分子标记发展简史

分子标记发展简史

作者：周宇爝

来源：《现代农业科技》2009年第11期

摘要比较详细地介绍了分子标记的概念、理论基础和目前常用的分子标记的的发展过程和技术特点。

关键词分子标记;概念;基本原理;特点

中图分类号Q78文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)11-0264-07

随着人们对生命认识的不断加深以及遗传学的不断深入发展,越来越多的遗传标记被发现,遗传标记的种类和数量越来越多。主要分为4种类型,即形态标记、细胞学标记、生化标记和DNA分子标记。显然,前3种标记都是以基因表达的结果(表现型)为基础,是对基因的间接反映;而DNA分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映。与表型标记相比,DNA分子标记具有能对各发育时期的个体、各个组织、器官甚至细胞作检测,既不受环境的影响,也不受基因表达与否的限制,数量丰富,遗传稳定,对生物体的影响表现“中性”以及操作简便等特点。分子标记的所有这些特性,奠定了它具有广泛应用性的基础[1-2]。

1分子标记的来源及定义

1.1分子标记的来源

“标记”一词,根据汉语大词典的解释,是“便于识别的标识或者记号”。随着人们对生命本质认识的一步步加深,在人们研究DNA序列时发现了大量的非编码序列,甚至占到了全序列的90%以上。这些非编码序列具有特殊的一级结构,如串联重复、回文结构、Alu序列(反向重复序列)、CpG岛等,并且全基因组分布[3]。随着人类基因组计划的人类基因组框架草图的完成和一个个模式生物的全基因组测序,一个个新的DNA特异序列被发现并且在染色体上定位,整个基因组内的标记密度越来越高,并且大量的特异序列与不同的基因片段有着不同程度的连锁,所有这些标记构成了人类研究探索各种生物基因组DNA的地图与路标。

1.2分子标记的定义

广义的分子标记指可遗传并可检测的DNA序列或者蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶(不同基因位点编码的酶的不同分子形式)及等位酶(同一基因位点上不同的等位基因编码的酶的不同形式)。狭义的分子标记仅仅指DNA标记,一般所称的分子标记即被界定在此范围之内[4]。这是因为在应用上DNA标记比蛋白质标记广泛的多。蛋白质的结构比DNA的结构复杂的多。构成蛋白质的氨基酸有几十种,而构成DNA的碱基只有4种,通过指数级的排列方式仅是其一级结构的可能性就有数量级上的差异,且不计蛋白质更加复杂的二级、三级、四级结构及其结构域。并且到目前为止,蛋白质的复制与合成远不及DNA复制技术成熟,可控性也不高。因此,蛋白质标记应用远不如DNA标记方便和广泛。但从更严格的意义上讲,蛋白质标记是研究生命现象更为精确的标记,因为其更稳定、多态性更高,每种蛋白质都是唯一的(序列唯一、构象唯一)。

1.3理想的分子标记

理想的分子标记必须达到以下要求:①具有高多态性;②共显性遗传,即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型;③能明确辨别等位基因;④遍布整个基因组;⑤除特殊位点的标记外,要求分子标记均匀分布于整个基因组;⑥选择中性(即无基因多效性);⑦检测手段简单、快速(如实验程序易自动化);⑧开发成本和使用成本尽量低廉;⑨在实验室内和实验空间重复性好(便于数据交换)[5]。

特别需要提出的是,所有的分子标记都必须满足和某个基因或者已知标记紧密连锁(连锁程度越高越好)甚至共分离。

但是,目前发现的任何一种分子标记均无法同时满足以上所有要求。使用者可以根据自己的实验目的和要求具体选用某种标记技术。

2目前常用分子标记的基本原理

2.1限制性片断长度多态性(RFLP)

限制性片断长度多态性(Restriction Fragment Length Pol-ymorphism)是指用限制性内切酶处理不同生物个体的DNA所产生的分子片断大小的差异。此技术基于生物个体的基因组的变异,是研究不同基因组间的差异的技术,由Grod-zicker于1974年首先提出。其基本原理是:物种经过长期的进化,各个种属甚至品种之间的同源DNA序列上的限制性内切酶识别位点不同,或者由于突变、重组等原因引起限制性内切酶位点上的核苷酸的变化。若引起DNA分子某一特定内切酶识别位点序列内发生变化,这样该位点就不能被切开,使得DNA片段比亲本长;若突变后形

成新的酶切位点,则酶切后的片断变短。这样,通过电泳可以将大小不同的片断区分开来。对于分子量较小的质粒DNA就可直接观察到DNA长度的差异,但对于核DNA而言,DNA片断呈连续分布,无法辨别差异,需通过Southern杂交转移至支持膜上,用单拷贝或低拷贝的DNA克隆作为探针与膜上的酶切片断杂交,通过放射自显影或非同位素显色技术,发生变异的材料显示的带就可能与亲本的带处于不同位置。检测出与此标记DNA相关的片段构建出多态性图谱,即为RFLP[5,6]。这种特定的限制性片断与DNA探针的组合,便可以作为遗传标记。由于RFLP起源于DNA的变异,不受显隐性关系、环境条件和发育阶段的影响,具有遗传的专一性和稳定性的特点,在数量上不受限制,可随机选取足够数量能代表整个基因组的RFLP标记,而且每个标记变异大,检测方便。用于检测RFLP的克隆探针可随机选取,可以是使核糖体DNA、叶绿体DNA,也可以是总DNA。这样就可以获得能够反映遗传差异的大量多态性,为进行资源分析、品种鉴定、物种进化、基因定位、亲缘关系和遗传距离的分析,遗传图谱的构建提供了有力的工具。并且RFLP是共显性标记,能够区别出杂合体与纯合体[7]。虽然RFLP具有结果稳定可靠,重复性好,特别适合建立连锁图等优点,但也具有检验步骤多、周期长、成本高等缺点。并且RFLP 对DNA多态性检出的灵敏性不高,RFLP连锁图谱上还有很大的空间区(gap),甚至在使用同位素时可能对人有一定的伤害等等,这些都是需要进一步完善的地方。

2.2随机扩增多态性DNA(RAPD)

随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphi-sms DNA)是美国杜邦公司的Williams 和加利福尼亚生物研究所的Welsh等领导的2个小组于20世纪90年代同时开发出来的一种新的DNA指纹技术。此技术是应用一系列随机引物扩增并寻找多态性DNA片段的遗传标记技术。这一技术建立于PCR反应基础之上,以随机的短脱氧核苷酸(通常为10个碱基)作为PCR引物,对基因组DNA进行扩增而产生多态的DNA图谱。扩增产生的片段可通过琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分开,经溴化乙锭染色或银染色得到多态性的DNA图谱后进行多态性观察。在基因组上,每个引物可以连续直接扩增特定的DNA片段,对一个特定的基因型来讲,这些扩增的片段或片段的类型是唯一的。它的应用是基于这样的一个理论:对于同一模板DNA,用同一引物扩增既可能得到相同的带谱(模板基因组间可能具有同源性),也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带即可作为该模板的分子标记[8,9]。事实上,不同基因组DNA总是有一定差异的,所以用RAPD即可进行分子标记研究。理论上讲,在一定的扩增条件下,扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物,复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。

RAPD所用的一系列引物的DNA序列虽然各不相同,但对于某一特定引物来说,它同基因组DNA序列有特定的互补区域。这些特定区域在基因组的分布如果符合PCR扩增的反应条件的话,即引物在模板上的2条链如果有互补位置并且与引物的3′端在200bp以内,就可以扩增出这一片段。如果基因组在这些区域内发生插入、缺失或者替换即可导致这些特定的结合位置分布发生变化而使PCR产物发生增加、缺失或者分子量发生改变,通过对PCR产物的检测,即可找