病毒纯化浓缩方法

病毒纯化

现代病毒研究往往需要大量的纯病毒粒子，以便于化学研究或制备抗体。

在这里我们简明地描述一下脊髓灰质炎病毒（Polio virus）的纯化步骤。

它是一种已被广泛研究的危害人体健康的病毒。

在开展人体病毒实验工作以前，让实验工作人员获得抵抗这种病毒的免疫力是非常必要的。

脊髓灰质炎病毒疫苗很容易获得，大多数工作人员可能已经获得免疫，但重新免疫是必要的预防措施。

病毒的纯化步骤主要是：1.在大规模的装置中培养病毒；2.去除富含病毒培养液；3.通过沉淀将病毒浓缩；4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。

现在我们讲解每个步骤的一些细节。

1.在大型装置中培养细菌。

为获得足够的用于化学研究的病毒，必须制备大量病毒。

每种病毒的培养都有不同的步骤。

脊髓灰质炎病毒是在人或灵长类动物细胞系中培养的，可以培养在一大瓶中沿壁生长的单层细胞上，也可以在一个轻轻搅拌的细胞悬液中。

在有利病毒生长的条件下，每个宿主细胞能生产10～1000的感染单位的病毒，即每毫升一个感染单位的滴度（或称效价）。

2.富含病毒培养液的去除。

病毒的生长和释放伴随着细胞的破损。

在病毒复制完成的时候，培养液中大多数细胞已经变成了细胞碎片。

为使所有病毒分子完全释放，要通过反复冷冻—融化的循环过程使细胞进一步破碎。

然后将富含病毒的液体从培养瓶转移到离心试管中。

低速离心除去大分子的细胞残骸。

3.通过沉淀将病毒物质浓缩。

由于病毒是蛋白质性质的，它们能通过蛋白质沉淀法沉淀。

脊髓灰质炎病毒可通过高浓度的NH4Cl（每毫升培养液中加0.4g）沉淀下来。

这一过程要在低温下进行，NH4Cl要在搅拌下缓慢加到培养液中。

由于病毒蛋白沉降，溶液将变得浑浊。

将沉淀物通过低速离心（2000g，1-2hr）。

然后将含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸盐缓冲液中再次悬浮培养。

这一步骤可浓缩病毒大约10倍，99％以上的病毒粒子可沉淀回收。

4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。

脊髓灰质炎病毒可以通过蔗糖或CSCl的密度梯度离心纯化。

病毒的超速离心纯化

病毒的超速离心纯化实验目的超速离心法纯化A型禽流感病毒。

实验原理不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。

此法的优点是：（1）分离效果好，可一次获得较纯颗粒；（2）适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；（3）颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。

实验设备和材料专用的超离管、蔗糖配置管，长注射器（以上器材用酒精浸泡过夜，烘干待用）操作步骤蔗糖密度梯度的配制：用已高压的去离子水配制不同浓度的蔗糖，并用22 um滤器过滤。

蔗糖梯度柱长度一般为12 cm，每个梯度蔗糖层长约3 cm即蔗糖溶液体积为3 mL左右，病毒粒子停留的蔗糖密度层应该适当的增大，每个梯度蔗糖所配总体积为20 mL，不需要100 mL。

30%蔗糖溶液配制：去离子水中加入30 g蔗糖，定容到100 mL即可。

1. 病毒的增殖使用SPF鸡胚接毒，共收集150 mL左右病毒尿囊液。

具体如下：取37 ℃培养的9～11日龄SPF鸡胚15个左右。

向各尿囊腔中接种0.2mL储存的AIV（接种病毒液是否需要稀释，应根据病毒毒力的强弱以及实验需求而定。

此法是为增殖病毒，假若接种强毒，则需要根据毒力稀释相应倍数，以便能增殖更多病毒，于37 ℃下继续孵育，每隔12 h照胚一次，弃掉24 h内死亡鸡胚。

24 h后的死胚放4℃过夜，HA 效价7孔，收集尿囊液，直到96 h后收获剩下鸡胚尿囊液，不同时段收集的尿囊液可混合在一起，暂时存放可放-20℃，长时间存放则放于-40℃或-80℃。

2. 取反复冻融后的病毒液10 mL，在10000 r/min、4℃下离心30min，留上清，并测上清HA。

3. 超离：把已经离心处理好的病毒尿囊液装入超离管（实验室超离管体积为30 mL），超离管内不能有气泡，以免超离过程爆破。

离心转速根据病毒粒子直径而定，新城疫病毒尿囊液以40000 r/min 4℃下离心5 h。

病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。

将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。

（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。

（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。

（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。

将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。

同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。

另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。

（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。

（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。

（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。

管底可见少量的半透明或白色沉淀。

将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。

（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。

（9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。

（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。

（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。

（12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。

病毒的浓缩和纯化

病毒的浓缩和纯化
收集发病鹅的脾脏、肝脏和肾脏，均浆用1:5稀释(Wt/vol)buffer A (10 Mm Tris-HCl ,100mM EDTA PH=7.2)离心10000 转，30分钟。

再加上双抗（10000LU/ML）青霉素和链霉素(1mg/ml)。

病毒浓缩的方法用的是蔗糖梯度离心方法。

首先，10000转离心30分钟，收集上清液，用三氯三氟代乙烷纯化两次为了除去脂层。

蔗糖溶液用在下一步的操作中，提前准备buffer A。

上清放于30％的蔗糖的溶液中超速离心。

上清重新用buffer A悬浮，放于25％－60％的不间断的蔗糖溶液中，超速离心120000转，16小时。

离心完后，收集密度差别的液体。

测定病毒的浮力的密度。

最后，分离的液体带再用1：3 buffer A稀释，离心2小时，120000转。

病毒小颗粒用悬200微升水。

病毒纯化密度梯度离心法

病毒纯化，即应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。

病毒提纯是病毒学研究的重要前提，病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质－DNA或RNA的详细研究都需要高纯度的病毒样品。

病毒纯度只是一个相对的概念，很难有绝对的标准，通常以下几点可以作为判定依据。

物理均一性：测定病毒样品的物理均一性，是证明其纯度的常用方法，包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。

病毒滴度与蛋白含量的比例：测定病毒材料的感染力或其血清学反应、滴度与其蛋白含量的比例，也是一种通常采用的纯度测定方法。

病毒滴度对蛋白含量的比例越高，说明病毒的纯度越高。

免疫学反应：免疫反应单一而无非特意反应，则说明病毒材料比较纯净。

结晶形成：病毒粒子在十分纯净的情况下，经常可以形成结晶，但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶，所以这也只是一个相对标准。

病毒纯化方法:1 超速离心法，其中的平衡梯度密度离心是常用的方法，在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。

因为病毒颗粒跟其他生物分子大小不一样，所以病毒在梯度离心过程中形成独特的条带，从而达到分离纯化的效果。

但此法对仪器的要求很高，转速至少30000rpm/min，在这个转速下要求离心时间7-8小时。

2 现在开发出各种亲和树脂，能有效地吸附病毒粒子，从而达到病毒纯化的目的。

Biomiga公司所开发的病毒纯化系列试剂盒，采用新型材料，能有效吸附腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等，加入适当浓度的离子溶液将病毒粒子解离回收，最后对病毒进行脱盐处理，所得病毒纯度高，整个操作简便，极大地缩短了纯化时间，针对需要纯化大量病毒的客户提供大量提取试剂盒，满足客户不同需要。

密度梯度离心法英文名称： density gradient centrifugation method〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。

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本文部分内容来自网络整理，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将立即删除！== 本文为word格式，下载后可方便编辑和修改！ ==peg8000浓缩病毒原理篇一：慢病毒浓缩方法一超速离心沉淀法1. 取6个Ultra-clear SW28离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟。

2. 每个Ultra-clear SW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液。

3. 取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液。

将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml。

同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。

另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。

4. 用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。

5. 按次序将所有6个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中。

6. 4℃，25，000 rpm. (82，700g) 离心2小时。

7. 小心将管子从转头中取出。

倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。

吸掉剩余的液滴。

在管底应当有可见的沉淀。

8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS洗下沉淀。

9. 将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。

10. 在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。

11. 4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。

12. 用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。

避免产生泡沫。

将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中。

13. 集中后的病毒悬液分装成50μl 每份，保存在成品管中。

用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。

方法二 PEG-8000浓缩法1. 5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200mlMilli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃。

病毒纯化浓缩方法

病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMANOPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000X g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm最大离心力为89000X g；超速离心管(Beckman 344058), Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤(1)转染后44-48 小时，收集上清液到50ml 离心管内，并加入20ml Production培养基以便第二轮病毒的收集。

将收集的上清液4C, 4000g 离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45卩m滤膜过滤到40ml超速离心管中。

(2)取6个Beckman超速离心管，70聽醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。

(3)每个Ultra-clear SW28I加入30ml预先处理过滤过的病毒上清。

(4)取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%勺蔗糖溶液(PBS配制)。

将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。

同样地，将剩下8 ml 的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。

另取一支干净的移液管，对剩下3 管进行同样处理。

(5)务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。

(6)4C离心，25000rpm (82700g) 2 h。

(7)离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。

管底可见少量的半透明或白色沉淀。

将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip 头吸去管壁上多余的液体。

(8)每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。

(9)将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。

(10)在4C溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。

(11)4C, 500g离心1分钟，使溶液集中于管底。

(12)用200卩l移液器轻柔吹打使沉淀重悬。

避免产生泡沫。

一种流感病毒的浓缩、纯化方法[发明专利]

(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.07.16C N 103923883A (21)申请号 201310015169.X(22)申请日 2013.01.16C12N 7/00(2006.01)C12N 7/02(2006.01)(71)申请人辽宁成大生物股份有限公司地址110179 辽宁省沈阳市浑南新区新放街1号(72)发明人周荔葆殷建文焦龙吴栩涛甄祖刚赵新(74)专利代理机构沈阳亚泰专利商标代理有限公司 21107代理人韩辉(54)发明名称一种流感病毒的浓缩、纯化方法(57)摘要本发明涉及一种流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于：（1）应用0.8～0.65um 的滤芯进行澄清；（2）750KD 的中空纤维超滤浓缩；（3）Sepharose4FF 层析纯化技术进行纯化。

本发明采用0.65um 的膜对流感病毒液进行澄清，采用中空纤维750k 超滤膜进行浓缩，分子筛层析技术进行纯化彻底解决了目标蛋白纯度低，杂蛋白高、DNA残留量高、抗原回收率低的问题。

对于提供疫苗质量，降低副反应提供了很好的技术手段，有利于生产出高品质、安全性好的高质量疫苗。

(51)Int.Cl.权利要求书1页说明书3页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页说明书3页(10)申请公布号CN 103923883 A1/1页1.一种流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于有以下步骤：（1）应用0.8～0.65um 的滤芯进行澄清；（2）750KD 的中空纤维超滤浓缩；（3）Sepharose 4FF 层析纯化技术进行纯化。

2.根据权利要求1所述的流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于：步骤（1）应用0.8～0.65um 的滤芯进行澄清是指：首先用L-15液体平衡滤芯，之后对病毒液进行澄清。

3.根据权利要求1所述的流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于：步骤（2）750KD 的中空纤维超滤浓缩是指：应用0.5N NaOH 对750KD 的中空纤维超滤浓缩设备进行在线消毒清洗，用L-15液体平衡设备，浓缩20～30倍数，之后用L －15冲洗设备,定容到预订体积，超滤浓缩结束后，应用0.5N NaOH 对超滤设备进行在线清洗，清洗后应用0.1N NaOH 保存。

慢病毒纯化

慢病毒纯化
慢病毒纯化是指从慢病毒病毒培养物中分离和纯化出慢病毒颗粒的过程。

这个过程通常包括以下步骤：
1.细胞培养：首先，需要将慢病毒所感染的细胞系培养到适
当的细胞密度和病毒扩增时间，以确保足够的病毒产量。

2.细胞裂解：将培养的细胞收集并经过离心等方法分离，然
后使用裂解缓冲液裂解细胞，释放出细胞内的慢病毒。

3.离心和过滤：经过细胞裂解后，样品需要进行离心，以去
除细胞碎片和核酸残余物。

然后，可以使用过滤器对澄清
的上清液进行过滤以去除大颗粒物质。

4.病毒浓缩：慢病毒通常是低浓度的，因此需要进行浓缩。

可以使用超滤、离心和沉淀等方法，将病毒颗粒从大量液
体中浓缩到较小的容量中。

5.梯度离心：为了进一步纯化病毒，可以使用梯度离心技术，
如葡聚糖梯度离心或离心浓缩。

这个过程可将纯化的病毒
与细胞碎片、蛋白质和其他污染物分离开来。

6.病毒沉淀：经过梯度离心后，可以进行病毒的最终沉淀。

使用离心来将病毒沉淀到盘底或在离心管底端形成浓缩的
沉淀。

7.再悬浮：将病毒沉淀用缓冲液再悬浮，以便进行后续实验
应用。

在整个慢病毒纯化的过程中，必须遵守基本的生物安全措施，
并使用无菌操作、合适的缓冲液和处理设备。

每一步之间的温度、离心速度和离心时间等参数也需要根据具体的实验条件和病毒类型进行优化和调整。

PEG沉淀法-病毒提纯方法

1. Viruses such as baculovirus can be concentrated by polyethylene glycol precipitation.2. Adjust the pH of the virus-containing supernatant to 7.2-7.5. Polyethylene glycol (PEG, MW 6,000) is added to a final concentration of 8% (w/v).3. Stir at 4℃for 2 hours.4. Centrifuge at 10,000 x g for 2 hours.5. Resuspend the pellet in a small volume of appropriate buffer ( e.g., RNase-free ddH2 for virus RNA prep).沉淀法-病毒提纯方法主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。

1.中性盐沉淀法：病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。

在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。

2.聚乙二醇沉淀法：聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是分子量为2 000～6000的PEG。

将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，通常在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。

Tanncock(1985年) 成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。

3.有机溶剂沉淀法：甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。

病毒纯化浓缩方法

病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。

将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。

（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。

（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。

（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。

将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。

同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。

另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。

（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。

（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。

（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。

管底可见少量的半透明或白色沉淀。

将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。

（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。

（9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。

（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。

（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。

（12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。

病毒纯化浓缩方法

病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。

将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。

（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。

（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。

（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。

将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。

同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。

另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。

（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。

（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。

（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。

管底可见少量的半透明或白色沉淀。

将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。

（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。

（9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。

（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。

（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。

（12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。

慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤

一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。

所以要在细胞购进时就进行冻存。

2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。

4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。

5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。

6. 细胞计数。

7.将细胞离心，1000rpm，2min。

8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。

10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。

二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。

2. 消化细胞，方法同上。

3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。

密度为3×105个/ml。

4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。

三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。

2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。

3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。

4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。

5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。

6. 第二天观察细胞存活率。

倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。

二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems，cat. no. 4304437)3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems，cat. no. 401970)4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems，cat. no. 4316844) 用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。

PEG沉淀法_病毒提纯方法

1. Viruses such as baculovirus can be concentrated by polyethylene glycol precipitation.2. Adjust the pH of the virus-containing supernatant to 7.2-7.5. Polyethylene glycol (PEG, MW 6,000) is added to a final concentration of 8% (w/v).3. Stir at 4℃for 2 hours.4. Centrifuge at 10,000 x g for 2 hours.5. Resuspend the pellet in a small volume of appropriate buffer ( e.g., RNase-free ddH2 for virus RNA prep).沉淀法-病毒提纯方法主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。

1.中性盐沉淀法：病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。

在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。

2.聚乙二醇沉淀法：聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是分子量为2 000～6000的PEG。

将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，通常在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。

Tanncock(1985年) 成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。

3.有机溶剂沉淀法：甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。

PEG沉淀法-病毒提纯方法

1. Viruses such as baculovirus can be concentrated by polyethylene glycol precipitation.2. Adjust the pH of the virus-containing supernatant to 7.2-7.5. Polyethylene glycol (PEG, MW 6,000) is added to a final concentration of 8% (w/v).3. Stir at 4℃for 2 hours.4. Centrifuge at 10,000 x g for 2 hours.5. Resuspend the pellet in a small volume of appropriate buffer ( e.g., RNase-free ddH2 for virus RNA prep).沉淀法-病毒提纯方法主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。

1.中性盐沉淀法：病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。

在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。

2.聚乙二醇沉淀法：聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是分子量为2 000～6000的PEG。

将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，通常在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。

Tanncock(1985年) 成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。

3.有机溶剂沉淀法：甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。

AAV的包装纯化浓缩方法总结

AAV的包装纯化浓缩方法总结腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）,也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒（通常为腺病毒）参与复制。

它编码两个末端的反向重复序列（ITR）中的cap和rep基因。

ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。

cap基因编码病毒衣壳蛋白， rep基因参与病毒的复制和整合。

AAV能感染多种细胞。

rep基因产物存在时，病毒DNA很容易整合到人类第19号染色体。

重组腺相关病毒载体(rAAV) 源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。

经过10余年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。

在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。

实验步骤1、准备HEK 293T细胞：提前一天分HEK 293T细胞，包装时细胞密度85%-90%且细胞分布均匀，状态良好(即：显微镜下观察，培养基中无杂质，无细胞悬浮或有少量细胞悬浮，细胞饱满，在培养皿中贴壁均匀)。

2、包装病毒1）提前一到两个小时给细胞换液，换成无血清的DMEM培养基（1%HEPES和1%P/S）。

换液时移液管要靠近培养皿内壁但不要贴住培养皿内壁缓慢加入DMEM，防止将已经贴壁的细胞吹起，同时换液时应注意避免移液管污染换液用培养基及细胞。

2）转染：以5个15cm培养皿的量为例：向15ml离心管中依次加入DMEM:9ml，Helper:124μg，RC:76μg，目的质粒：65.1μg，PEI:1ml，振荡混匀后室温静置30min。

致病菌分离纯化的例子

致病菌分离纯化的例子1. 超过滤法：利用超滤膜将水、盐和小分子滤除，将大分子或病毒等颗粒截留，从而达到纯化的目的，该方法主要用于大容量病毒样品的浓缩，且回收率高。

常用的超滤膜是硝酸纤维素滤膜。

注意：超滤膜孔径一定要比病毒颗粒小，且只能去除比病毒小的细胞碎块2. 吸附法：利用病毒颗粒或杂质的表面离子与吸附剂之间的亲和作用，将病毒或杂质吸附后，用一定的盐溶液将病毒或杂质洗脱下来。

常用的吸附剂有红细胞、磷酸钙、离子交换树脂等。

注意：吸附剂应有较大的表面积和吸附能力，性质稳定并便于洗脱3. 层析法：利用物质中各组分的理化性质差异，使各组分在固定相和流动相中的分布程度和移动速度不同，从而达到分离的目的。

常用的层析法有凝胶层析法、离子交换层析法和亲和层析法。

（1）凝胶层析法：样品流经具有一定孔径大小的多孔葡聚糖凝胶时，各组分按分子的大小不同而被分离。

常用的凝胶有磷酸钙凝胶、氢氧化锌凝胶和焦磷酸镁凝胶。

（2）离子交换层析法：在一定pH条件下，利用病毒颗粒所带电荷不同实现分离。

适用于所有带电荷的样品的分离纯化。

（3）亲和层析法：利用样品与基质之间的特异性亲和力，实现分离。

适用于纯化生物大分子。

4. 离心法：根据物质的沉降系数或浮力密度的不同，利用离心力将物质分离纯化。

常用于病毒纯化的方法有差速离心法和密度梯度离心法。

（1）差速离心法：利用不同大小和比重的粒子的沉降速度不同，去除宿主细胞碎片等杂质，最后使病毒沉淀。

该方法能迅速处理大量样品。

（2）密度梯度离心：利用超速离心，将病毒颗粒分配到密度梯度介质中相等密度层中，吸出目的颗粒所在介质层，即可到达分离纯化的目的。

常用的介质有氯化铯和蔗糖。

5. 沉淀法：利用悬浮液中的病毒颗粒在重力作用下产生沉降作用，达到分离纯化的目的。

用于病毒纯化的方法有聚乙二醇（PEG）沉淀法、等电点沉淀法和中性盐沉淀法等。

（1）聚乙二醇（PEG）沉淀法：利用聚乙二醇与病毒颗粒形成多聚体，再离心即可沉淀。

vsv纯化灭活方案

vsv纯化灭活方案
"VSV" 通常指的是病毒（Vesicular Stomatitis Virus），灭活指的是使病毒失去感染性，以便在实验室环境中安全使用。

以下是一个常见的 VSV 病毒的纯化和灭活方案：
VSV病毒纯化：
1. 病毒培养：培养感染VSV的宿主细胞，通常是哺乳动物细胞系，以产生大量病毒颗粒。

2. 病毒收集：收集培养物，离心去除细胞碎片，得到含有病毒的上清液。

3. 超速离心：使用超速离心将病毒从上清液中分离出来。

这一步可以使用不同离心力梯度，例如蔗糖密度梯度离心。

4. 病毒沉淀：使用某种沉淀方法，如聚乙二醇沉淀，将病毒沉淀下来。

5. 病毒洗涤：洗涤沉淀得到的病毒，以去除不纯物质。

VSV病毒灭活：
1. 热灭活：将病毒悬液加热至一定温度，通常在56°C到60°C之间，一定时间。

这个温度范围可以灭活病毒，但需小心不要过度加热，以免破坏样本。

2. 化学灭活：使用化学物质（例如，二甲亚砜）处理病毒悬液。

这可以通过在一定浓度下孵育一段时间来实现。

3. 辐射灭活：使用紫外线或离子辐射来灭活病毒。

这需要一定的设备和技术。

4. 形状改变灭活：有些方法通过改变病毒的结构，如通过化学交联，来达到灭活的目的。

在进行灭活之后，建议对样品进行验证，确保病毒已经失去了感染性。

使用这些灭活的样本时，应该采取适当的生物安全措施，以防止意外感染。

实验室工作应遵循相关的生物安全和伦理规定。

此外，具体的步骤可能会根据病毒亚型和实验要求而有所不同，因此在进行任何实验之前，请查阅相关文献或咨询专业人士。