分子标记技术课件
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→凝胶电泳分离限制性片段 →将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作
的滤膜上
→用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作
探针与膜上的DNA杂交(称 Southern杂交)
→放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该
探针的限制性酶切片段多态性。
生物体样品的选取 动植物生物体由不同的器官和组织构成。应 选用生物体中生长旺Байду номын сангаас的器官、组织和细胞提取 DNA ,如植物幼苗或新长出的叶片、动物的血等。 DNA提取的效果由DNA的质量和得率来评价。选用 适当的生物器官和组织是获得高质量和高得率 DNA 的保证。取样后应尽快在低温中保存,长时 间保存应在超低温中保存。
细胞的裂解
作为 DNA 提取的开始,多细胞的生物体样 品首先需要经过研磨,使样品破碎。然后样品 粉末再通过裂解液把细胞裂解。裂解液通常是 由Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 即三羟基甲基氨基甲烷 缓冲液加裂解剂组成, 如SDS(Sodium dodecyl sulfate)即十二烷基磺 酸钠、 CTAB ( Hexadecyltrimethyl ammonium bromide)即十六烷基三甲基溴化铵等。
五、常用的分子标记
第一类分子标记 以分子杂交为核心的分子标记技术
一)限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphism, RFLP) 该技术由Grodzicker等于1974年创立。 由于DNA分子中限制性内切酶酶切识别序列中 出现碱基的插入、缺失、置换、倒位而导致酶切位 点的增减所引起的基因型限制性片段长度的差异。
分子标记的选择 • 理想的分子标记应该符合的标准是:多态性高; 共显性遗传,在二倍体生物中能区分纯合与杂合 状态;在基因组中频繁出现,甚至贯穿分布于整 个基因组;选择中性;容易获得;容易操作,自 动化程度高;重复性好;所获得的数据能进行交 流和比较。
二、蛋白质标记
• 在蛋白质多态性研究基础上发展起来的分子标记 技术称为蛋白质标记,最常用的技术是蛋白质电 泳及与其配套的专一性染色,如曾经广为采用的 等位酶分析,是通过同一基因位点上不同等位基 因编码的同种酶的不同分子形式,使得酶谱分析 具有相关的遗传学意义,酶谱的变化反应了等位 基因和位点的变化。等位酶技术为植物的种群遗 传学和进化研究作出了重要的贡献。但由于等位 酶缺乏足够的变异,在技术上存在一定的局限性 ,如今已逐渐被DNA标记所取代。
第三类是一些新型的分子标记,如: ★单核苷酸多态性(Single nuleotide polymorphism, 简称SNP标记); ★表达序列标签(Expressed sequences tags, 简 称EST标记)等。
四、分子标记的特点
(1)直接以DNA的形式表现,在生物体的各 个组织、各个发育阶段均可检测到,不受季节、 环境限制,不存在表达与否等问题; (2)数量极多,遍布整个基因组,可检测座位 几乎无限; (3)多态性高,自然界存在许多等位变异,无 须人为创造; (4)表现为中性,不影响目标性状的表达; (5)许多标记表现为共显性的特点,能区别纯 合体和杂合体。
• DNA指纹分析研究是一种重要的分子标记技术, 它包括RFLP(restriction fragment length polymorphism)、RAPD(randomly amplified polymorphic DNA)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)、SSR(simple sequence repeat)和ISSR(inter-simple sequence repeat)等 这些在PCR基础上发展起来的检测DNA多态性的 分子标记技术。
三、DNA分子标记的种类
分子标记大多以电泳谱带的形式表现,大致可 分为三大类。 第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术, 包括: ★限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP标记); ★ DNA指纹技术(DNA Fingerprinting); ★原位杂交(in situ hybridization)等;
基本原理 • 基因组DNA用已知的限制性内切酶消化后,产生 许多大小不等的DNA片段,电泳分离、Southern 印迹转移到硝酸纤维膜上,用放射性标记的探针 与膜上变性的酶切DNA进行杂交,放射自显影, 即可显示出不同材料的多态性图谱,即显示出所 分析的DNA序列间的RFLP。
• 基本步骤: DNA提取→用DNA限制性内切酶消化
第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction ,简称PCR反应)为核心的分子标记技术,包 括:
★随机扩增多态性DNA标记(Random amplification polymorphism DNA, 简称RAPD标记); ★简单序列重复标记(Simple sequence repeat, 简称SSR标 记)或简单序列长度多态性(Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记); ★扩展片段长度多态性标记(Amplified fragment length polymorphism, 简称AFLP标记); ★序列标签位点(Sequence tagged sites, 简称STS标记); ★序列特征化扩增区域(Sequence charactered amplified region, 简称SCAR标记)等;
分子标记的优越性表现为:(1)分子信息是 可遗传的,而只有在遗传上可传递的属性才能提 供评估系统发育的信息;(2)数量极多,遍布 整个基因组,可检测座位几乎无限;(3)分子 标记能提供共同的尺度;(4)分子数据能将从 共同祖先遗传下来的同源性和由于趋同进化从不 同祖先演变而来的相似性区分开来表现为中性, 不影响目标性状的表达;(5)任何生物有机质 包括动物、植物和微生物有许多共同的分子属性 ,因此分子数据可提供共同尺度来直接比较任何 有机体任何分类层次之间相对水平的遗传变异 ;(6)分子标记技术可应用于各个生物门类, 并都可用于比较和综合分析。