病毒纯化浓缩方法

病毒纯化浓缩方法

方法一超速离心沉淀法

1 仪器

超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管

2 方法步骤

（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。

（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。

（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。

（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。

（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。

（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。

（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。管底可见少量的半透明或白色沉淀。将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。

（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。

（9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。

（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。

（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。

（12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中，分装50ul/管，保存于成品管中，用碎干冰速冻后储存在-80℃冻存。

方法二 PEG-8000浓缩法

(1)5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃。

(2)使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；

(3)每30ml过滤后的病毒初始液，加入5X PEG-8000+NaCl母液7.5 ml；

(4)每20～30min混合一次，共进行3-5次；

(5)4度放置过夜；

(6)4度，4000 g，离心 20min；

(7)吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；

(8)加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；

(9)集中后的病毒悬液分装成50 μl每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80 ℃

方法三慢病毒纯化浓缩试剂盒

1. 每10ml过滤后的病毒初始液，加入Concen Solution 3ml，每20-30min混合一次，共进行3-5次。

2.2. 4℃放置过夜。

3. 4℃，3000 g，离心45min。

4. 去掉上清，静置管子1-2min，吸走残余液体。

5. 加入无血清DEME充分溶解慢病毒沉淀。

6. 病毒悬液分装成200μl每份,保存在离心管中，速冻后储存在-80 ℃。