病毒纯化浓缩方法
病毒纯化
现代病毒研究往往需要大量的纯病毒粒子，以便于化学研究或制备抗体。
在这里我们简明地描述一下脊髓灰质炎病毒（Polio virus）的纯化步骤。
它是一种已被广泛研究的危害人体健康的病毒。
在开展人体病毒实验工作以前，让实验工作人员获得抵抗这种病毒的免疫力是非常必要的。
脊髓灰质炎病毒疫苗很容易获得，大多数工作人员可能已经获得免疫，但重新免疫是必要的预防措施。
病毒的纯化步骤主要是：1.在大规模的装置中培养病毒；2.去除富含病毒培养液；3.通过沉淀将病毒浓缩；4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。
现在我们讲解每个步骤的一些细节。
1.在大型装置中培养细菌。
为获得足够的用于化学研究的病毒，必须制备大量病毒。
每种病毒的培养都有不同的步骤。
脊髓灰质炎病毒是在人或灵长类动物细胞系中培养的，可以培养在一大瓶中沿壁生长的单层细胞上，也可以在一个轻轻搅拌的细胞悬液中。
在有利病毒生长的条件下，每个宿主细胞能生产10～1000的感染单位的病毒，即每毫升一个感染单位的滴度（或称效价）。
2.富含病毒培养液的去除。
病毒的生长和释放伴随着细胞的破损。
在病毒复制完成的时候，培养液中大多数细胞已经变成了细胞碎片。
为使所有病毒分子完全释放，要通过反复冷冻—融化的循环过程使细胞进一步破碎。
然后将富含病毒的液体从培养瓶转移到离心试管中。
低速离心除去大分子的细胞残骸。
3.通过沉淀将病毒物质浓缩。
由于病毒是蛋白质性质的，它们能通过蛋白质沉淀法沉淀。
脊髓灰质炎病毒可通过高浓度的NH4Cl（每毫升培养液中加0.4g）沉淀下来。
这一过程要在低温下进行，NH4Cl要在搅拌下缓慢加到培养液中。
由于病毒蛋白沉降，溶液将变得浑浊。
将沉淀物通过低速离心（2000g，1-2hr）。
然后将含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸盐缓冲液中再次悬浮培养。
这一步骤可浓缩病毒大约10倍，99％以上的病毒粒子可沉淀回收。
4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。
脊髓灰质炎病毒可以通过蔗糖或CSCl的密度梯度离心纯化。
病毒溶液去盐和浓缩
病毒溶液去盐和浓缩
氯化铯是通过透析去除的，这一步至关重要，因为高浓度氯化铯可能会影响病毒对细胞或组织的感染。
透析液的选择取决于病毒的最终用途。
如果用于动物：则应避免使用甘油，因为含有甘油的溶液极难注射；如果要使病毒滴度达到5×1011vp/ml，则应避免PBS-5%蔗糖缓冲液，因其不能提供良好的病毒稳定性，由于溶液PH的关系，病毒将会沉淀下来。
含10mM Tris（PH8.0），2mM Mgcl2，5%蔗糖的病毒缓冲液可允许病毒浓缩至1013vp/ml，并且具有良好的稳定性。
（Nyberg-Hoffman等，1999）。
将病毒带在分子筛为25000道尔顿的纤维素酯膜中进行4℃透析，去除氯化铯盐。
由于病毒分子量较大，大小约90nm，因此不能穿过透析膜。
缓冲液的体积应为病毒溶液的200倍，每次透析一小时，然后更换缓冲液，3次更换缓冲液后应已无痕量氯化铯。
透析后的病毒溶液可在-80℃中长期保存，-20℃中则可保存较短时间。
需要注意的是腺病毒在反复冻融后感染力将减弱，因此可将病毒分装成小份，一部分进行滴度测定（5.8：病毒滴度测定），剩下的用于以后的实验。
如果透析后病毒溶液太稀。
Millipore公司的超纯浓集柱可将病毒浓度提高10倍。
这个过程中所丢失的病毒量小于10%。
纯化柱在使用前必须用70%乙醇消毒，然后在加入病毒前再去除痕量乙醇（比如用病毒缓冲液）。
病毒纯化浓缩方法
病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。
将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。
（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。
（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。
（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。
（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。
（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。
管底可见少量的半透明或白色沉淀。
将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。
（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。
（9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
（12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
蔗糖梯度密度离心
纯化病毒常用的方法是蔗糖密度梯度离心法，能得到比较纯的病毒。
其过程如下：1、将收集的组织或脏器或其他,用玻璃匀浆器充分研磨后制成悬液,经反复冻融3 次后,置- 20 ℃冰箱中,备用。
2、先以5000g离心15分钟后，获取上清夜，然后再20000g高速离心30分钟后取上清夜。
3、接着10万g超速离心2h，将沉淀用少量STE溶解。
4、先在超速离心管中加入5-8mL的第3步所获取的含病毒样品的溶解液，然后在离心管中依次加入30 % , 45 % , 60 %的蔗糖,加的时候是用长针头从底部往上加的。
11万g离心2.5h,发现在30 %与45 % 以及45 % 与60 %之间都有一条明亮的带，用长针头将两条不同部位的带都吸取出来，分别收集到不同的瓶内。
5、去蔗糖；用STE缓冲液适量稀释纯化的病毒，然后11万g离心3h,用少量STE （根据沉淀的量决定加入多少）缓冲液把沉淀悬起，即最后获得了纯化的病毒。
-20度冻纯备用，用时可用分光光度计测定其病毒含量。
问：我在做病毒纯化时，需先用超速离心，再用蔗糖密度梯度离心，求助高手用蔗糖密度梯度离心时的转速与超速离心时的转速有联系吗，是相等还是蔗糖密度梯度离心的转速要比超速离心的速度高？若为后者，那又若何决定蔗糖密度梯度离心时的转速？谢谢！答：1、病毒的纯化时，先用超速离心，你应该查一下资料，看在多大的转速时能够把病毒离心下来．那么你的这一步的转速应该至少不小于该转速，你这一步离心下来的沉淀中含有病毒和蛋白成分。
2、因此你的第二步工作就是要将病毒与其他的蛋白以及杂质分离开，密度梯度离心就可以达到该目的。
这时你的离心速度要考虑病毒的大小和蔗糖的密度，使得病毒不能沉淀道管底又可与蛋白层分开。
这也可能要具体问题具体分析。
问：谢谢主任的指点，我的病毒直径为100nm。
查阅了有观资料，超速离心为21000rpm,45min，我用24000rpm2hr，我用20%-60%连续蔗糖密度梯度离心，该病毒在蔗糖中的浮密度为1.18mg/ml，请问我的糖密度梯度离心速度大概是多少？谢谢！答：我们实验室IBV （80-100nm）的纯化是：l 病毒纯化浓缩（方法一）1、冷冻之尿囊液解冻后，4℃，11000rpm离心20min。
病毒的浓缩和纯化
病毒的浓缩和纯化
收集发病鹅的脾脏、肝脏和肾脏，均浆用1:5稀释(Wt/vol)buffer A (10 Mm Tris-HCl ,100mM EDTA PH=7.2)离心10000 转，30分钟。
再加上双抗（10000LU/ML）青霉素和链霉素(1mg/ml)。
病毒浓缩的方法用的是蔗糖梯度离心方法。
首先，10000转离心30分钟，收集上清液，用三氯三氟代乙烷纯化两次为了除去脂层。
蔗糖溶液用在下一步的操作中，提前准备buffer A。
上清放于30％的蔗糖的溶液中超速离心。
上清重新用buffer A悬浮，放于25％－60％的不间断的蔗糖溶液中，超速离心120000转，16小时。
离心完后，收集密度差别的液体。
测定病毒的浮力的密度。
最后，分离的液体带再用1：3 buffer A稀释，离心2小时，120000转。
病毒小颗粒用悬200微升水。
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本文部分内容来自网络整理，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将立即删除！== 本文为word格式，下载后可方便编辑和修改！ ==peg8000浓缩病毒原理篇一：慢病毒浓缩方法一超速离心沉淀法1. 取6个Ultra-clear SW28离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟。
2. 每个Ultra-clear SW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液。
3. 取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
4. 用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。
5. 按次序将所有6个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中。
6. 4℃，25，000 rpm. (82，700g) 离心2小时。
7. 小心将管子从转头中取出。
倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。
吸掉剩余的液滴。
在管底应当有可见的沉淀。
8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS洗下沉淀。
9. 将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
10. 在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
11. 4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
12. 用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
避免产生泡沫。
将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中。
13. 集中后的病毒悬液分装成50μl 每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。
方法二 PEG-8000浓缩法1. 5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200mlMilli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃。
病毒纯化浓缩方法
病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMANOPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000X g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm最大离心力为89000X g；超速离心管(Beckman 344058), Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤(1)转染后44-48 小时，收集上清液到50ml 离心管内，并加入20ml Production培养基以便第二轮病毒的收集。
将收集的上清液4C, 4000g 离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45卩m滤膜过滤到40ml超速离心管中。
(2)取6个Beckman超速离心管，70聽醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。
(3)每个Ultra-clear SW28I加入30ml预先处理过滤过的病毒上清。
(4)取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%勺蔗糖溶液(PBS配制)。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。
同样地，将剩下8 ml 的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3 管进行同样处理。
(5)务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。
(6)4C离心，25000rpm (82700g) 2 h。
(7)离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。
管底可见少量的半透明或白色沉淀。
将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip 头吸去管壁上多余的液体。
(8)每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。
(9)将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
(10)在4C溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
(11)4C, 500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
(12)用200卩l移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
避免产生泡沫。
病毒的纯化与保存
整理版
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凝胶吸附法-氢氧化锌凝胶
是由7 mol/L氨水与0.1 mol/L醋酸锌溶液 滴加混合(pH8.5)制备，在制备后数小时 内较稳定。
方法：将水泡性口炎病毒悬液与氢氧化 锌凝胶混合，使它们形成复合体后沉淀， 然后用0.08mol/L EDTA(pH8.5)解离回收
整理版
1、释放病毒到胞外 1.1 容易释放病毒(培养液/尿囊液)
1.2 不容易释放病毒(细胞破碎) 2、去除细胞碎块
低速离心，以2000～6000r/min离心30～ 40分钟，可除去90％以上的细胞碎片和杂质
3、病毒悬液浓缩
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细胞破碎方法(熟悉)
超声破碎：密集的小气泡迅速炸裂，破坏细胞 高压匀浆：机械切割力 高速珠磨：玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂 酶溶法：溶菌酶、蛋白酶、葡聚糖酶 化学渗透：渗透压改变使细胞破裂 反复冻融：形成冰晶，使细胞膨胀破裂
4) 1000 r/min 离心10分钟，上清即是浓缩的 病毒悬液。
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葡聚糖柱层析法(熟悉)
葡聚糖凝胶是指由葡聚糖与其它交联剂 交联而成的凝胶。
最常见的是Sephadex 系列，主要型号是G-10 ~ G-200，后面的数字是凝胶的吸水率(单位是 mL / g 干胶)乘以10。如Sephadex G-50，表 示吸水率是5mL/g 干胶。
(2)液体浓缩法
整理版
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聚乙二醇(PEG)浓缩法(掌握)
(3)固体浓缩法 将PEG固体覆盖于装有病毒悬液的透析袋 上，进行浓缩。 透析袋孔径大小
整理版
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超过滤法(熟悉)
原理：利用超滤膜将水、盐及小分子滤 过，将大分子或病毒等颗粒截留。
PEG收集沉淀病毒的方法
PEG收集沉淀病毒的方法
1、用超声波或冻融的方法使细胞破碎释放出病毒；
2、慢慢搅动并加入NaCl终浓度是0.5mol/L,有助于病毒的沉淀，再等量加入10％
PEG(一般使用的是PEG6000就可以了。
3、4过夜或放置一段时间；
4、8000r/min离心30分钟，收集病毒沉淀；
5、将病毒沉淀加入适量的PBS中，4℃过夜；
6、10000r/min离心1小时,沉淀即为浓缩的病毒。
还可以用梯度离心或其他方法进一步纯化。
取100mL毒液，10000r/min，10min，取上清。
上清中加入10Gpeg-20000和2gNaCl4℃
溶解过夜，20000r/min，离心30min，弃上清，留沉淀。
沉淀用3ml无菌PBS重悬，
转入透析袋中，2L预冷PBS透析液4℃透析，每4h换一次液，到第三次过夜透析。
将透析袋放入平皿中，覆盖蔗糖浓缩至1.5ml，500μl1支分装至EP管中。
-80℃备
用。
将细胞反复冻融3次后，则获得病毒液。
取500mL病毒液，于4℃2000rpm离心10min，取上清；在超净工作台中，向上清中加入PEG6000和10gNaCl，边加边轻轻搅拌混匀，于4℃溶解过夜（注意要溶解完全，防止有未溶解的PEG）；于4℃8500g离心30min，弃上清，留取沉淀；沉淀用1.5mL无菌的PBS重悬，转入透析袋中，置于2L的预冷的PBS中进行透析，每4h更换一次透析液，至第3次时透析过夜；用蔗糖进行浓缩，500μL/每支分装到EP管中，-80℃保存；采用紫外分光光度计和BCA进行蛋白定量，定量结果为20.5mg/mL。
一种流感病毒的浓缩、纯化方法[发明专利]
![一种流感病毒的浓缩、纯化方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/909012f409a1284ac850ad02de80d4d8d15a012a.png)
(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.07.16C N 103923883A (21)申请号 201310015169.X(22)申请日 2013.01.16C12N 7/00(2006.01)C12N 7/02(2006.01)(71)申请人辽宁成大生物股份有限公司地址110179 辽宁省沈阳市浑南新区新放街1号(72)发明人周荔葆 殷建文 焦龙 吴栩涛甄祖刚 赵新(74)专利代理机构沈阳亚泰专利商标代理有限公司 21107代理人韩辉(54)发明名称一种流感病毒的浓缩、纯化方法(57)摘要本发明涉及一种流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于：（1）应用0.8～0.65um 的滤芯进行澄清；（2）750KD 的中空纤维超滤浓缩；（3）Sepharose4FF 层析纯化技术进行纯化。
本发明采用0.65um 的膜对流感病毒液进行澄清，采用中空纤维750k 超滤膜进行浓缩，分子筛层析技术进行纯化彻底解决了目标蛋白纯度低，杂蛋白高、DNA残留量高、抗原回收率低的问题。
对于提供疫苗质量，降低副反应提供了很好的技术手段，有利于生产出高品质、安全性好的高质量疫苗。
(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书3页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书3页(10)申请公布号CN 103923883 A1/1页1.一种流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于有以下步骤：（1）应用0.8～0.65um 的滤芯进行澄清；（2）750KD 的中空纤维超滤浓缩；（3）Sepharose 4FF 层析纯化技术进行纯化。
2.根据权利要求1所述的流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于：步骤（1）应用0.8～0.65um 的滤芯进行澄清是指：首先用L-15液体平衡滤芯，之后对病毒液进行澄清。
3.根据权利要求1所述的流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于：步骤（2）750KD 的中空纤维超滤浓缩是指：应用0.5N NaOH 对750KD 的中空纤维超滤浓缩设备进行在线消毒清洗，用L-15液体平衡设备，浓缩20～30倍数，之后用L －15冲洗设备,定容到预订体积，超滤浓缩结束后，应用0.5N NaOH 对超滤设备进行在线清洗，清洗后应用0.1N NaOH 保存。
PEG沉淀法-病毒提纯方法
1. Viruses such as baculovirus can be concentrated by polyethylene glycol precipitation.2. Adjust the pH of the virus-containing supernatant to Polyethylene glycol (PEG, MW 6,000) is added to a final concentration of 8% (w/v).3. Stir at 4℃for 2 hours.4. Centrifuge at 10,000 x g for 2 hours.5. Resuspend the pellet in a small volume of appropriate buffer ( ., RNase-free ddH2 for virus RNA prep).沉淀法-病毒提纯方法主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。
1.中性盐沉淀法：病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。
在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。
2.聚乙二醇沉淀法：聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是分子量为2 000～6000的PEG。
将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，通常在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。
Tanncock(1985年) 成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。
3.有机溶剂沉淀法：甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。
4.等电点沉淀法：病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发生沉淀。
慢病毒纯化
慢病毒纯化
慢病毒纯化是指从慢病毒病毒培养物中分离和纯化出慢病毒颗粒的过程。
这个过程通常包括以下步骤：
1.细胞培养：首先，需要将慢病毒所感染的细胞系培养到适
当的细胞密度和病毒扩增时间，以确保足够的病毒产量。
2.细胞裂解：将培养的细胞收集并经过离心等方法分离，然
后使用裂解缓冲液裂解细胞，释放出细胞内的慢病毒。
3.离心和过滤：经过细胞裂解后，样品需要进行离心，以去
除细胞碎片和核酸残余物。
然后，可以使用过滤器对澄清
的上清液进行过滤以去除大颗粒物质。
4.病毒浓缩：慢病毒通常是低浓度的，因此需要进行浓缩。
可以使用超滤、离心和沉淀等方法，将病毒颗粒从大量液
体中浓缩到较小的容量中。
5.梯度离心：为了进一步纯化病毒，可以使用梯度离心技术，
如葡聚糖梯度离心或离心浓缩。
这个过程可将纯化的病毒
与细胞碎片、蛋白质和其他污染物分离开来。
6.病毒沉淀：经过梯度离心后，可以进行病毒的最终沉淀。
使用离心来将病毒沉淀到盘底或在离心管底端形成浓缩的
沉淀。
7.再悬浮：将病毒沉淀用缓冲液再悬浮，以便进行后续实验
应用。
在整个慢病毒纯化的过程中，必须遵守基本的生物安全措施，
并使用无菌操作、合适的缓冲液和处理设备。
每一步之间的温度、离心速度和离心时间等参数也需要根据具体的实验条件和病毒类型进行优化和调整。
病毒纯化浓缩方法
病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机（BECKMAN OPTIMAL—80XP) 50000～80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP）20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管（Beckman 344058)，Ultra—clear SW28离心管2 方法步骤（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。
将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟,去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中.（2）取6个Beckman超速离心管，70％乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min.（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。
（4）取一支10ml的移液管,吸取12 ml 20%的蔗糖溶液（PBS配制)。
将移液管一直插入到离心管的底部,缓慢将蔗糖溶液打出4 ml,形成一个蔗糖垫。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管,对剩下3管进行同样处理.（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。
（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。
（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀.管底可见少量的半透明或白色沉淀。
将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。
（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。
（9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子.（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
（12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行冻存。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7.将细胞离心，1000rpm，2min。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
病毒纯化浓缩方法
病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。
将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。
（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。
（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。
（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。
（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。
（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。
管底可见少量的半透明或白色沉淀。
将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。
（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。
（9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
（12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
aav纯化工艺
AAV 纯化工艺是指从病毒载体生产过程中获得高纯度AAV 病毒的技术和方法。
以下是一些常见的AAV 纯化工艺步骤：
1. 细胞裂解：收获病毒感染的细胞，并通过裂解细胞释放出病毒粒子。
2. 澄清：使用离心、过滤或其他方法去除细胞碎片和杂质。
3. 核酸酶处理：加入核酸酶，如DNase 和RNase，以去除宿主细胞DNA 和RNA。
4. 盐析：通过加入盐类，如硫酸铵，使病毒粒子沉淀。
5. 离心：进行离心操作，将沉淀的病毒粒子与上清液分离。
6. 层析：使用层析技术，如离子交换层析、凝胶过滤层析或亲和层析，进一步纯化病毒粒子。
7. 浓缩和制剂：对纯化的AAV 病毒进行浓缩，并根据需要制备成适当的制剂形式，如液体或冻干粉。
这些步骤可以根据具体的实验需求和条件进行调整和优化。
每种纯化工艺都有其优点和局限性，选择合适的方法需要考虑病毒产量、纯度、成本和时间等因素。
此外，不同的AAV 血清型可能需要不同的纯化策略。
rAAV病毒纯化
rAAV 病毒的纯化.
1.将收集的培养物定义为初始物. 加入1/10体积的氯仿,置于37 摇床中剧烈振摇1 h,
2.加入固体氯化钠至终浓度1 mol/L, 振摇溶解. 4℃, 12 000
r/min离心15 min.取出上层水相, 弃去氯仿和沉淀.
3.加PEG8000至终浓度10% (w/v), 振摇溶解后冰浴放置1 h, 11 000 r/min离心15 min. 将上清弃去, 用适当PBS缓冲液将各离心管管底和管壁上的沉淀吹打洗脱下来合并, 将其分装至1. 5 mL塑料离心管中(0.6 mL/管), 此时的rAAV定义为中间产物.
4.加入DNase和RNase至终浓度1 µg/mL, 室温下消化30 min.
5.加等体积的氯仿抽提. 4℃, 12000r/min离心5 min,在无菌操作下小心吸出上层水相.该液体即为浓缩和纯化的rAAV-GFP 病毒液, 定义为终产物. 总回收率=终产物的感染性病毒颗粒数/初始物的感染性病毒颗粒数.。
致病菌分离纯化的例子
致病菌分离纯化的例子1. 超过滤法：利用超滤膜将水、盐和小分子滤除，将大分子或病毒等颗粒截留，从而达到纯化的目的，该方法主要用于大容量病毒样品的浓缩，且回收率高。
常用的超滤膜是硝酸纤维素滤膜。
注意：超滤膜孔径一定要比病毒颗粒小，且只能去除比病毒小的细胞碎块2. 吸附法：利用病毒颗粒或杂质的表面离子与吸附剂之间的亲和作用，将病毒或杂质吸附后，用一定的盐溶液将病毒或杂质洗脱下来。
常用的吸附剂有红细胞、磷酸钙、离子交换树脂等。
注意：吸附剂应有较大的表面积和吸附能力，性质稳定并便于洗脱3. 层析法：利用物质中各组分的理化性质差异，使各组分在固定相和流动相中的分布程度和移动速度不同，从而达到分离的目的。
常用的层析法有凝胶层析法、离子交换层析法和亲和层析法。
（1）凝胶层析法：样品流经具有一定孔径大小的多孔葡聚糖凝胶时，各组分按分子的大小不同而被分离。
常用的凝胶有磷酸钙凝胶、氢氧化锌凝胶和焦磷酸镁凝胶。
（2）离子交换层析法：在一定pH条件下，利用病毒颗粒所带电荷不同实现分离。
适用于所有带电荷的样品的分离纯化。
（3）亲和层析法：利用样品与基质之间的特异性亲和力，实现分离。
适用于纯化生物大分子。
4. 离心法：根据物质的沉降系数或浮力密度的不同，利用离心力将物质分离纯化。
常用于病毒纯化的方法有差速离心法和密度梯度离心法。
（1）差速离心法：利用不同大小和比重的粒子的沉降速度不同，去除宿主细胞碎片等杂质，最后使病毒沉淀。
该方法能迅速处理大量样品。
（2）密度梯度离心：利用超速离心，将病毒颗粒分配到密度梯度介质中相等密度层中，吸出目的颗粒所在介质层，即可到达分离纯化的目的。
常用的介质有氯化铯和蔗糖。
5. 沉淀法：利用悬浮液中的病毒颗粒在重力作用下产生沉降作用，达到分离纯化的目的。
用于病毒纯化的方法有聚乙二醇（PEG）沉淀法、等电点沉淀法和中性盐沉淀法等。
（1）聚乙二醇（PEG）沉淀法：利用聚乙二醇与病毒颗粒形成多聚体，再离心即可沉淀。
vsv纯化灭活方案
vsv纯化灭活方案
"VSV" 通常指的是病毒（Vesicular Stomatitis Virus），灭活指的是使病毒失去感染性，以便在实验室环境中安全使用。
以下是一个常见的 VSV 病毒的纯化和灭活方案：
VSV病毒纯化：
1. 病毒培养：培养感染VSV的宿主细胞，通常是哺乳动物细胞系，以产生大量病毒颗粒。
2. 病毒收集：收集培养物，离心去除细胞碎片，得到含有病毒的上清液。
3. 超速离心：使用超速离心将病毒从上清液中分离出来。
这一步可以使用不同离心力梯度，例如蔗糖密度梯度离心。
4. 病毒沉淀：使用某种沉淀方法，如聚乙二醇沉淀，将病毒沉淀下来。
5. 病毒洗涤：洗涤沉淀得到的病毒，以去除不纯物质。
VSV病毒灭活：
1. 热灭活：将病毒悬液加热至一定温度，通常在56°C到60°C之间，一定时间。
这个温度范围可以灭活病毒，但需小心不要过度加热，以免破坏样本。
2. 化学灭活：使用化学物质（例如，二甲亚砜）处理病毒悬液。
这可以通过在一定浓度下孵育一段时间来实现。
3. 辐射灭活：使用紫外线或离子辐射来灭活病毒。
这需要一定的设备和技术。
4. 形状改变灭活：有些方法通过改变病毒的结构，如通过化学交联，来达到灭活的目的。
在进行灭活之后，建议对样品进行验证，确保病毒已经失去了感染性。
使用这些灭活的样本时，应该采取适当的生物安全措施，以防止意外感染。
实验室工作应遵循相关的生物安全和伦理规定。
此外，具体的步骤可能会根据病毒亚型和实验要求而有所不同，因此在进行任何实验之前，请查阅相关文献或咨询专业人士。
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病毒纯化浓缩方法
方法一超速离心沉淀法
1 仪器
超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管
2 方法步骤
（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。
将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。
（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。
（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。
（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。
（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。
（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。
管底可见少量的半透明或白色沉淀。
将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。
（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。
（9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
（12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
避免产生泡沫。
将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中，分装50ul/管，保存于成品管中，用碎干冰速冻后储存在-80℃冻存。
方法二 PEG-8000浓缩法
(1)5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃。
(2)使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；
(3)每30ml过滤后的病毒初始液，加入5X PEG-8000+NaCl母液7.5 ml；
(4)每20～30min混合一次，共进行3-5次；
(5)4度放置过夜；
(6)4度，4000 g，离心 20min；
(7)吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；
(8)加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；
(9)集中后的病毒悬液分装成50 μl每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80 ℃
方法三慢病毒纯化浓缩试剂盒
1. 每10ml过滤后的病毒初始液，加入Concen Solution 3ml，每20-30min混合一次，共进行3-5次。
2.2. 4℃放置过夜。
3. 4℃，3000 g，离心45min。
4. 去掉上清，静置管子1-2min，吸走残余液体。
5. 加入无血清DEME充分溶解慢病毒沉淀。
6. 病毒悬液分装成200μl每份,保存在离心管中，速冻后储存在-80 ℃。