目的。
超速离心、柱层桥、分子杂交、免疫沉淀、凝胶电泳等方法将在核酸分离、提取的有关专题中加以介绍。
在此仅介绍从核酸溶液中去除蛋白质的酚/氯仿抽提法。
这个方法的标准程序，是酚/氯仿(1:1)抽提一次，氯仿抽提一至二次，如果情况需要可再重复几次。
1.1 酚/氯仿抽提法的基本原理混合使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以增加去除蛋白杂质的效果。
因为酚虽可有效地变性蛋白质，但它不能完全抑制RNA酶(RNase)的活性，而且酚能溶解10％-15％的水，从而能溶解一部分核酸。
为了克服这两方面的局限，混合使用酚与氯仿，对于核酸提取，显得更加重要，同时氯仿还能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。
在氯仿中加入少许异戊醇的目的在于减少蛋白质变性操作过程中产生气泡。
最后用氯仿抽提处理，是为了去除核酸溶液中的痕量酚。
如果所提核酸的酶反应条件要求极严格，最可靠的方法是再用水饱和的乙醚抽提一次，以彻底去除核酸样品中的痕量酚与氯仿，然后在68℃水浴中放置10分钟，使痕量乙醚蒸发掉。
1.2 酚/氯仿抽提法的基本步骤如果DNA或RNA体积较小，一般于1.5ml的Eppendorf离心管中进行，若体积较大则于10-50ml 的离心管中进行。
应事先准确测量样品的体积。
1) 在每一样品中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）溶液。
2) 若DNA片段小于l0kb，可以振荡混合；若大于l0kb，则反复轻柔地转动离心管，形成乳状液。
切勿使用高速的振荡器。
3) 室温下，于10000×g以上（一般要10000-12000 rpm以上）离心l0分钟。
4) 吸取上层水相于一个新的离心管中。
分子生物学常用技术(简化版)
Northern blot
类似于 Southern 印迹杂交的方法，用于 RNA 检测
in situ hybridization
原位杂交：特定 mRNA 的组织细胞分布
FISH Fluorescence in situ hybridization (FISH)：特定基因的染色体定位
反 Northern 杂交与 DNA 芯片
DNA解旋解链
DNA的体内复制
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
5’
3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
GGAUCG
5’
AUCGCG
5’
引物酶
引物酶
RNA引物
RNA引物
DNA解旋解链
引物合成
DNA的体内复制
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
核酸：测序、印迹、杂交、体外扩增技术 蛋白质：电泳与印迹、组学技术、相互作用
基本技术：
基因工程技术 转基因生物与基因敲除技术
综合技术：
基因诊断 基因治疗
应用技术：
第一节：核酸分子杂交
Molecular hybridization: 利用已知核酸序列 (探针/probe) 检测与其互补的未知核酸序列 用途： 确认核酸序列间同源性 对特定核酸序列进行定量 自核酸混合体中辨认特定核酸序列
1.什么是耐热 DNA 聚合酶
早期 PCR 曾使用 DNA 聚合酶 I
在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶 延伸反应温度为 37℃，非特异性太多
目前常用 Taq DNA 聚合酶
纯化自嗜热水生菌 (Thermus aquaticus) 可耐受 95℃ 高温，最适反应温度为 72℃ 左右
分子生物学常用技术
分子生物学常用技术分子生物学是现代生物学研究的一个重要领域，通过对细胞分子结构和功能的研究，为生命科学的进一步发展提供了重要的思路和手段。
分子生物学常用技术是在研究这一领域中必不可少的工具，下面我将从不同角度介绍这些技术。
一、DNA 提取技术DNA 提取是分子生物学中的基本技术之一，通常用于从生物样品中提取纯净的 DNA。
提取后的 DNA 可以用于 PCR 扩增、基因测序、构建谱系树和基因克隆等研究。
常用的 DNA 提取方法包括：SDS 法、酚-氯仿法、纯物直提法、磁珠提取法等。
二、PCR 扩增技术PCR 扩增技术是一种高效、快速、精确的 DNA 复制技术，它可以将少量模板 DNA 扩增到数百万份，是分子生物学领域中最常用的技术之一。
PCR 扩增实验包括：反应体系的准备、扩增程序的设置、扩增产物的分离、测序和定量分析等步骤。
三、蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术是一种将蛋白质分离、纯化、鉴定和定量的常用技术。
常见的蛋白质电泳实验包括：SDS-PAGE，氨基酸序列鉴定，二维凝胶电泳（2-DE）等。
蛋白质电泳技术可用于研究生物体内蛋白质的分布、结构、功能和相互作用关系。
四、基因编辑技术基因编辑技术是一种新兴的分子生物学技术，可用于修改细胞或生物体的基因组序列。
最常用的基因编辑技术是 CRISPR-Cas9 技术，它基于靶向特定 DNA 序列的小RNA和 Cas9 蛋白的结合，从而在特定的位置切割 DNA 分子，实现基因组修饰。
基因编辑技术在农业、医药、生物研究等领域具有广泛的应用前景。
五、RNAi 技术RNAi 技术是一种利用 RNA 干扰（RNA interference）机制抑制基因表达的技术。
RNAi 技术可以通过向细胞中导入或合成RNA 分子，干扰靶向基因的 mRNA 转录和翻译，从而抑制靶向基因的表达。
使用 RNAi 技术可研究基因功能、探索新型药物和开发生物技术等领域。
六、基因测序技术基因测序技术是一种将 DNA 或 RNA 分子序列确定下来的技术。
分子生物学技术
分子生物学技术分子生物学技术作为一种广泛应用于现代医学和生物学领域的技术，发挥着重要的作用。
本文将从分子生物学技术的定义和基本原理开始，然后介绍常见的分子生物学技术及其应用，最后讨论其在医学和生物学研究中的前景和挑战。
分子生物学技术是一系列用于研究生物分子结构、功能和相互作用的实验技术的总称。
这些技术主要依赖于分子水平上的操作和分析，包括DNA、RNA和蛋白质等生物分子的提取、纯化、扩增、修饰和检测等。
分子生物学技术的基本原理是基于生物分子的特性进行实验设计和操作，从而实现对生物体内各种生物分子的分析和研究。
常见的分子生物学技术包括聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质电泳、核酸杂交、基因克隆、蛋白质互作研究和基因表达分析等。
聚合酶链式反应是一种用于扩增DNA片段的技术，广泛应用于基因检测、疾病诊断和DNA指纹鉴定等领域。
蛋白质电泳则用于研究蛋白质的大小、电荷和结构等特性，常用于蛋白质分离、纯化和表征。
核酸杂交是一种检测特定DNA或RNA序列的技术，用于寻找目标分子的存在和定位，由此发展出了原位杂交和北方、南方杂交等。
基因克隆技术可用于获取特定基因的大量复制，进而进行基因功能研究和蛋白质表达。
蛋白质互作研究则是通过分析蛋白质之间的相互作用关系，揭示细胞内生物分子网络的特点和功能。
基因表达分析是通过检测特定基因在细胞或组织中的表达水平，研究基因调控和生物过程。
分子生物学技术在医学和生物学研究中得到了广泛的应用。
在医学上，这些技术被应用于疾病的早期诊断、治疗和预防。
例如，通过检测患者的基因突变或基因表达水平变化，可以实现个体化的药物选择和治疗方案制定，提高治疗效果和降低不良反应风险。
此外，基因编辑技术也为治疗遗传性疾病和癌症等提供了新的途径。
在生物学研究中，分子生物学技术为科学家们提供了研究生物进化、基因功能和细胞信号传导等重要问题的工具。
通过分析生物分子之间的相互作用关系和调控机制，研究人员可以深入了解生命的本质和规律。
分子生物学基本技术
分子生物学基本技术包括核酸的纯化，体外合成、分子杂交、基因克隆、基因表达研究技术等第一节DNA的体外合成一、DNA的化学合成 （无要求）－亚磷酸三酯法DNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物，有时也用于人工合成基因和反义寡核苷酸。
目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的，大多数DNA合成仪是以固相亚磷酸三酯法为基础设计制造的合成的原理：核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。
每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。
合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。
（末端核苷酸的3′-OH与固相载体成共价键，5′-OH被二甲氧基三苯甲基(DMT)保护，下一个核苷酸的5′-OH亦被DMT保护，3′-OH上的磷酸基上氨基亚磷酸化合物活化。
碱基上的氨基用苯甲酸保护。
每延伸一个核苷酸需四步化学反应(1) 脱DMT游离出5′-OH 。
(2) 缩合（偶联反应）：新生成的5′-OH与下一个核苷活化的3′单体缩合成亚磷酸三酯使链增长(3) 盖帽（封端反应）：有少量(小于0.5%)未缩合的5′-OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。
(4) 氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷（磷酸三酯）。
上述步骤循环一次，核苷酸链向5′方向延伸一个核苷酸二、聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种体外特定核酸序列扩增技术。
一)PCR的基本原理双链DNA热变性成两条单链，降温使反应体系中的两个引物分别与两条DNA单链两侧的序列特异性复性，在合适的条件下，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，利用反应体系中的4种dNTP 合成其互补链(延伸)，在适宜的条件下，这种变性→复性→延伸的循环重复1次DNA的量可以增加1倍，30次循环后，DNA的量增加230倍。
常用分子生物学技术的原理及其应用
常用分子生物学技术的原理及其应用常用分子生物学技术是一系列用于分析和操作分子生物学层面的实验技术。
这些技术基于对核酸（DNA和RNA）和蛋白质的结构和功能的研究，以及对基因表达和调控机制的理解。
在本文中，我将介绍常用分子生物学技术的原理和应用。
1.聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种能够从极少量的DNA样本中扩增特定DNA序列的技术。
它基于DNA的两条链之间的互补配对，使用DNA聚合酶酶和引物来在离子和温度周期变化的条件下进行。
PCR技术广泛应用于分子生物学和生物医学研究中，包括基因克隆、基因突变分析、DNA指纹鉴定以及病原体的检测等。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA，RNA和蛋白质的常用技术。
其中，聚丙烯酰胺（或琼脂糖）是一种高分子量聚合物，能够形成孔隙凝胶。
在电场的作用下，DNA，RNA或蛋白质在凝胶中迁移，根据大小和电荷的差异进行分离。
凝胶电泳广泛用于DNA和RNA的分离和纯化，以及蛋白质的分析和鉴定。
3.DNA测序：DNA测序是确定DNA序列的技术。
它通过测量DNA片段中的碱基顺序来分析DNA的序列信息。
目前有多种DNA测序技术，包括链终止测序（Sanger测序）和高通量测序（如Illumina测序和Ion Torrent测序）。
DNA测序在基因组学、遗传学和基因诊断中起着重要的作用。
4.基因克隆技术：基因克隆是指将目标基因从其源DNA中扩增，并将其插入到载体DNA 中，然后转化到宿主细胞中。
利用基因工程技术，克隆的基因可以在宿主细胞中被表达。
这种技术被广泛应用于重组蛋白质的定制表达、转基因生物的制备以及基因治疗的研究中。
5. 蛋白质电泳和Western blot：蛋白质电泳是一种分离和分析蛋白质的技术。
与DNA电泳类似，蛋白质电泳通过在聚丙烯酰胺凝胶中迁移蛋白质来分离不同大小和电荷的蛋白质。
Western blot是一种检测目标蛋白质的特异性抗体的技术，通过将蛋白质转移到膜上，然后使用特异性抗体与目标蛋白质结合来检测和定量蛋白质。
分子生物学技术在医学诊断中的应用
分子生物学技术在医学诊断中的应用一、前言医学诊断是现代医学的基础工作之一，其准确度直接关系到医疗效果和患者的治疗前景。
分子生物学技术作为一种新兴的技术手段，其越来越广泛地应用于医学诊断中，不仅可以提高患者的治疗效果，还可以为医生提供更为精确的诊断依据。
本文将重点探讨分子生物学技术在医学诊断中的应用，包括常用的分子生物学技术及其在临床诊断中的应用。
二、PCR技术1. 基本原理PCR技术（聚合酶链反应）是一种体外DNA扩增技术，它可以通过不断反复的DNA扩增，从极少量的DNA样本中扩增出大量的DNA片段。
具体实现过程是：首先将DNA样本进行热变性，使其变为单链DNA，然后引入两个特异性引物，这两个引物分别与所需扩增的DNA序列的两端配对，使得扩增起点创建在所需扩增的序列的两端。
之后加入DNA聚合酶和dNTP等反应原料，进行连续放大反应，经过反复的热变性、退火和链延伸步骤，最终扩增出特定长度的DNA序列。
2. 应用于临床诊断PCR技术在医学诊断中有着广泛的应用，包括病原微生物检测、遗传病检测和肿瘤检测等方面。
以病原微生物检测为例，PCR技术可以从血液、体液等样本中检测到微生物的核酸序列，从而快速、准确地确定病菌的种类、数量和感染部位等信息，并为临床治疗提供依据。
三、蛋白质芯片技术1. 基本原理蛋白质芯片技术是一种高通量的蛋白质分析技术，它可以同时检测数千种蛋白质的表达水平，并快速确定差异表达的蛋白质。
其基本原理是在芯片上固定大量的蛋白质，并利用标记有荧光剂或发光剂的抗体与标本中的蛋白质发生特异性反应，通过荧光强度或发光幅度来判断蛋白质的表达水平。
2. 应用于临床诊断蛋白质芯片技术在临床诊断中主要应用于肿瘤标志物的检测、自身免疫性疾病的诊断和药物筛选等方面。
以肿瘤标志物检测为例，蛋白质芯片技术可以同时检测数千种肿瘤标志物的表达水平，快速筛选出潜在的肿瘤标志物，并为肿瘤的早期诊断和治疗提供重要的参考。
四、基因测序技术1. 基本原理基因测序技术是一种将DNA序列直接读取出来的技术，可以确定DNA序列上的每一个碱基，进而揭示生命的遗传密码。
常用分子生物学技术的原理及应用
常用分子生物学技术的原理及应用1.聚合酶链反应（PCR）：PCR是一种在体外快速合成特定DNA片段的技术。
它的原理是基于DNA的逐步复制。
PCR需要DNA模板、DNA聚合酶、引物和dNTPs等反应物。
通过多个循环的高温退火、DNA扩增和DNA合成过程，可以在短时间内扩增指定的DNA片段。
应用：PCR在许多领域得到广泛应用。
它可用于基因组学、遗传学、医学诊断、病毒学等领域。
例如，PCR可以用于检测基因突变、诊断遗传疾病、鉴定病原体等。
2.DNA测序：DNA测序是一种确定DNA序列的技术。
目前主要有Sanger测序和高通量测序两种方法。
（1）Sanger测序原理：Sanger测序是一种经典的测序方法，基于DNA的DDN反应。
它利用碱基的链终止效应，使DNA合成过程在产生溶胶碱基的情况下中断，从而得到不同长度的DNA片段。
通过电泳分离并测定不同长度的DNA片段，可以确定DNA序列。
（2）高通量测序原理：高通量测序技术，如Illumina测序、Ion Torrent测序和Pacific Biosciences测序等，通过以平行方式同时测序多个DNA片段，大大提高了测序效率和数据产量。
应用：DNA测序技术在基因组学、癌症研究、生物进化等方面具有广泛应用。
它可以用于发现新基因、研究遗传变异、揭示物种演化等。
3.基因克隆：基因克隆是将DNA片段插入载体（如质粒）中并转化到细胞中，从而实现特定基因的复制和表达。
基因克隆包括DNA片段的剪接、连接、转化和筛选等步骤。
应用：基因克隆技术是分子生物学研究的基础。
它可以用于制备重组蛋白、构建转基因植物和动物、研究基因功能等。
4.蛋白质表达：蛋白质表达是将基因转录为mRNA，再通过翻译作用合成蛋白质的过程。
蛋白质表达技术包括原核和真核表达系统。
（1）原核表达系统：原核表达系统常用的有大肠杆菌表达系统和酵母表达系统。
这些系统可以用于高效表达蛋白质，并且易于操作。
（2）真核表达系统：真核表达系统是利用真核细胞如CHO、HEK293等表达蛋白质。
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A +GATCT A TCTAG
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二、DNA连接酶和DNA分子的体外连接 1、DNA连接酶 : 1967年首先发现，能催化2 条DNA链之间形成磷酸二酯键。
根据来源分： ①大肠杆菌 ②T4噬菌体
视频
二、核转移技术
核转移技术
即 动 物 整 体 克隆 技术 ， 将动 物体 细胞 核 全 部 导 入 另 一个 体 的 去 胞 核的 受精卵 内，使之发育成个体，即克隆(clone)。 例：英国克隆羊多利
三、基因剔除技术
基因剔除技术
也称基因靶向(gene targeting)灭活， 有目的去除动物体内某种基因的技术。
分子克隆（DNA可隆、基因克隆、重组DNA）
一、质粒(plasmid)载体
1、基本特征： 2、类型：F、R、Col 3、命名：例 pBR322 4、 pBR322质粒载体的特点
第二节 分子克隆常用载体
二、噬菌体载体
1、一般特征：是一类细菌病毒的总称，结构 比质粒复杂，感染效率很高。 2、λ噬菌体：
探针种类： DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
基因组DNA探针 来源 克隆化的基因片 段 （1）制作方法 简便，易获得 （2）不易降解 （3）标记方法 优点 成熟
cDNA探针
RNA探针
寡核苷酸探 针 人工合成 （1）链短， 杂交时间短 （2）对单核 苷酸变化敏 感
RNA的逆转录 mRNA、病毒 RNA （1）不含内 含子 （2）杂交特 异性高 （1）杂交体稳定 （2）不存在互补 双链的竞争性结 合 （3）杂交特异性 高 （4）杂交后本底 低 （1）易降解 （2）标记方法较 复杂 （3）polyA影响 杂交特异性 基因表达，尤其 是转录水平
原位杂交 (in situ hybridization) 斑点印迹 (dot blotting) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip)
第四节 多聚酶链反应 (Polymerase chain reaction) PCR
Dr. Karry Mullis 1985年发明， 获1993年度诺贝尔化学奖。
DNA测序自动化
DNA自动测序结果
第六节 遗传修饰动物模型的建立 及应用
The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model
一、转基因技术
转基因技术
采 用基因 转 移 技术使 目 的基因 整 合 入受精 卵 细胞或 胚胎干 细胞 ，然后 将细胞导入 动物子 宫，使之发育成个体。 转基因——被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal) ——目的基因的受体动物
缺点：灵敏度低 特异性较差
核酸分子技术路线
核酸探针 标记、纯化 液相杂交 固相杂交 靶核酸 预处理 分离纯化 原位杂交 探针-靶反 应 杂交信 号检测 限制性酶切
纯化杂交体 放射性核 素检测 非放射性杂 化分子检测
（二）、印迹技术的类别及应用
1、DNA印迹技术 (Southern blotting)
1. 凝胶电泳分析 凝胶电泳可以帮助判断扩增产物 的大小及产量 2. 酶切分析 既能进行产物鉴定，又能进行基因分 型，还能进行变异性研究 3. 分子杂交分析 分子杂交是检测PCR产物特异性 的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效 方法 4. 测序分析 DNA测序是检测PCR产物特异性的最 可靠方法，不仅能进行基因分型，还能进行变异 性研究
G + GATCC G CCTAG
平端切口
粘端切口
同功异源酶
来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG BstⅠ GGATCC CCTAGG GATCC G + G CCTAG G GATCC + CCTAG G
同尾酶
有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割 DNA 后，产生相同的粘性末 端，称为 同尾酶。这两个相同的粘性末端称 为配伍未端(compatible end)。
2、DNA体外连接
三、其他工具酶 1、大肠杆菌DNA聚合酶 2、耐热DNA聚合酶（Taq酶） 3、逆转录酶 4、甲基化酶：将某些限制位点甲基化，使 DNA不再被某些限制酶切割，在制备重组 DNA时用于修饰目的DNA内部的一些限制位 点，保护目的DNA。
第二节 分子克隆常用载体
克隆(clone)
来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
三、其他载体
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
载体分类：
转染 transfection 用病毒或病毒DNA感染细胞。 转导 transduction 以噬菌体为媒介，转移遗传物质。 转化 transformation 以质粒将外源性DNA引入细胞的过程。
琼脂糖凝胶电泳
五、PCR的主要用途
（一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析
第 五 节 核 酸 序 列 分 析
Nucleic Acid Sequence Analysis
核酸序列分析的基本原理
DNA链的末端合成终止法 (sanger法)
（二）引物
⒈引物严格特异 ⒉引物之间没有互补性 ⒊引物内部避免形成二级结构 ⒋引物的长度合适、引物的浓度合适、引物 的质量好
（三） Taq酶
Taq DNA聚合酶具有以下特点： ①遵循碱基互补原则，按5‘→3’方向合成DNA新 链； ②有5’→3’外切酶的活性，但无3’→5’外切酶的活 性； ③具有逆转录酶活性，但该活性依赖Mg2+或 Mn2+； ④具有类似末端转移酶的活性，可以在新生链的 3‘端加接一个不依赖模板的核苷酸。
克隆化(cloning)
获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。
技术水平： ①分子克隆(molecular clone)，即DNA 克隆 ②细胞克隆 ③个体克隆（动物或植物）
DNA克隆
视频
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质 （同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人 工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能 力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转 化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子 细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子， 也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 分子克隆（DNA可隆、基因克隆、重组DNA等） 。
第三节 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization )
一、基本原理 在DNA复性过程中，如果把不同DNA 单链分子放在同一溶液中，或把DNA与 RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链 分子之间有一定的碱基配对关系，就可以 在不同的分子之间形成杂化双链 (heteroduplex) 。
（四）dNTP
dNTP是PCR的底物，其浓度、比例和质量 与反应效率和特异性密切相关： ①浓度过高可以加快反应速度，但也会导致 错配率升高；浓度过低虽然可以提高反应 的特异性，但会降低扩增效率 ②四种dNTP的摩尔浓度要相等 ③dNTP溶液通常小量分装置－20℃冰冻保存
（五）Mg2+
Mg2+可以影响解链温度、退火温度、扩增 效率、扩增特异性和引物二聚体的形成等 值得注意的是，Taq DNA聚合酶需要的是 游离的Mg2+ ，而PCR体系中的dNTP、引 物和模板的磷酸基都可以和Mg2+结合，从 而降低游离Mg2+的浓度。
基本原理
DNA加 热变性
DNA冷却 复性
DNA/RNA 杂交
变性
复性
RNA
DNA
二、核酸分子杂交的基本分类
DNA-DNA杂交 杂交 DNA-RNA杂交
杂交的基本分类
根据杂交介质的不同 液相杂交 固相杂交 原位杂交 基因芯片技术
三、核酸分子杂交与印迹技术
（一）、核酸探针
探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标 标记 其末端 或 全 链 的 已知 序列的 多聚 核 苷 酸，与 固 定 在 NC 膜上 的核 苷酸结 合，判断 是否有同源的核酸分子存在。
用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体 的分析。
2、RNA印迹技术 (Northern blotting)
用于RNA的定性定量分析。
3、蛋白质的印迹分析 (Western blotting)
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
三种印迹
② ②
① ③
分子杂交探针实验
放 射 自 显 影 照 片
（三）、其他
3、分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
4、 II 型限制酶的特点 Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG 切口 ：平端切口、粘端切口
HindⅡ
Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
5′ 5′
5′ 5′
5′ 5′
5′ 5′
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
PCR理论扩增效率
二、PCR体系基本组成成分
n n n n n n
模板DNA 特异性引物
耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
缓冲液
（一）模板