分子标记技术
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第七章
现代分子生物学技术
（3）
• 第一节 聚合酶链式反应 • 第二节 物理图谱的构建 第三节 基因组测序技术 第四节 分子标记技术 • 第五节 基因表达研究技术 第六节 DNA-蛋白质相互作用 研究技术
第三节
分子标记技术
一、遗传图谱(genetic map)
• 遗传图谱(genetic map)又称遗传连锁图 谱或连锁图谱(linkage map)。经典遗传 学时代的遗传连锁图谱主要是以家系分 析或不同性状个体间杂交为基础，根据 同源染色体上 等位基因的变化，通过计 算重组率，确定染色体上基因座位的顺 序和距离，构建基因的连锁图谱。
第二类是以聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction ,简称PCR反应）为核心的分子标记技术，包 括： ★ ★随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism DNA, 简称RAPD标记）； ★ ★简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称 SSR标记）或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记）； ★ ★扩展片段长度多态性标记（Amplified fragment length polymorphism, 简称AFLP标记）； ★ ★序标位（Sequence tagged sites, 简称STS标记）； ★ ★序列特征化扩增区域（Sequence charactered amplified region, 简称SCAR标记）等；
第三类是一些新型的分子标记，如： ★ ★单核苷酸多态性（Single nuleotide polymorphism, 简称SNP标记）； ★ ★表达序列标签（Expressed sequences tags, 简称EST标记）等。
四、分子标记的特点
（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组 织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境 限制，不存在表达与否等问题； （2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎 无限； （3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人 为创造； （4）表现为中性，不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体 和杂合体。
EcoRⅠ酶切示意图
• 5’ AG----GAATTC---GAATTC----GAATTC---CG 3’ 3’ TC----CTTAAG---CTTAAG----CTTAAG---GC 5’ • AG----G AATTC---G AATTC----G AATTC---CG TC----CTTAA G---CTTAA G----CTTAA G---GC 5’ AG----GAATTC---GAATCC----GAATTC---CG 3’ 3’ TC----CTTAAG---CTTAGG----CTTAAG---GC 5’ • AG----G AATTC---GAATCC----G AATTC---CG TC----CTTAA G---CTTAGG----CTTAA G---CG
三、分子标记的种类
分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大 致可分为三大类。 第一类是以分子杂交为核心的分子标记技 术，包括： ★限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP标 记）； ★ DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）； ★原位杂交（in situ hybridization）等；
二、分子标记的概念
• 广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的 并可检测的DNA序列或蛋白质。 • 蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个 以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶 （指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不 同分子形式）。 • 狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定 现在被广泛采纳： 能反映生物个体或种群间基因组中某种差异 特征wk.baidu.comDNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。
现代遗传图谱
• 70年代发展起来的DNA重组技术、DNA克隆技术和DNA 探针技术无疑为拓展遗传图谱的构建途径创造了技术 条件，也使人类基因定位的方法从细胞及染色体水平 过渡到分子水平。 • DNA水平的多态性标记位点作为绘制现代遗传图谱的 主要界标，大大提高图谱的 精确度、准确性。遗传 图谱的绘制也因此进入了一个崭新的时代。 • 现代遗传图谱的概念是由Botstein D等(1980)首先提 出的，在此基础上，限制性片段长 度多态性RFLP作 为遗传图谱的第一代崭新标记得以问世 。遗传图谱 的第二代标记位点是大量的可变数量串联重复 （VNTR)，包括微、小卫星(MS)或短串联重复(STR 或 SSLP)。第三代标记是位点极其丰富的单核苷 酸多态 性(SNP)。
经典遗传图谱
• 人们把单倍体配子所有染色体上的全部基因称 为一个基 因组。基因组内每条染色体上的连 锁基因称为一个连锁群。绘制遗传图谱就是要 进行每条染 色体上基因座位的顺序和距离的 确定，即主要通过家系分析，对不同性状之间、 性状与标 记之间、标记与标记之间的连锁遗 传频率进行计算，最终绘制遗传连锁图。 • 人类遗传图谱包括女性一种配子的23条染色体 (记作23，X)和男性两种配子的23条染色体 (23 ，X)、(23，Y)上的所有基因位点。
五、几种常用的分子标记
（一）限制性片段长度多态性标记 （Restriction fragment length polymorphism, RFLP）
该技术由Grodzicker等于1974年创立。 特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内 切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片 段，或称限制性等位片段。RFLP标记技术的基本 原理就是通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡 是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产 生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插 入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可 导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP。
现代分子生物学技术
（3）
• 第一节 聚合酶链式反应 • 第二节 物理图谱的构建 第三节 基因组测序技术 第四节 分子标记技术 • 第五节 基因表达研究技术 第六节 DNA-蛋白质相互作用 研究技术
第三节
分子标记技术
一、遗传图谱(genetic map)
• 遗传图谱(genetic map)又称遗传连锁图 谱或连锁图谱(linkage map)。经典遗传 学时代的遗传连锁图谱主要是以家系分 析或不同性状个体间杂交为基础，根据 同源染色体上 等位基因的变化，通过计 算重组率，确定染色体上基因座位的顺 序和距离，构建基因的连锁图谱。
第二类是以聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction ,简称PCR反应）为核心的分子标记技术，包 括： ★ ★随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism DNA, 简称RAPD标记）； ★ ★简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称 SSR标记）或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记）； ★ ★扩展片段长度多态性标记（Amplified fragment length polymorphism, 简称AFLP标记）； ★ ★序标位（Sequence tagged sites, 简称STS标记）； ★ ★序列特征化扩增区域（Sequence charactered amplified region, 简称SCAR标记）等；
第三类是一些新型的分子标记，如： ★ ★单核苷酸多态性（Single nuleotide polymorphism, 简称SNP标记）； ★ ★表达序列标签（Expressed sequences tags, 简称EST标记）等。
四、分子标记的特点
（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组 织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境 限制，不存在表达与否等问题； （2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎 无限； （3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人 为创造； （4）表现为中性，不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体 和杂合体。
EcoRⅠ酶切示意图
• 5’ AG----GAATTC---GAATTC----GAATTC---CG 3’ 3’ TC----CTTAAG---CTTAAG----CTTAAG---GC 5’ • AG----G AATTC---G AATTC----G AATTC---CG TC----CTTAA G---CTTAA G----CTTAA G---GC 5’ AG----GAATTC---GAATCC----GAATTC---CG 3’ 3’ TC----CTTAAG---CTTAGG----CTTAAG---GC 5’ • AG----G AATTC---GAATCC----G AATTC---CG TC----CTTAA G---CTTAGG----CTTAA G---CG
三、分子标记的种类
分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大 致可分为三大类。 第一类是以分子杂交为核心的分子标记技 术，包括： ★限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP标 记）； ★ DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）； ★原位杂交（in situ hybridization）等；
二、分子标记的概念
• 广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的 并可检测的DNA序列或蛋白质。 • 蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个 以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶 （指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不 同分子形式）。 • 狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定 现在被广泛采纳： 能反映生物个体或种群间基因组中某种差异 特征wk.baidu.comDNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。
现代遗传图谱
• 70年代发展起来的DNA重组技术、DNA克隆技术和DNA 探针技术无疑为拓展遗传图谱的构建途径创造了技术 条件，也使人类基因定位的方法从细胞及染色体水平 过渡到分子水平。 • DNA水平的多态性标记位点作为绘制现代遗传图谱的 主要界标，大大提高图谱的 精确度、准确性。遗传 图谱的绘制也因此进入了一个崭新的时代。 • 现代遗传图谱的概念是由Botstein D等(1980)首先提 出的，在此基础上，限制性片段长 度多态性RFLP作 为遗传图谱的第一代崭新标记得以问世 。遗传图谱 的第二代标记位点是大量的可变数量串联重复 （VNTR)，包括微、小卫星(MS)或短串联重复(STR 或 SSLP)。第三代标记是位点极其丰富的单核苷 酸多态 性(SNP)。
经典遗传图谱
• 人们把单倍体配子所有染色体上的全部基因称 为一个基 因组。基因组内每条染色体上的连 锁基因称为一个连锁群。绘制遗传图谱就是要 进行每条染 色体上基因座位的顺序和距离的 确定，即主要通过家系分析，对不同性状之间、 性状与标 记之间、标记与标记之间的连锁遗 传频率进行计算，最终绘制遗传连锁图。 • 人类遗传图谱包括女性一种配子的23条染色体 (记作23，X)和男性两种配子的23条染色体 (23 ，X)、(23，Y)上的所有基因位点。
五、几种常用的分子标记
（一）限制性片段长度多态性标记 （Restriction fragment length polymorphism, RFLP）
该技术由Grodzicker等于1974年创立。 特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内 切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片 段，或称限制性等位片段。RFLP标记技术的基本 原理就是通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡 是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产 生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插 入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可 导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP。