分子标记技术

分子标记技术摘要：分子标记技术就是利用现代分子生物学基础分析DNA分子特性，并借助一些统计工具，将不同物种或同一物种的不同类群区分开来，或者将生物体的某些性状与DNA分子特性建立起来的关联关系，已广泛应用于植物遗传与育种研究的众多领域，包括遗传图谱的构建、遗传多样性分析、物种起源与进化、品种资源与纯度鉴定、分子辅助育种等多个方面，具有重大作用。

关键词：分子标记技术原理RFLP RAPD SSR AFLP EST SNP TRAP 分子标记技术应用引言分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。

与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。

随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。

一．常用分子标记原理分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR 技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA 或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。

理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。

目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。

其特点比较见表一。

1．限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA 分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。

其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制性片段长度多态性。

进行 RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。

目前RFLP的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因型和杂合基因型，F2表现出1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠，重复性好。

其缺点是：①操作繁琐，费时；②酶切后的DNA质量要求高；③使用放射性同位素进行分子杂交，有危险性等。

2．随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 20世纪80年代，基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。

1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。

其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物，以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。

随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。

用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA 的多态性。

与RFLP相比，RAPD方便易行，DNA用量少，设备要求简单，不需DNA 探针，设计引物也不需要预先进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构；合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，并且不需使用同位素，安全性好。

但因为引物较短导致退火温度较低，易产生错配，故实验的稳定性和重复性差，且为显性标记，不能区分纯合子和杂合子。

RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感，这会限制其应用。

将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制，即设计更长的引物。

1993年，Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region，SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。

SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序，设计一对互补于原来RAPD片段两端序列的24聚体的引物，扩增原来模板DNA，产生SCAR-DNA片段。

相对于 RAPD，SCAR由于使用更长的引物和更高的退火温度而具有更高的可靠性和可重复性，对反应条件不敏感，且可以将显性RAPD标记转变为共显性的SCAR标记，从而提高遗传作图效率。

此外，还有任意引物PCR标记(Arbitary primer，AP-PCR)技术和 DNA扩增指纹(DNA Amplified fingerprinting，DAF）技术，前者使用20或30bp的任意引物随机扩增基因组DNA，后者用5或8bp的任意引物随机扩增基因组DNA。

这些技术彼此相似，都能提供DNA的多态性信息，用于遗传图谱构建或基因定位等。

当然RAPD标记技术使用最广泛。

3．简单重复序列标记 (Simple Sequence Repeat，SSR)1982年，Hamade等人发现了简单重复序列标记(SSR)技术，或称微卫星序列标记(Microsatellite sequence，MS)，或短串联重复标记( Short Tandem Repeat，STR)。

真核生物基因组中存在大量重复频率极高而顺序复杂性极低的串联重复序列[5]。

按重复基序的长度可将串联重复序列分为卫星DNA（基序100-300bp）、小卫星DNA（基序10-60bp）、微卫星DNA（基序1-6bp）。

和中卫星DNA（由不同大小串联重复组成）等。

微卫星是由DNA复制或修复过程中DNA滑动和错配或者有丝分裂、减数分裂期姐妹染色单体不均等交换引起的。

微卫星的突变率在不同物种、同一物种的不同位点或同一位点的不同等位基因间存在很大差异。

尽管微卫星 DNA分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，根据这两端的序列设计一对特异引物，通过PCR技术将期间的核心微卫星DNA 序列扩增出来，利用电泳分析技术就可以得到其长度的多态性，此即 SSR标记的原理。

SSR 标记具有高度重复性、丰富的多态性、共显性、高度可靠性等优点，但由于其需要对所研究物种的一系列微卫星位点进行克隆和测序分析，以便设计相应的引物，这是非常费时、费力和代价昂贵的工作，没有足够的投资、人力和时间，是不可能实现的，因而给它的利用带来了一定困难。

简单重复序列间区标记(Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR)可以克服以上提到的 SSR标记的缺点，或称锚定简单重复序列标记(Anchored Simple Sequence Repeat，ASSR) 。

在SSR序列的3’端或5’端加上一个2-4bp的随机核苷酸，形成微卫星DNA的锚定引物，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行扩增。

所扩增的inter SSR区域的多个条带通过电泳可分辨，呈现出扩增带的多态性。

该方法不需知道DNA序列即可用锚定引物扩增。

4．扩增片段长度多态性标记(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP) 1993年，荷兰科学家Zbaeau和Vos发现了一种检测DNA多态性的新方法，即扩增片段长度多态性标记(AFLP) 。

AFLP是RFLP与PCR相结合的产物，其原理是先用两种限制性内切酶(低频剪切酶和高频剪切酶，前者识别为点为6bp，后者为4bp)双酶切基因组DNA产生不同大小的DNA片段，酶切产物玉双链人工接头连接，作为扩增反应的模板DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加 1-3bp选择性核苷酸作引物对模板DNA 再进行选择性扩增，电泳分离获得的DNA扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。

引物由三部分组成：与人工接头互补的核心碱基序列、限制性内切酶识别位点序列、引物3’端的选择碱基序列(1-10bp)。

接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列为结合位点。

该技术的独特之处在于所用的专用引物在不知道DNA 信息的前提下就可对酶切片段进行PCR扩增。

AFLP结合了 RFLP和RAPD两种技术的优势，具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。

但它的技术费用昂贵，对DNA的纯度和内切酶的质量要求很高。

尽管 AFLP技术诞生时间较短，但可称之为分子标记技术的又一次重大突破，被认为是目前一种十分理想、有效的分子标记。

5．表达序列标签标记（Expressed Sequence Tag，EST）1991年，Adams等人用EST对表达序列进行了研究，他们从人脑cDNA文库中随机挑取600个克隆，测序合成EST，从而发现了一系列在脑部表达的新基因并由此建立了表达序列标签标记(EST)技术。

其原理是将mRNA反转录成cDNA并克隆到载体构建成cDNA文库后，大规模随机挑取cDNA克隆，对其3’端或5’端进行序列，得到的序列与数据库中已知序列比对，从而获得对生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等生命过程的认识。

EST即是通过从cDNA文库中随机挑取的克隆进行测序后所得的部分cDNA的3’端或5’端序列，一般长为300-500bp。

每一个EST代表一个表达基因的部分转录片段。

EST 标记分为两类：一是以分子杂交为基础，用EST本身作为探针和经过酶切后的基因组DNA杂交而产生；二是以PCR为基础，按照EST的序列设计引物对植物基因组特殊区域进行PCR扩增而产生。