分子标记技术课件

分子标记的优越性表现为：（1）分子信息是 可遗传的，而只有在遗传上可传递的属性才能提 供评估系统发育的信息；（2）数量极多，遍布 整个基因组，可检测座位几乎无限；（3）分子 标记能提供共同的尺度；（4）分子数据能将从 共同祖先遗传下来的同源性和由于趋同进化从不 同祖先演变而来的相似性区分开来表现为中性， 不影响目标性状的表达；（5）任何生物有机质 包括动物、植物和微生物有许多共同的分子属性 ，因此分子数据可提供共同尺度来直接比较任何 有机体任何分类层次之间相对水平的遗传变异 ；（6）分子标记技术可应用于各个生物门类， 并都可用于比较和综合分析。
第二类是以聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction ,简称PCR反应）为核心的分子标记技术，包 括：
★随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism DNA, 简称RAPD标记）； ★简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标 记）或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记）； ★扩展片段长度多态性标记（Amplified fragment length polymorphism, 简称AFLP标记）； ★序列标签位点（Sequence tagged sites, 简称STS标记）； ★序列特征化扩增区域（Sequence charactered amplified region, 简称SCAR标记）等；
第三类是一些新型的分子标记，如： ★单核苷酸多态性（Single nuleotide polymorphism, 简称SNP标记）； ★表达序列标签（Expressed sequences tags, 简 称EST标记）等。
四、分子标记的特点
（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各 个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、 环境限制，不存在表达与否等问题； （2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位 几乎无限； （3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无 须人为创造； （4）表现为中性，不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯 合体和杂合体。
基本原理 • 基因组DNA用已知的限制性内切酶消化后，产生 许多大小不等的DNA片段，电泳分ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ、Southern 印迹转移到硝酸纤维膜上，用放射性标记的探针 与膜上变性的酶切DNA进行杂交，放射自显影， 即可显示出不同材料的多态性图谱，即显示出所 分析的DNA序列间的RFLP。
• 基本步骤： DNA提取→用DNA限制性内切酶消化
三、DNA分子标记的种类
分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可 分为三大类。 第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术， 包括： ★限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP标记）； ★ DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）； ★原位杂交（in situ hybridization）等；
分子标记的选择 • 理想的分子标记应该符合的标准是：多态性高； 共显性遗传，在二倍体生物中能区分纯合与杂合 状态；在基因组中频繁出现，甚至贯穿分布于整 个基因组；选择中性；容易获得；容易操作，自 动化程度高；重复性好；所获得的数据能进行交 流和比较。
二、蛋白质标记
• 在蛋白质多态性研究基础上发展起来的分子标记 技术称为蛋白质标记，最常用的技术是蛋白质电 泳及与其配套的专一性染色，如曾经广为采用的 等位酶分析，是通过同一基因位点上不同等位基 因编码的同种酶的不同分子形式，使得酶谱分析 具有相关的遗传学意义，酶谱的变化反应了等位 基因和位点的变化。等位酶技术为植物的种群遗 传学和进化研究作出了重要的贡献。但由于等位 酶缺乏足够的变异，在技术上存在一定的局限性 ，如今已逐渐被DNA标记所取代。
细胞的裂解
作为 DNA 提取的开始，多细胞的生物体样 品首先需要经过研磨，使样品破碎。然后样品 粉末再通过裂解液把细胞裂解。裂解液通常是 由Tris Tris（hydroxymethyl）aminomethane， 即三羟基甲基氨基甲烷 缓冲液加裂解剂组成， 如SDS（Sodium dodecyl sulfate）即十二烷基磺 酸钠、 CTAB （ Hexadecyltrimethyl ammonium bromide）即十六烷基三甲基溴化铵等。
→凝胶电泳分离限制性片段 →将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作
的滤膜上
→用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作
探针与膜上的DNA杂交（称 Southern杂交）
→放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该
探针的限制性酶切片段多态性。
生物体样品的选取 动植物生物体由不同的器官和组织构成。应 选用生物体中生长旺盛的器官、组织和细胞提取 DNA ，如植物幼苗或新长出的叶片、动物的血等。 DNA提取的效果由DNA的质量和得率来评价。选用 适当的生物器官和组织是获得高质量和高得率 DNA 的保证。取样后应尽快在低温中保存，长时 间保存应在超低温中保存。
• DNA指纹分析研究是一种重要的分子标记技术， 它包括RFLP（restriction fragment length polymorphism）、RAPD（randomly amplified polymorphic DNA）、AFLP（amplified fragment length polymorphism）、SSR（simple sequence repeat）和ISSR（inter-simple sequence repeat）等 这些在PCR基础上发展起来的检测DNA多态性的 分子标记技术。
五、常用的分子标记
第一类分子标记 以分子杂交为核心的分子标记技术
一）限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, RFLP） 该技术由Grodzicker等于1974年创立。 由于DNA分子中限制性内切酶酶切识别序列中 出现碱基的插入、缺失、置换、倒位而导致酶切位 点的增减所引起的基因型限制性片段长度的差异。