病毒的分离方法.doc
病毒的超速离心纯化
病毒的超速离心纯化实验目的超速离心法纯化A型禽流感病毒。
实验原理不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
此法的优点是：（1）分离效果好，可一次获得较纯颗粒；（2）适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；（3）颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。
实验设备和材料专用的超离管、蔗糖配置管，长注射器（以上器材用酒精浸泡过夜，烘干待用）操作步骤蔗糖密度梯度的配制：用已高压的去离子水配制不同浓度的蔗糖，并用22 um滤器过滤。
蔗糖梯度柱长度一般为12 cm，每个梯度蔗糖层长约3 cm即蔗糖溶液体积为3 mL左右，病毒粒子停留的蔗糖密度层应该适当的增大，每个梯度蔗糖所配总体积为20 mL，不需要100 mL。
30%蔗糖溶液配制：去离子水中加入30 g蔗糖，定容到100 mL即可。
1. 病毒的增殖使用SPF鸡胚接毒，共收集150 mL左右病毒尿囊液。
具体如下：取37 ℃培养的9～11日龄SPF鸡胚15个左右。
向各尿囊腔中接种0.2mL储存的AIV（接种病毒液是否需要稀释，应根据病毒毒力的强弱以及实验需求而定。
此法是为增殖病毒，假若接种强毒，则需要根据毒力稀释相应倍数，以便能增殖更多病毒，于37 ℃下继续孵育，每隔12 h照胚一次，弃掉24 h内死亡鸡胚。
24 h后的死胚放4℃过夜，HA 效价7孔，收集尿囊液，直到96 h后收获剩下鸡胚尿囊液，不同时段收集的尿囊液可混合在一起，暂时存放可放-20℃，长时间存放则放于-40℃或-80℃。
2. 取反复冻融后的病毒液10 mL，在10000 r/min、4℃下离心30min，留上清，并测上清HA。
3. 超离：把已经离心处理好的病毒尿囊液装入超离管（实验室超离管体积为30 mL），超离管内不能有气泡，以免超离过程爆破。
离心转速根据病毒粒子直径而定，新城疫病毒尿囊液以40000 r/min 4℃下离心5 h。
〖医学〗流感病毒的分离鉴定
(2)取尿囊液0．1mL,作1：10稀释。
(3)取10支小试管，按给各管参加生理盐水。
(4)取1：10稀释的尿囊液0．2mL，加人第1个试管 中，混匀后，再吸出0．2mL参加第2个试管中； 混匀后，从第2个试管吸出0．2mL参加第3个试 管……依次作倍比稀释至第九管，混匀后自第9 个试管中取出0．2mL弃掉。这样各管液体量均 为0．2mL，从第1-9个试管的尿囊液稀释度为 1:20，1:40，…，1:5120，第10个试管为生理 盐水对照管。
+－
－
－
→→ → → → → → →→
㈠ ㈡ ㈢ ㈣ ㈤㈥ ㈦ ㈧ ㈨㈩
试管号 10
12 3 4 5
67
8
9
生理盐水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
0.2
病毒液 (1:10) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
弃0.2
病毒稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 对照
不 管 是 中 医学 还是西 医学， 从二者 现有的 思维方 式的开 展趋势 来看， 均是走 向现代 系统论 思维， 中医药 学理论 与现代 科学体 系之间 具有系 统同型 性，属 于本质 相同而 描述表 达方式 不同的 两种科 学形式 。可望 在现代 系统论 思维上 实现交 融或统 一，成 为中西 医在新 的开展 水平上 实现交 融或统 一的支 撑点， 希冀籍 此能给 中医学 以至生 命科学 带来良 好的开 展机遇 ，进而 对医学 理论带 来新的 革命。 编 辑 本 段 现 代中医 史
病毒的分离培养标准操作规程
病毒的分离培养标准操作规程1．目的：规范病毒分离及鉴定培养操作流程，保证试验结果的重复性和稳定性。
2．术语：EID50/0.1ml，ELD50/0.1ml，TCID50/0.1ml，CPE3．操作程序与方法：3.1 采样：对于病死或剖杀动物，采集病毒主要聚集组织部位，一般为淋巴结、脾脏、肺脏、血液等；对于活体动物，可用无菌棉拭子采集含病毒量最多部位（口腔、鼻腔、生殖道、肛门等）的分泌液。
采集样品如不能立即处理，应冻存与-20℃备用。
长途运输应用冰盒或4℃低温保存。
3.2 样品处理：组织块可用剪刀剪碎并研磨，加入10倍体积含300-500UI/ml青、链霉素的生理盐水（PBS），反复冻融2-3次。
棉拭子可直接混于3-5倍体积含300-500UI/ml 青、链霉素的生理盐水（PBS），反复冻融2-3次。
8000rpm离心15min，取上清液用0.22μm滤膜过滤，透过液即为病毒原液，收集保存，短期保存4℃，长期保存用液氮。
3.3接种培养：将病毒原液接种与特定细胞单层中，连续盲传4-6代，观察细胞是否产生特异性CPE，并计算及TCID50/0.1ml。
禽源类病毒可接适当日龄鸡胚或鸡胚成纤维细胞进行扩增和鉴定，并计算及EID50/0.1ml和ELD50/0.1ml。
3.4 病毒纯化：采用“有限梯度稀释法”结合“噬斑纯化法”对病毒进行纯化；3.5 动物回归实验：分离培养并纯化好的病毒回归接种动物，观察动物病变是否为该病毒引起及病变特征是否典型。
3.6分子生物学鉴定：基因组提取并设计特异性引物，对分离病毒保守区基因片段进行特异性扩增，并测序，从分子水平对其进行鉴定。
3.7血清学鉴定：用标准阳性血清与分离病毒作用一段时间后再次接种特异性细胞或鸡胚验证病毒特异性。
或者用荧光标记抗体与病毒作用后荧光显微镜下观察其特异性。
4.注意事项4.1采样过程应做好自身防护，烈性病不得随意分离。
4.2 实验动物应及时焚烧或深埋等处理，避免病毒扩散到环境中。
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定简介：病毒是一种微生物，属于病原体的一种。
它可以寄生于宿主细胞中，并利用宿主细胞的代谢系统繁殖。
为了进行研究和控制病毒的传播，科学家们需要对病毒进行分离和鉴定。
本文将介绍病毒的分离和鉴定的方法和步骤。
一、病毒的分离病毒的分离是指将病毒从混合物中单独提取出来。
以下是一些常用的病毒分离方法：1. 细胞培养法：这是一种常用的病毒分离方法。
首先，将病毒样本接种到细胞培养基中培养，待病毒感染细胞后，观察细胞形态的改变、病毒颗粒的释放等现象，进而证实病毒的存在。
2. 动物接种法：这是一种直接将病毒样本接种到实验动物体内的方法。
通过观察动物是否出现病征，如发热、无食欲等，可以初步判断病毒的存在。
3. 超速离心法：这是一种利用离心的原理将病毒从样本中分离出来的方法。
通过对病毒样本进行一系列的离心操作，可以使病毒沉积于管底，从而得到纯净的病毒悬液。
二、病毒的鉴定病毒的鉴定是指确定分离的病毒属于哪一种或某一类病毒的过程。
以下是一些常用的病毒鉴定方法：1. 电子显微镜观察法：使用电子显微镜观察病毒的形态、结构和大小等特征。
这种方法可以给出病毒的直接信息，帮助科学家们确定病毒的种类。
2. 免疫学方法：通过免疫学方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光等，检测病毒与抗体的特异性反应。
根据反应结果，可以初步鉴定病毒的种类。
3. 分子生物学方法：利用PCR、基因测序等分子生物学方法，可以对病毒样本进行基因分析，进一步确认病毒的物种。
这些技术可以检测病毒的基因序列，通过与已知病毒的序列进行比对，鉴定病毒的种类和亲缘关系。
结论：病毒的分离和鉴定是研究和控制病毒传播的重要步骤。
通过适当的分离方法，可以有效地将病毒从样本中提取出来，并通过鉴定方法确定病毒的种类和特性。
病毒的分离和鉴定是研究和治疗病毒相关疾病的基础，也为疾病的监控和防控工作提供了重要的支持。
注意，为了确保实验室安全，病毒的分离和鉴定应在合适的实验条件下进行，并且遵循相关的实验规范和操作流程。
流感病毒分离标准操作规程
流感病毒分离标准操作规程(SOP)病毒分离分离病毒是诊断病毒性疾病最常用,并且高度敏感的方法之一。
分离出的病毒须经免疫学、基因分析或电子显微镜等进一步鉴定确诊。
病毒可长期保存,亦可用来作抗原性、基因特性或药物敏感性等分析。
病毒分离亦受一定限制。
目前用于分离病毒的组织细胞种类有限,每种细胞只能用来分离培养一或数种病毒。
MDCK(狗肾细胞)是目前用于分离培养流感病毒最常用的细胞系。
分离流感病毒最常用的活体是鸡胚,目前有些实验室用MDCK细胞代替鸡胚分离培养流感病毒。
由于MDCK细胞属肿瘤细胞系,故用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。
各实验室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒,不应放弃用鸡胚分离病毒的方法。
流感病毒细胞分离标准操作规程材料:1、细胞瓶或细胞管培养成片的MDCK细胞2、TPCK处理胰酶(牛胰腺来源XIII型)Sigma Cat. # T-86423、HEPES 缓冲液, 1 M 母液GIBCO BRL Cat. # 15630-0234、D-MEM培养基,GIBCO BRL Cat. # 11965-0925、青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素G; 10,000 μg/ml 硫酸链霉素) ,GIBCO BRL Cat. # 15140-0236、牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液,GIBCO BRL Cat. # 15260-0117、放置于2ml wheaton 小瓶中的临床样品8、T-25培养瓶用于病毒培养,(组织培养管也可被应用,若样本量大的话应选用培养瓶,细胞数量按规定调整。
)9、1ml 滴管10、10ml 滴管培养基和试剂的准备:(建议:要求经常检查试剂使用的有效期)500 ml D-MEM液中加入:青、链霉素母液5 ml (终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 100 μg/ml 链霉素) 牛血清白蛋白12.5 ml (终浓度: 0.2 %)HEPES缓冲液12.5 ml (终浓度: 25 mM)病毒生长液:每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶(母液浓度为2mg/ml )使TPCK-胰酶的浓度为2 μg/ml。
流感病毒的分离技术操作规范
流感病毒的分离技术操作规范病毒分离培养是流感样病例病原学监测的基础，是流感病毒检测最常用和最可靠的方法之一。
目前多采用鸡胚和MDCK细胞进行流感病毒分离。
通过鸡胚分离的流感毒株与原始标本的抗原性和基因特性可能会有所不同，而通过MDCK细胞所分离的流感病毒与原始标本相似。
另外由于“0”相毒株的重现，MDCK细胞对“0”相毒株的敏感性远高于鸡胚，所以MDCK细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。
但是目前全球主要使用鸡胚进行流感疫苗生产，MDCK分离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此鸡胚分离仍然发挥着举足轻重的作用。
具备流感病毒分离能力的流感监测网络实验室收到哨点医院的常规监测标本后，要求利用状态良好的MDCK细胞和（或）鸡胚进行病毒分离。
若同时进行MDCK细胞和鸡胚分离，为减少工作量，可先用MDCK 细胞对原始标本进行筛选，MDCK细胞病毒分离结果为阳性后，再将另外一份-70℃或以下温度保存的原始标本进行鸡胚双腔接种（羊膜腔和尿囊腔），进行病毒分离。
（-）实验室生物安全级别和生物安全规定1.流感病毒分离实验室生物安全级别：季节性流感病毒和2009甲型H1N1流感病毒生物安全二级；高致病性禽流感病毒生物安全三级。
2.流感病毒分离实验室生物安全规定应当遵守生物安全实验室的有关生物安全的规定。
（二）流感病毒的细胞分离标准操作规程（所列试剂生产厂家及货号仅供参考）1.试验材料（1）刚75-90%成片的MDCK细胞，T-25细胞瓶（2）TPCK处理胰酶（牛胰腺来源VIiI型）（S1GMAT8802）（3）HEPES缓冲液,IM母液（4）D-MEM培养基（高糖，含有1-谷氨酰胺），Hank,s 液（5）青、链霉素母液（10,000U∕m1青霉素G,10,000μg∕m1硫酸链霉素）（6）牛血清白蛋白组分V,7.5%溶液（G1BCOCatNo15260）（7）处理好的临床标本0.5m1（标本处理参见附件1第一部分）（8）无菌移液管：Im1和Iom12.培养基和试剂的准备（建议：经常检查试剂的有效期）（1）50Om1D-MEM液中加入：a）青、链霉素母液5m1（终浓度达：100U∕m1青霉素和100μg∕m1链霉素）b）牛血清白蛋白组分V12.5m1（终浓度025%）c）HEPES缓冲液12.5m1（终浓度:25mM）d）加入7.5%NaHCO310-15m1（终浓度：2-3%）（2）病毒生长液：再向上述培养液中每50Om1加入0.5m1的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg∕m1）使TPeK-胰酶的浓度为2μg∕m103.流感病毒MDCK细胞分离程序所有有关流感病毒分离的操作都应在相应生物安全级别的实验室中进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定，做好个人防护要求。
病毒的分离培养方法
病毒的分离培养方法病毒的分离培养是研究病毒性疾病、病毒结构和功能、病毒生物学特性的重要手段。
病毒是一种非细胞微生物，无法在无细胞环境中生长和繁殖，必须依赖于寄主细胞来完成其生命周期。
因此，病毒的分离培养方法主要是利用其对特定细胞的感染能力，通过培养和增殖来获取纯净的病毒制备。
首先，病毒的分离培养需要获得感染病毒的组织或细胞，这些组织或细胞通常是患者的血液、组织样本或培养细胞。
在获得样本后，需要进行样本的处理和制备。
通常的处理方法包括离心、滤过、稀释等步骤，以去除细胞碎片、细菌等杂质，获得纯净的病毒颗粒。
其次，病毒的分离培养需要选择合适的寄主细胞进行培养。
不同的病毒对细胞有不同的选择性，因此需要根据病毒的特性选择合适的细胞系。
常用的细胞系包括Vero细胞、MDCK细胞、A549细胞等。
将处理后的样本接种到寄主细胞上，让病毒感染细胞并进行增殖。
接着，病毒的分离培养需要进行病毒的纯化和扩增。
通过离心、超速离心、密度梯度离心等方法，可以将病毒颗粒从细胞碎片、蛋白质等杂质中分离出来，获得纯净的病毒制备。
然后，将纯净的病毒制备接种到新的寄主细胞中，进行扩增和增殖。
最后，病毒的分离培养需要对病毒进行鉴定和检测。
通过电镜观察病毒的形态特征，利用免疫学方法检测病毒的抗原，进行核酸检测等手段，可以对病毒进行鉴定和检测，确定其种属和特性。
总之，病毒的分离培养是一项复杂而重要的实验技术，对于病毒学研究和病毒性疾病的防控具有重要意义。
掌握病毒的分离培养方法，可以为病毒学研究提供纯净的病毒制备，为病毒性疾病的诊断和防控提供重要的实验支持。
希望本文介绍的病毒的分离培养方法对您有所帮助。
PEG沉淀法-病毒提纯方法
1. Viruses such as baculovirus can be concentrated by polyethylene glycol precipitation.2. Adjust the pH of the virus-containing supernatant to 7.2-7.5. Polyethylene glycol (PEG, MW 6,000) is added to a final concentration of 8% (w/v).3. Stir at 4℃for 2 hours.4. Centrifuge at 10,000 x g for 2 hours.5. Resuspend the pellet in a small volume of appropriate buffer ( e.g., RNase-free ddH2 for virus RNA prep).沉淀法-病毒提纯方法主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。
1.中性盐沉淀法：病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。
在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。
2.聚乙二醇沉淀法：聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是分子量为2 000～6000的PEG。
将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，通常在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。
Tanncock(1985年) 成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。
3.有机溶剂沉淀法：甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。
病毒的分离方法.doc
病毒的分离方法一般情况下分离病毒可以用传代细胞、原代细胞或者直接用动物接种或者鸡胚接种，只有在找不到适合病毒生长的原代细胞或者传代细胞的情况下才运用动物接种或者鸡胚接种的方法分离病毒。
大致过程应该是这样的：第一获取病毒分离样品，这个要求比较高，采集后如果不能立即操作则必须低温保存，并尽快送实验室操作。
另外也可以冷冻保存，一般情况下病毒是不容易冻死的。
当然某些特殊病毒除外，这需要查阅相关资料。
第二病毒分离操作，将获取病样研磨，并冻融至少一次，当然研磨过程中必须低温。
同时研磨应充分，在研磨时可以加入生理盐水或PBS或者直接加细胞培养液，研磨完全后冻融一到三次，冻融的目的是为了让细胞完全破裂将细胞内的病毒释放到溶液中。
然后低速离心，取上清用0.22微米的滤膜过滤，去过滤后的液体接种细胞。
此时须注意，并不是所有病毒接种是都需要让细胞完全长满细胞瓶，一般是不能产生细胞病的病毒最好在细胞长到40%左右接种，而能产生细胞病变的则需要完全长满细胞瓶以后再接种病毒。
接种过程中为避免污染可以加入双抗，或者其他抗生素。
第三接种后观察，某些能产生细胞病变的病毒很容易观察，直接在显微镜下就能看是否分离成功；如果病毒不产生细胞病变，则需要用其他的方法来检测，比如可用荧光抗体染色、PCR或者其他方法。
不过大部分情况下第一代都不容易看到或者效果不好，这时你可以再传几代试试。
如果再传四~五代以后都没有的话，那恭喜你，你失败了，或者你的方法有问题，或者根本就没有你要分离的病毒，或者在分离过程中你的病毒就已经死了。
用细胞分离病毒大概就是这个过程，当然某些病毒可能还没有相应的传代或者原代细胞，如果要分离就只能用易感动物了，操作都是相似的，无非都是采样、样品处理、接种、接种后检测观察、收集病毒而已。
上面说到的方法都是从动物组织中分离，当然如果不是组织，比如你要从粪便或者尿液或取的拭子上分离，则可直接将其用生理盐水、PBS或细胞培养液稀释（要尽量摇匀如果是拭子的话应多挤压摇匀）然后离心取上清过滤接种细胞就可以了。
病毒分离前样品的实验室处理方法
病毒含量较高的样品浸出液或体液，可不经过病毒分离直接用于诊断鉴定。
病毒含量较少的样品，则需通过病毒的分离增殖来提高诊断的准确性和鉴定的可靠性。
病毒分离首先要对样品进行适当的处理，然后接种实验动物或培养的组织细胞。
(一) 组织器官样品的处理1.用无菌操作取一小块样品，充分剪碎，置乳钵中加玻璃砂研磨或用组织捣碎机制成匀浆，随后加1-2 ml Hank’s平衡盐溶液制成组织悬液，再加1-2 ml继续研磨，逐渐制成10%-20%的悬液；2.加入复合抗生素；3.以800×g离心15min；4.取上清液用于病毒分离。
必要时可用有机溶剂去除杂蛋白和进行浓缩（见下文）。
(二) 粪便样品的处理1.加4g的粪便于16ml Hank’s平衡盐容液中制成20%的悬液；2.于密闭的容器中强烈振荡30min，如果可能则加入玻璃球；3.以6000×g低温离心30min，取上清液再次重复离心；4.用450nm的微孔滤膜过滤；5.加二倍浓度的复合抗生素。
然后直接用于病毒分离或进行必要的浓缩后再行病毒分离。
(三) 无菌的体液（腹水、脊髓液、脱纤血液、水泡液等）和鸡胚液样品可不做处理，直接用于病毒分离。
注：Hank’s平衡盐溶液和复合抗生素的配制见细胞培养溶液的配制。
(四) 样品的特殊除菌处理样品经过上述一般处理即可用于病毒分离，但对某些样品用一般方法难以去除的污染，则应考虑配合如下方法进行处理。
1.乙醚除菌对有些病毒（如肠道病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、小RNA病毒等对乙醚有抵抗力）可用冷乙醚对半加入样品悬液中充分振荡，置4℃过液。
取用下层水相分离病毒。
2.染料普鲁黄（Proflavin）除菌由于其对肠道病毒和鼻病毒很少或没有影响，常用作粪或喉头样品中细菌的光动力灭活剂。
将样品用0.0001mol/L pH9.0的普鲁黄于37℃作用60min，随后用离子交换树脂除去染料，将样品暴露于白光下，即可使其中已经被光致敏的细菌或霉菌灭活。
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定病毒是一类微小的病原体，其特点是不能自主繁殖，必须寄生在宿主细胞内才能完成复制过程。
为了有效地控制和治疗病毒引起的疾病，研究人员需要对病毒进行分离和鉴定。
本文将介绍病毒的分离与鉴定的方法和步骤。
一、病毒的分离方法1. 细胞培养法：病毒通常寄生于宿主细胞内，通过培养宿主细胞，可以将病毒从样本中分离出来。
这种方法适用于许多病毒，如流感病毒、乙肝病毒等。
2. 动物接种法：某些病毒只能在特定宿主动物中复制，通过向实验动物接种疾病样本，可以使病毒复制并分离出来。
例如，用小鼠进行实验可以分离出小鼠肝炎病毒等。
3. 组织切片法：对于某些病毒，它们会引起组织的明显病变，此时可以取得感染组织的切片进行病毒分离。
例如，用患病动物的脑组织切片进行病毒分离，可用于研究狂犬病病毒等。
二、病毒的鉴定方法1. 电镜观察法：电子显微镜（TEM）可以观察到病毒的形态和结构特征，通过观察病毒的颗粒形状、大小、壳结构等特征，可以初步确定病毒的种类。
2. 免疫学方法：根据病毒与宿主细胞之间的免疫反应，可以采用免疫学方法进行病毒鉴定。
包括免疫荧光法、酶联免疫吸附试验（ELISA）等，可以检测病毒的抗原或抗体存在。
3. 分子生物学方法：利用PCR（聚合酶链式反应）技术、序列分析等分子生物学方法，可以对病毒的基因组进行检测和鉴定。
这些方法对于那些无法用传统手段鉴定的病毒，如新型冠状病毒等，具有重要意义。
4. 勒芒氏法：这是一种用于病毒核酸的立体构建鉴定方法。
勒芒氏法根据病毒核酸在Denhardt液中染色的不同程度进行鉴定。
在进行病毒的分离与鉴定时，研究人员需要注意采取适当的实验室安全措施，避免交叉感染和意外暴露。
此外，病毒的分离与鉴定是一个复杂的科研过程，需要综合运用各种实验技术和方法，推动疾病防控工作的进展。
总结起来，病毒的分离与鉴定是关键的实验工作，它们为了研究病毒的性质、传播途径以及寻找有效的防治策略提供了基础性的支持。
病毒的分离培养方法
病毒的分离培养方法
病毒的分离培养是一项重要的实验技术，它可以帮助科研人员更好地了解病毒的特性和行为，为疾病的防控和治疗提供重要的参考。
在进行病毒的分离培养时，需要严格按照一定的步骤和方法进行操作，以确保实验的准确性和可靠性。
首先，进行样本的采集和处理。
样本的选择和采集是进行病毒分离培养的第一步，科研人员需要根据研究的目的和对象选择合适的样本来源，如血液、组织、分泌物等，并严格按照规范的操作流程进行采集和处理，以避免样本受到外界污染或损坏。
其次，进行病毒的分离。
病毒的分离是指将样本中的病毒与其他细胞或微生物分离开来，以便进行后续的培养和研究。
常用的方法包括离心、过滤、离心梯度离心等，科研人员需要根据具体的研究要求选择合适的分离方法，并严格按照操作规程进行实验操作。
接下来是病毒的培养。
病毒的培养是指将已经分离出的病毒在适宜的生长条件下进行增殖和繁衍，以获取足够的病毒量进行后续的研究。
常用的培养方法包括细胞培养、动物体内培养等，科研人员需要根据病毒的特性和研究需要选择合适的培养方法，并严格控
制培养条件，确保病毒的生长和繁殖。
最后，是对培养得到的病毒进行鉴定和纯化。
病毒的鉴定和纯
化是研究病毒特性和行为的重要步骤，科研人员需要借助于生物学、生物化学和分子生物学等技术手段对培养得到的病毒进行鉴定和纯化，以获取纯净的病毒制备物进行后续的研究和应用。
总之，病毒的分离培养是研究病毒学的重要手段，科研人员在
进行病毒的分离培养时，需要严格按照规范的操作流程进行实验操作，确保实验的准确性和可靠性，为疾病的防控和治疗提供重要的
科学依据。
病毒的研究方法
可编辑ppt
11
1、负染色法
用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载 网上的样品进行染色。
肌动蛋白纤维的负染电镜照片
可编辑ppt
12
2、超薄切片技术
通常以锇酸和戊二 醛固定样品，以环 氧树脂包埋，以热 膨胀或螺旋推进的 方式推进样品切片， 切片厚度20~50nm， 切片采用重金属盐 染色，以增大反差.
原代和次代细胞培养：分离病毒最为敏感 二倍体细胞 ：用于病毒分离和疫苗制备 传代细胞系 ：用于病毒的分离鉴定和抗病
毒药物筛选研究。 病毒基因转染细胞系：用于病毒基因调控
和抗病毒药物的研究。
可编辑ppt
19
可编辑ppt
20
常用的细胞培养
类型
原代细胞培养
二倍体细胞株
传代细胞系
名称
恒河猴肾细胞培养，人胚肾、肺等细胞培养， 鸡胚成纤维细胞培养
可编辑ppt
25
四、血清学方法
▪ 中和试验：适用于病毒鉴定，机体中抗体 的检测，分析病毒抗原的性质，疫苗接种 效果评估等
▪ 补体结合试验
▪ 血凝抑制试验：常用于正粘病毒和副粘病 毒感染的诊断和病毒亚型鉴定及抗原变异 的监测，如流感病毒的分型
▪ 酶联免疫吸附试验
▪ 放射免疫试验免疫荧光检测
可编辑ppt
26
五、病毒学研究常用方法
▪ 聚合酶链反应（PCR） ▪ 转印杂交 ：Southern blot、Nouthern
blot和Westhern blot ▪ 蛋白质组学：肽图谱 ▪ 基因组学：核酸序列测定及基因功能 ▪ 基因工程 ：抗病毒疫苗或抗病毒的大分子
多肽 、病毒载体
可编辑ppt
27
病毒粒子三维重构模型 可编辑ppt
病毒分离培养的细胞培养法
第18章病毒分离培养的细胞培养法一、细胞培养用于病毒研究的优点：细胞培养在病毒学方面的研究最为广泛，除用作病毒的病原分离外，还可研究病毒的繁殖过程及其细胞的敏感性和传染性（细胞的病理变化及包涵体的形成）。
观察病毒传染时细胞新陈代谢的改变，探讨抗体与抗病毒物质对病毒的作用方式与机制，以及研究病毒干扰现象的本质和变异的规律性，可用于病毒的分离鉴定，抗原的制备及疫苗，干扰素的生产、病毒性疾病诊断和流行病学调查等。
近年来，可用于繁殖病毒载体以用于基因治疗。
应用细胞培养来研究病毒有下列优点：1、没有隐性感染：动物可能带有某些病毒的隐性感染，往往有干扰作用和假阳性出现。
细胞培养一方面是来源于动物部分组织，减少了隐性感染的机会，另一方面组织培养细胞可进行预先检查而加以克服。
2、没有免疫力：动物经隐性感染获得免疫力，对接种病毒会发生抵抗，但由于后天免疫一般不表现在细胞抵抗力的增加，因此离体细胞无免疫力，利于病毒生长。
3、容易选择易感细胞：细胞来源方便，可供作病毒敏感性的筛选，可以从中选择最敏感的细胞以满足实验要求，同时还利于从单一细胞水平上研究病毒的繁殖过程和病毒一细胞的相互关系。
4、接种量大：动物和鸡胚的接种均受数量、年龄、途径的限制，细胞不仅可以大量生产，而且还可较久地持续培养，便于病毒生长，特别是对那些生长缓慢或需在新环境中逐渐适应的病毒更为有利。
5、培养条件易于控制：由于细胞培养可以用人工控制温度、气体、pH、培养基成分，因此可采用大规模生产方式来生产细胞和病毒及其细胞产物。
6、提高了疫苗的产量和质量：细胞的大量生产可满足疫苗产量的需求，而且异性蛋白少，引起变态反应机会少。
疫苗中污染菌少或无，可随制随用，成本低，来源方便，便于贮存，且效力均匀，易标准化。
7、加速病毒分离过程：病毒分离采用细胞培养不仅阳性率高，而且分离过程可显著加速早出结果，但应用对该病毒敏感的细胞。
二、用细胞培养分离病毒(一)接种标本的处理：1、粪便标本：用于分离肠道病毒之粪便标本放入装玻璃珠40ml沉淀管内，大约每2克粪便用15ml Hanks液稀释(其余粪便于-20℃保存备用)，用橡皮塞紧后剧烈振摇，使粪便乳化，经2500r/min沉淀15分钟后，按将上清用无菌八层纱布过滤，于4℃以10000r/min沉淀1小时再取其上清，1.8ml加入0.2ml抗菌素液进行处理(浓度为25000u/ml的双抗及250mg/L二性霉素B)剩下的悬液保存于-20℃备用。
病毒的分离培养方法
病毒的分离培养方法病毒的分离培养是病毒学研究的重要一环，它可以帮助科研人员更好地了解病毒的生物学特性、病原学特性以及对宿主的影响。
下面将介绍一些常用的病毒分离培养方法。
首先，病毒的分离培养需要选择合适的宿主细胞。
宿主细胞的选择应该考虑到病毒的种类和特性，一般来说，常用的宿主细胞有Vero细胞、MDCK细胞、BHK-21细胞等。
在选择宿主细胞时，需要考虑到它们的易培养性、对病毒的感染性以及是否能够支持病毒的复制和增殖。
其次，病毒的分离培养需要合适的培养基。
培养基的选择应该考虑到宿主细胞的营养需求和病毒的生长特性，一般来说，常用的培养基有DMEM培养基、MEM 培养基、RPMI-1640培养基等。
在选择培养基时，需要考虑到它们的成分、pH值、渗透压等因素，以保证宿主细胞和病毒能够在培养基中正常生长和复制。
接着，病毒的分离培养需要合适的培养条件。
培养条件的选择应该考虑到病毒的生长特性和宿主细胞的生长条件，一般来说，常用的培养条件有37摄氏度的恒温培养箱、5%二氧化碳培养箱、含有适当浓度的抗生素和抗真菌药物的培养基等。
在选择培养条件时，需要考虑到它们对宿主细胞和病毒的影响，以保证它们能够在适宜的环境下正常生长和复制。
最后，病毒的分离培养需要合适的检测方法。
检测方法的选择应该考虑到病毒的特性和宿主细胞的特性，一般来说，常用的检测方法有免疫荧光法、PCR法、ELISA法等。
在选择检测方法时，需要考虑到它们的灵敏度、特异性以及操作简便性，以保证能够准确地检测到病毒的存在和数量。
总之，病毒的分离培养是病毒学研究中的重要一环，它需要选择合适的宿主细胞、培养基、培养条件和检测方法，以保证能够准确地分离和培养病毒。
希望以上介绍的方法能够对病毒学研究人员有所帮助。
病毒分离培养的方法
1.动物接种这是最原始的病毒培养方法。
常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔和猴等，接种的途径有鼻内、皮下、皮内、脑内、腹腔内、静脉等。
根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位。
2.鸡胚接种鸡胚对多种病毒敏感。
根据病毒种类不同，可将标本接种于鸡胚的羊膜腔、尿囊腔、卵黄囊或绒毛尿囊膜上。
3.组织培养将离体活组织块或分散的活细胞加以培养，统称为组织培养。
组织培养法有三种基本类型：器官培养、移植培养和细胞培养。
细胞培养最常用于培养病毒，根据细胞的来源，染色体特性及传代次数又可分为下列类型：原代和次代细胞培养，二倍体细胞株和传代细胞系。
禽腺病毒Ⅰ群分离、鉴定方法
禽腺病毒Ⅰ群分离、鉴定方法作者：杨作丰来源：《湖北畜牧兽医》2017年第02期摘要：禽腺病毒Ⅰ群（FAV-Ⅰ）是一种双链DNA病毒，病毒对外界环境耐受较强，并有水平传播及垂直传播两种传播方式，近年来在国内呈暴发式流行，各地养殖场均有报道检测到FAV-Ⅰ，FAV-Ⅰ对养殖业造成严重损失。
分离、鉴定FAV-Ⅰ的毒株类型是防控此病的基础。
除传统的检测方法外，近年新兴了多种检测技术，对这些分离、鉴定方法进行了概述。
关键词：禽腺病毒Ⅰ群；分离；鉴定中图分类号：S858.3 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2017）02-0005-03近年来禽腺病毒病在我国发病率日益升高，给养殖业造成巨大损失。
感染禽腺病毒的家禽21 d内死亡率高达30%，禽腺病毒病的防治成为迫要需要解决的问题[1]。
禽腺病毒是一种DNA病毒，能够引起鸡群禽腺病毒感染，是一种亚临床性传染病，感染鸡群通常为症状不明显的隐性感染，并长期带毒[2]。
根据病毒群特异性抗原的不同将其分为三群：禽腺病毒Ⅰ群（FAV-Ⅰ）、禽腺病毒Ⅱ群、禽腺病毒Ⅲ群。
FAV-Ⅰ主要包括传统的腺病毒以及从其他禽类分离出的腺病毒分离株，这些腺病毒毒株具有相同的抗原群；禽腺病毒Ⅱ群主要是包括火鸡出血性肠炎及鸡大脾病毒，这些病毒具有和FAV-Ⅰ不同的抗原群；禽腺病毒Ⅲ群主要是产蛋综合征相关的病毒。
据报道FAV-Ⅰ能引起心包涵体炎、心包积水-肝炎综合征等传染病[3]。
FAV-Ⅰ病毒可分为A、B、C、D、E、F五个种和12个血清型[4]。
禽腺病毒的潜伏期较短，鸡日龄越小越易感染FAV-Ⅰ，成年鸡也可感染，通常没有明显症状但是能够作为混合感染时的条件性病原，在一定条件下部分禽腺病毒也能够作为原发性病原，引发禽类的多种病症[5]。
禽腺病毒能够通过鸡的排泄物排出，正常鸡接触后极易感染，并且禽腺病毒还能通过蛋垂直传播。
报道称FAV-Ⅰ对宿主具有高度的特异性，只有少数的病毒能够感染宿主以外的动物。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
病毒的分离方法
一般情况下分离病毒可以用传代细胞、原代细胞或者直接用动物接种或者鸡胚接种，只有在找不到适合病毒生长的原代细胞或者传代细胞的情况下才运用动物接种或者鸡胚接种的方法分离病毒。
大致过程应该是这样的：
第一获取病毒分离样品，这个要求比较高，采集后如果不能立即操作则必须低温保存，并尽快送实验室操作。
另外也可以冷冻保存，一般情况下病毒是不容易冻死的。
当然某些特殊病毒除外，这需要查阅相关资料。
第二病毒分离操作，将获取病样研磨，并冻融至少一次，当然研磨过程中必须低温。
同时研磨应充分，在研磨时可以加入生理盐水或PBS或者直接加细胞培养液，研磨完全后冻融一到三次，冻融的目的是为了让细胞完全破裂将细胞内的病毒释放到溶液中。
然后低速离心，取上清用0.22微米的滤膜过滤，去过滤后的液体接种细胞。
此时须注意，并不是所有病毒接种是都需要让细胞完全长满细胞瓶，一般是不能产生细胞病的病毒最好在细胞长到40%左右接种，而能产生细胞病变的则需要完全长满细胞瓶以后再接种病毒。
接种过程中为避免污染可以加入双抗，或者其他抗生素。
第三接种后观察，某些能产生细胞病变的病毒很容易观察，直接在显微镜下就能看是否分离成功；如果病毒不产生细胞病变，则需要用其他的方法来检测，比如可用荧光抗体染色、PCR或者其他方法。
不过大部分情况下第一代都不容易看到或者效果不好，这时你可以再传几代试试。
如果再传四~五代以后都没有的话，那恭喜你，你失败了，或者你的方法有问题，或者根本就没有你要分离的病毒，或者在分离过程中你的病毒就已经死了。
用细胞分离病毒大概就是这个过程，当然某些病毒可能还没有相应的传代或者原代细胞，如果要分离就只能用易感动物了，操作都是相似的，无非都是采样、样品处理、接种、接种后检测观察、收集病毒而已。
上面说到的方法都是从动物组织中分离，当然如果不是组织，比如你要从粪便或者尿液或取的拭子上分离，则可直接将其用生理盐水、PBS或细胞培养液稀释（要尽量摇匀如果是拭子的话应多挤压摇匀）然后离心取上清过滤接种细胞就可以了。