细菌鉴定中常见的生理生化反应

实验五细菌鉴定中常见的生理生化反应

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一、实验目的

1)了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。

2)了解不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况。

3)了解细菌在不同培养基的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。

二、实验原理

各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。以此用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。

1.糖（醇）类发酵试验

不同的细菌含有发酵不同的糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同，产生的代谢产物也不同：有的产酸产气，有的产酸不产气。指示剂溴甲酚紫，pH5.2黄色—pH6.8紫色，当发酵产酸时，培养基将由紫变黄。产气可由杜氏小管中有无气泡来证明。

2.甲基红试验（M.R试验）

甲基红试验，pH4.4红色～pH6.2黄色，是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。有些细菌分解糖类产生丙酮酸，丙酮酸进一步反应形成甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降低到4.2以下。有些细菌在培养的早期产生有机酸，但在后期将有有机酸转化为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6。

3.Voges-Proskauer试验（伏-普试验，V.P. 试验）

伏-普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。某些细菌分解葡萄糖成丙酮酸，再将丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被氧化为二乙酰，二乙酰与培养基中所含的胍基作用，生成红色化合物为V.P.反应阳性。

4.靛基质试验

某些细菌，如大肠杆菌，能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生靛基质，靛基质与对二甲基氨基苯甲酸结合，形成玫瑰色靛基质。

5.硫化氢试验

某些细菌能分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐反应，形成黑色的硫化铁沉淀，为硫化氢试验阳性。

6.明胶液化实验

明胶在25度以下可维持凝胶状态，以固体状态存在，而在25度以上时明胶就会液化。有些微生物可产生一种成为明胶酶的胞外酶，水解这种蛋白质，而使明胶液化，甚至在4

度仍能保持液化状态。

7.柠檬酸盐利用试验

有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂

pH6.0(黄)～7.6(蓝)，由绿色变为深蓝色。

8.淀粉水解实验

细菌水解淀粉的过程可以通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。

三、实验仪器、材料和用具

实验仪器：32度恒温培养箱、4度冰箱；

微生物材料：大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌、待鉴定的未知菌的平板单菌落；

试剂：甲基红试剂、V.P.试剂、吲哚试剂，KOH溶液；

实验用具：

试管：每个试验3根试验管，1根对照管，8个试验，共32管；

杜氏小管、接种环、接种针、酒精灯、火柴、试管架、记号笔。

四、实验步骤。

1. 配制培养基（上次实验完成）

2. 鉴别实验

1）糖(醇)类发酵试验

编号：在各试管上分别标明发酵培养基名称，所接种的菌名和组号，下同。

接种：取葡萄糖发酵培养基3支，按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。同样取3支乳糖发酵培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。

将已接种好的培养基置32℃温箱中培养24h。

2）甲基红试验(M.R.试验)

将大肠杆菌和产气杆菌分别接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，32℃培养 24h，加甲基红指示剂数滴，观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。

3）伏一普试验(V．P．试验)

将被检菌接种到葡萄糖蛋白胨水中，32℃培养24h，取出，加入40％KOH 7滴，然后再加入等量的5％a-萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃温箱中保温30min，以加快反应速度。若培养物呈现红色，为伏—普反应阳性。

4)靛基质(吲哚)试验

将被检菌接种到胰蛋白胨水培养基中，32℃培养24h后，滴加数滴吲哚试剂于培养物液面，轻轻摇动，观察结果。

出现红色者为阳性，出现黄色者为阴性。

5)硫化氢试验：

将大肠杆菌和变形杆菌以接种针穿刺接种到醋酸铅或柠檬酸铁氨培养基中，32℃培养24h，观察结果，若有黑色出现者为阳性。

6)明胶液化试验

取大肠杆菌和枯草杆菌的纯培养物少许，以接种针分别穿刺接种到营养明胶培养基中，置32℃培养24小时。故观察结果时，应将明胶培养基轻轻放入4℃冰箱30min，此时明胶又凝固。若放置于冰箱30min仍不凝固者，说明明胶被试验细菌液化，是为阳性。

7）柠檬酸盐利用试验

取少量被检菌接种到柠檬酸盐培养基上，32℃培养24h后，观察结果。培养基变深蓝色者为阳性。

8）淀粉水解试验

在培养进表面滴加碘液，观察是否变紫。

五、实验结果及分析

1.观察结果如下表：

注：柠檬酸盐利用实验接种错误，将产气气杆菌接错为变形杆菌；

吲哚实验中由于试剂加错，故未观察到实验结果。 淀粉水解试验

2.在吲哚实验和硫化氢实验中细菌各分解哪种氨基酸？

吲哚实验：含有色氨酸酶的细菌（如大肠杆菌、变形杆菌等）可分解色氨酸生成吲哚。 硫化氢实验：变形杆菌、乙型副伤寒杆菌等能分解含硫氨基酸如胱氨酸、甲硫氨酸等，生成硫化氢。

3.说明硝酸盐还原实验对细菌的生理意义及对农业生产的影响？

硝酸盐还原实验广泛用于细菌鉴定。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐;假单胞菌属中有的细菌能产生氮气，如铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、斯氏假单胞菌，有的则能还原硝酸盐为亚硝酸盐，如鼻疽假单胞菌等;厌氧菌如韦荣菌也能还原硝酸盐为亚硝酸盐。

食品中的硝酸盐，一是来源于自然界，如某些蔬菜中常含有较多硝酸盐；一是由于食品加工的需要，加入适量的硝酸盐及亚硝酸盐作为某些食品的发色剂。硝酸盐本身毒性不大，但它在细菌的作用下可被还原成亚硝酸盐，直接使人畜中毒缺氧，引起正铁血红蛋白症，还能与胃肠道中的次级胺形成强致癌物质亚硝酸胺，诱发消化系统癌变。蔬菜，尤其是叶菜类易富集硝酸盐，人体摄入的硝酸盐有81.2%来自蔬菜。近年来，由于不合理施肥等原因，叶菜类蔬菜硝酸盐含量超标严重。因此，加强对我国蔬菜，特别是叶菜类硝酸盐含量的监测具有极其重要的理论和实践意义。

编号

大肠杆菌 枯草杆菌

产气杆菌

变形杆菌 空白对照 葡萄糖发酵实验 有气泡 / / 无气泡 无气泡 乳糖发酵实验 有气泡 / /

无气泡

无气泡 甲基红试验 红色 / 红色 / 黄色 伏-普试验 黄色 / 黄色 / 黄色 吲哚试验 无结果

/ 无结果

/ 无结果 硫化氢试验 白色固体沉淀 / /

白色固体沉淀

白色固体沉淀 明胶液化试验 未液化 未液化

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/ 未液化 柠檬酸盐利用试验 蓝绿色 / / 蓝绿色 蓝绿色 淀粉试验平板 无菌落生长 透明圈1cm

/ / / 硝酸盐还原实验

无阳性反应

无阳性反应

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无阳性反应