第六章微生物发酵制药(2)

• （3）菌种纯化 在自然条件下，各种类型的菌混杂在
一起生活，所以要进行分离，以获得纯 种。菌种纯化的方法一般采用稀释分离 或划线分离法。
• 2.菌种的筛选 （1）筛选对象的选择 筛选前，先要考虑哪些微生物是筛
选的对象。如有报道，则根据文献收集 可能性最大的的微生物进行筛选。
• （2）培养方式的确定 微生物的培养方式，有固体培养与液体 培养。
• 在选择酶制剂时、初筛平板个应添加有相应酶 的底物，以便根据透明圈或变色圈的大小来选 择高产菌株。
• 制药微生物菌种的选育
• 从自然界分离到的微生物由于生产能力低，往 往不能满足生产的要求，因此为获得人生产所 需的理想菌株，就必须通过菌种选育改造微生 物的遗传特征，改变野生型微生物的正常代谢， 使之不仅仅只是为了菌体本身的繁殖形成代谢 产物，而且能积累某种特定药物。
• 因此链霉素小仅能引起自身产生菌的变 异，提高链酶素的发酵单位，也可以引 起其他抗生素产生菌的突变，在链酶素 的作用下曾获得过对链霉素抗性稳定的 郎他酶素高产菌株。
• 诱变结束后的筛选可以采用传统的随机 筛选，也可以通过推理型筛选，即根据 产生菌的生物合成途径或遗传机制来设 计筛选有效突变型的方法。具体有：
液的活性物质含量；②琼脂平皿上的单 菌落形态；③不同培养时期菌体细胞的 形态和主要遗传特征。如形成孢子能力； ④发酵过程pH变动情况；⑤发酵液的气 味、色泽
• 菌种退化防止措施：①防止基因突变，基因突 变是菌种退化的一个主要原因，低温保藏法可 以减少突变得产生。②采用双重缺陷型 采用
双营养缺陷标志可间接而有效地防止突变。③ 制定科学管理制度 制作平行菌种斜面；④分
分离所需要菌种，如到堆积和腐烂纤维素的地 方去取样分离纤维素酶产生菌。到温泉附近取 样分离高温蛋白酶产生菌。一般可以从土壤中 分离所需微生物，取样时先将表土刮去2~3cm， 在同一条件下选好2~5点土样混在一起包好， 表明采样地点及日期备用。
• （2）富集培养
• 收集到的样品若含所需要的菌较多，可 直接分离。如含所需要的菌很少，就需 要经过富集培养，使所需要的菌大量生 长，以利于筛选。再配合控制温度，pH 或营养成分即可达到目的。有时用能分 解的底物作为生长和诱导产生所须成分 的培养基成分，以使所需要的菌种得到 快速生长，有利于进一步分离。
• 如果目的产物并非代谢途径的末端产物， 还应阻断目的产物以下的多余代谢途径。 这样通过代谢途径障碍突变型的筛选即 可以获得高产目的产物的菌株。
• 另外，突变株有时会发生变异，在传代 过程造成一些低发酵活力的菌占有主导 地位，最终导致菌种不纯，因此经常性 地进行自然分离和诱变育种是生产正常 进行的一个保证。
Hale Waihona Puke • 药物高产菌种或分泌新型特效药物菌株的选育， 包括自然选育和人工选育两种方法．后者又分 诱变育种、杂交育种和基因工程育种等方法， 其育种原理都是通过基因突变成和重组来获得 优良菌株，有关杂交育种(包括原生质体融合 技术)和基因工程。
• 1.菌种的分离
• 微生物种类繁多，易于培养，是工业化生产 各种生物药物的主要材料。 （1）含菌样品的收集 根据微生物的生态特点，从自然界取样，
• 3.菌株的选育 从自然界直接分离得到的菌种，都不能
立即适应实际生产需要。只有通过诱变， 选育才能使产量成倍，成百倍地提高。 选育方法基本上可以分成两类：随机选 择突变体；根据代谢的调节机制选择各 种突变体。
• （1）随机选择法 一般程序是采用诱变剂诱变处理微
生物，增殖培养，经过稀释涂布，随机 选择部分或全部单菌落，逐个测定它们 的生物活性。最后挑选出产量或其它性 能比亲代菌株优秀的突变株
• (3)膜渗透突变型 通过诱变选育能抗 抑制细胞膜合成物质的突变株，可改变 细胞膜的渗透性，从而使微生物摄取营 养物质、分泌代谢产物的能力提高，导 致代谢产物增产。
• (4)代谢途径障碍突变型 由于微生物体 内存在着许多不同的代谢途径，有些途 径有共同的前体，因此为积累某一种代 谢产物，可通过诱变选育一些合理的营 养缺陷型菌株截断不必要代谢途径，使 共同前体专一向目的产物的合成方向进 行。
• 参与所需产物的合成。微生物积累代谢 产物的能力和利用前体的能力密切相关。 当前体不足时产物合成量减少，但是当 产物过量时往往会对微生物呈现毒性， 或表现出反馈抑制调节作用。因此筛选 前体或其类似物抗性突变株，可以消除 前体的毒性或反馈抑制作用，提高目的 产物的产量。
• (2)诱导酶系突变株的筛选 许多微生物 药物部属于次级代谢产物。微生物在生 长期主要利用培养基中营养物质来大量 繁殖两体，直到某些易被利用的和有阻 遏作用的营养物质被耗尽时，生长才处 于停滞状态，转入大量生成次级代谢产 物。
• 冷冻干燥法：将菌种悬浮于脱脂消毒牛奶中， 快速冷冻，真空干燥。 甘油冷冻保存法：将对数期菌体悬浮于新鲜培 养基中，加入15%消毒甘油，混匀速冻，冻存 于－70~－80℃.
诱变育种部分
• 凡是利用诱变剂处理分散而均匀的微生物群体， 促进其基因发生突变的育种技术就称为诱变育 种。其中诱变剂是指能诱致基因突变，明显提 高基因突变频率的理化和生物因素，一般诱变 剂处理后需采用简便且高效的筛选方法，才能 从大量的突变株中寻找出所需要的目的菌株， 团此诱变育种过程包括诱变和筛选两部分。
• 诱变育种虽然能大大提高诱变效果，但仍然是 一种盲目的育种方法，一支理想的菌株往待需 经过反复的诱变和筛选。
• 此外，一些抗生素出可作为诱变剂。如 抗癌抗生素本身是通过抑制癌细胞DNA合 成而发挥作用，因此对微生物的DNA也同 样有诱变的作用。还有其他许多抗生素 也具不同的诱变效果，例如链霉素抑制 蛋白质的合成，引起DNA的交联或DNA的 转译错误、DNA多聚酶或修复的结构改变， 最终引起细胞突变。
离单菌落；认真进行单菌落分离工作，再多做 平行的菌种斜面；⑤选择培养条件 选择有利 于高产菌株而不利于低产菌株的培养条件。
• （2）常用的菌种保藏方法 斜面保存法—将菌种转接到新鲜的琼脂斜面上， 待生长良好后，于4℃保存。根据具体情况，
间隔一定时间后转接。
• 矿油法—在菌种斜面上覆盖矿物油以隔绝空气 防止蒸发。 索氏法—将小试管斜面的菌种放在大试管内， 大试管内装几粒氢氧化钾，管口加橡皮套，然
• 1．抗生素产生菌株的选择
• 抗生素的主要来源仍然是目前应用 最多的放线菌目、细菌和微观真菌。而 进行新抗生素筛选时，应重视稀有放线 菌的分离，因为在经典的筛选方法没有 重大突破之前，发现出链霉菌属中获得 新的抗生素越来越困难，而从稀有放线 面中却不断地发现一些新的抗生素。
• 另外一些巳知抗生素的产生菌和某些似 乎不产生抗生素的菌株，应用现代的生 物合成技术和遗传学新技术，也可以使 它们产生新的抗生素或性能更为优异的 抗生素类似物。不过如果要利用微生物 发酵提高某种抗生素产量，应选择至少 分泌少量抗生素的菌株作为出发菌株。
• 这时是微生物合成次级代谢产物的阶段， 不同产物的生物合成需要不同的专一性 关键酶参与。但这些酶只有在生长期后 期才被少量诱导产生．因此次级代谢产 物在生长期不能合成。
• 如果通过诱变解除分解阻遏次级代谢基 因的作用，或使诱导酶变成合成酶，使 得微生物在牛长期即能合成产生次级代 谢产物的诱导酶，则在生产中可以大大 缩短发酵周期。例如棒曲霉案产生菌诱 变后选到一株诱导酶突变型．它可以在 生长期中产生6—水杨甲脂(棒曲霉素前 体物)合成酶，使得棒曲霉素的合成出生 产期提前到生长期。
• （2）根据代谢的调节机理选择高产突变 体 根据代谢的调节机理选择高产突变体。 (抗性基因)
• 4.菌种的保藏 （1）菌种的退化与防止 生产菌种本来在自然环境下生长，所
以在人工培养条件下，任何菌株通过一 系列的转接传代都可能发生退化。
• 退化一般把菌株的生活力，产孢子能力 的衰退和特殊产物产量的下降，成为退 化。 菌种退化现象：①单位容积中发酵
后用石蜡包封。
• 干硅胶法—试管内装硅胶约半满，180℃加热 灭菌1.5小时，置密封干燥器内冷却，接种菌 液约1ml，塞好棉花，放入预置有色硅胶的大 瓶中，蜡封瓶口，于低温处保存。 砂土管法—取普通黄沙，洗净过60目筛，晒干， 另取普通圆土研碎，过筛，晒干。两者以6:4 混合。分装于安醅瓶或小试管中，然后在60℃ 干热灭菌2小时，连续灭菌三次后即可使用。 装管时可吸取少许孢子悬浮液加入，待干燥后 抽真空封口或用棉花塞紧后蜡封，低温保藏。
• 2．其他生理活性物质产生菌株的选择
• 在筛选分泌某种待定成分的微生物时，一般都 应根据所需物质的特性和微生物的性质制定筛 选方案，因为各种物质的积累在不同微生物体 内的代谢途径可能不同，例如在筛选能够积累 不饱和脂肪酸的菌株时，筛选的方法是在低于 正常培养温度10℃的情况下，仍然能够快速生 长的菌，由于其细胞膜中所含的不饱和脂肪酸 含量越高．则凝固点越低，即细胞在较低温度 下仍能表现出活力。
第二节 制药微生物与产物的生物合成
• 制药微生物的选择
• 在制药工业中常用的微生物一般要求 易培养、产物转化率和生成率高、产物 容易分离提取、发酵液中无毒害成分、 遗传性状比较稳定、生产工艺简单等。 常见的细菌、放线菌、酵母菌和霉菌在 微生物制药中都有应用。
• 符合要求的菌种一股可以从以下途径获 得：从菌种保存机构的已知菌种下分离； 从自然界十分离筛选从生产过程中分离 筛选有益的菌种。目的不同，筛选的方 案也不同。
• (I)前体及其类似物抗性突变株的筛选 在微生物的代谢中，生理活性药物的生 物合成均需要前体，但前体物有两种： 一种是外源性前体，细胞本身不能合成 或合成量极少，必须由外界添加到发酵 培养基中，供目的产物的生物合成用； 另一种是内源性前体，细胞本身能够合 成，在发酵培养基中可添加或不必添加 就能合成这些游体．