1105非无菌产品微生物限度检查微生物计数法
752015年药典 通则1105 非无菌产品微生物限度检查
752015年药典通则1105 非无菌产品微生物限度检查通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数；微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和；微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求；如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和；供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生；计数方法；计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Mo；供试品检查时,应根据供试品理化特性和微生物限度标；计数培养基适用通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-Number Method，简称MPN 法）。
MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN 法可能是更适合的方法。
供试品检查时,应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(15版中国药典公示稿)
胰酪大豆胨 琼脂培养基 和胰酪大豆 胨液体培养 基，培养温 度 30 ～ 35℃，培养 时间不超过 3 天，接种 量不大于 100cfu
胰酪大豆胨 琼脂培养基 / 胰酪大豆 胨液体培养 基 （ MPN 法），培养 温 度 30 ～ 35 ℃ ， 培 养 时间不超过 3 天，接种量 不大于 100cfu
计数培养基适用性检查 计数方法适用性试验
试验菌株
试验菌液 的制备
需氧菌总数 计数
霉菌和酵 母菌总数
计数
需氧菌总数 计数
霉菌和酵 母菌总数
计数
金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus
aureus) 〔CMCC(B)26 003)〕
胰酪大豆 胨琼脂培 养基或胰 酪大豆胨 液体培养 基，培养温 度 30 ～ 35℃，培养 时 间 18 ～ 24 小时
获得丰富
的孢子
注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，
检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培过 5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌
种为第 0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学
特性。计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表 1。
胰酪大豆胨 琼脂培养基 （ MPN 法 不 适用），培 养温度 30～ 35 ℃ ， 培 养 时间不超过 5 天，接种量 不大于 100cfu
沙氏葡萄 糖琼脂培 养基，培养 温度 20～ 25℃，培养 时间不超 过 5 天，接 种量不大 于 100cfu
沙氏葡萄 胰酪大豆胨 沙 氏 葡 萄 胰酪大豆胨 沙氏葡萄
糖琼脂培 琼 脂 培 养 糖 琼 脂 培 琼脂培养基 糖琼脂培
黑曲霉
养基或马 基，培养温 养基，培养 （ MPN 法 不 养基，培养
1105非无菌产品微生物限
1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法中菌药典2015年版表3供试品的最少检验量供试品供试品装量每支供试品接人每种培养基的最少量液体制剂^I m llm l<C V^40m l40m K V< 100m lV>100m l全量半量，但不得少于l m l20m l10%但不少于20m l固体制剂M〈50m g50m g^M<C300m g300m g^M<C5g全量半量150m g500m g半量（生物制品）生物制品的原液及半成品半量医疗器具外科用敷料棉花及纱布缝合线、一次性医用材料带导管的一次性医疗器具(如输液袋）其他医疗器具取lOOmg 或lc m X 3cm整个材料①二分之一内表面积整个器具®(切碎或拆散开）①如果医用器械体积过大，培养基用量可在2000m l以上，将其完全浸没。
1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检査。
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检査时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（M ost-P rob a b l e-Numb e r M e tho d,简称MP N法）。
MP N法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，M P N法可能是更适合的方法。
中国药典2015版 四部 9202 非无菌产品微生物限度检查指导原则
为更好应用非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）、非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（通则1106）及非无菌药品微生物限度标准（通则110 7），特制定本指导原则。
非无菌药品中污染的某些微生物可能导致药物活性降低，甚至使药品丧失疗效，从而对患者健康造成潜在的危害。
因此，在药品生产、贮藏和流通各个环节中，药品生产企业应严格遵循GMP的指导原则，以降低产品受微生物污染程度。
非无菌产品微生物计数法、控制菌检查法及药品微生物限度标准可用于判断非无菌制剂及原料、辅料等是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料等微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。
本指导原则将对微生物限度检查方法和标准中的特定内容及应用做进一步的说明。
1. 非无菌产品微生物限度检查过程中，如使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处理有效外，还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出（即无毒性），因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。
2. 供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法应尽量选择微生物计数方法中操作简便、快速的方法，同时，所选用的方法应避免损伤供试品中污染的微生物。
对于抑菌作用较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。
3. 对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适用性检查，以保证药品微生物检验用培养基的质量。
对照培养基由中国食品药品检定研究院研制及分发。
4. 进行微生物计数方法适用性试验时，若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法适用性试验。
此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，最高稀释级供试液的选择根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则而确定，如供试品应符合的微生物限度标准是lg需氧菌总数不得过10 3 cfu，那么最高稀释级是1：10 3 。
《中国药典》2015年版微生物计数法实例
《中国药典》2015年版----微生物计数法实例
中国药典2015年版
1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
• 计数培养基适用性检查 • 供试品计数方法适用性试验
1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法
• 培养基适用性检查 • 控制菌检查方法适用性试验
1107 非无菌药品微生物限度标准
1:10 180 1800
1:100 15 1500
1:1000 3 3000
结果判断 • 101cfu：可接受的最大菌数为
20； • 102cfu：可接受的最大菌数为
200； • 103cfu：可接受的最大菌数为
2000，以此类推。
一个化学口服固体制剂，需 氧菌计数结果见表，报告菌 落数?符合规定，不符合规
计数
• 若同稀释级两个平皿的菌落数 平均值不小于15，则两个平皿 的菌落数不能相差1倍或以上。
• 需氧菌总数测定宜选取平均菌 落数小于300cfu的稀释级，霉 菌和酵母菌总数测定宜选取平 均菌落数小于100cfu的稀释级， 作为菌数报告的依据。取最高 的平均菌落数，计算1g、1mL、 10cm2供试品中所含的微生物 数，取两位有效数字报告。
水不溶性非油脂类供试品
• pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或TSB溶解或稀释成1:10供试液。分散力较差的 供试品可在稀释液中加入表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。必要时进一步稀释。
油脂类供试品
• 取供试品加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌 性的无菌表面活性剂充分混匀。必要时进一步稀释。
菌液 对照组
（菌）
• 取9.9mL稀释液代替供试品，按试验组操作加入试验菌液同试验组试验。
【2020版中国药典】通则-非无菌微生物限度检查
【2020版中国药典】通则-非无菌微生物限度检查1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
学习：将旧版的“相应”更换为“规定”，更便于按照1107进行判定执行。
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
洁净空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
学习：将旧版的“单向流空气区域”更换为“洁净空气区域”。
计数方法
……供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
……
提示：后文增加了对于“贵重药品、微量包装药品”的检验量的更全面的表述，因注意结合此处的要求。
计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验
……菌液制备……取黑曲霉的新鲜培养物加人适量含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或……
学习：此处改动同无菌检查法，将“3~5ml”的具体量调整为“适量”，便于根据孢子的量灵活掌握菌液制备方法。
培养基适用性检查
微生物计数用的商品化的预制培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
学习：类似于无菌检查法，此处将“成品培养基”修改为“商品。
微生物限度检查法标准操作规程
目的建立微生物限度检查法标准操作规程，规操作，保证结果的准确性。
围成品、辅料、包装袋及纯化水的检验。
责任微生物限度检验人员容本检验操作规程依据中国药典2015年版四部《通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》和《通则1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》进行检查。
微生物计数法一、计数方法1、微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
2、计数方法本法包括平皿法、薄膜过滤法。
3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。
4、菌种及菌液的制备4.1试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验。
4.2菌液制备按规定培养各试验菌株。
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时使用；若保存在2-8℃，可在24小时使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期使用。
4.3阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
4.4培养基适用性检查按照表规定，接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置规定的条件下培养。
无菌、微生物限度检查做法精炼
微生物限度检测：（1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法）一般有三种方法：平皿法、薄膜法、MPN法。
样品计数方法的验证：1 培养基适用性的检查TSA :培养的是需氧菌总数，包括真菌。
需要用的金黄色葡萄球菌，（革兰氏阳性菌）铜绿假单胞菌，（革兰氏阴性菌）枯草芽孢杆菌，（细菌中芽孢的代表）白色念珠菌，（酵母菌的代表）黑曲霉。
（霉菌的代表）SDA 霉菌和酵母的总数白色念珠菌，(酵母的代表)黑曲霉。
（霉菌的代表）怎么做呢？在TSA 验证时，每一株菌有4个平皿，试验组2个，对照组2个。
对照组用的是中检院的TSA对照组培养基。
每个皿中接不大于100CFU/ml 的菌。
然后：1摇匀 2 凝固 3 倒置（细菌是单细胞的生物正置会有水滴下来，菌落会蔓延）细菌培养 30-35度培养3d 需要做5种菌（金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌，黑曲霉）真菌培养20-25度培养5d （培养的温度是由培养基的种类决定的，培养的时间是由微生物的种类决定的。
需要做2种菌。
结果：结论被检培养基上菌落的平均数与对照培养基上菌落的平均数的比值在0.5-2范围内合格。
2计数方法的适用性(有抑菌性，导致微生物数减少)微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
Ppc 原理A组供试液（试验组）（供试液加菌液100CFU）2种方法：供试液+（每ml不超过100CFU的菌）平皿法+（每张膜中加入100CFU的菌）薄膜法B 组供试液组对照组供试液（以稀释液代替菌液组操作）C组菌液组菌液每ml 不超过100CFU的菌取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌进行微生物的回收。
(A-B)/C的比值在0.5-2之间。
日常检测检验量：一次试验所用的供试品量（g、ml或cm2）一般为10g或10ml (随机抽取不少于2个最新包装，从两个包装中取)回收率；（修正系数）（用于医疗器械上的微生物的测量，或者是固体需要做的，因为洗脱不完全）第一种：薄膜过滤法（微生物较多的情况，产品直接洗脱法）无菌一、培养基适用性检查 (无菌性和灵敏度)目的:确认培养基的有效性。
1105非无菌产品微生物限度检查微生物计数法
胰酪大豆胨琼脂 培养基和胰酪大 豆胨液体培养基， 培 养 温 度 30 ～ 35℃，培养时间不 超过3 天，接种量 不大于 100cfu
计数方法适用性试验
需氧菌
霉菌和酵母菌
总数Байду номын сангаас数
总数计数
胰酪大豆胨琼脂
培养基或大豆胨
液体培养基（MPN）
法，培养温度 30～
35℃，培养时间不
超过 3 天，接种
量不 大于100cfu
表 1 试验菌液的制备和使用
试验菌株
金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 〔CMCC(B)26
003〕
试验菌液 的制备
胰酪大豆胨琼脂培养 基或胰酪大豆胨液体 培养基，培养温度 30～35℃，培养时间 18～24 小时
计数培养基适用性检查
需氧菌
霉菌和酵母菌
总数计数
总数计数
胰酪大豆胨琼脂
沙氏葡萄糖琼 脂培养基，培养 温度 20～25℃， 培养时间不超 过5 天，接种量 不大于 100cfu
注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基。
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2020 年版第二次征求意见稿
菌种及菌液制备 菌种 试验用菌株的传代次数不得超过 5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第 0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。计数培养基 适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表 1。 菌液制备 按表 1 规定程序培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯 草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无 菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入 3～5ml 适量含 0.0 5％（ml/ml）聚山梨酯 80 的 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液， 将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含 0.05%（ml/ml）聚 山梨酯80 的 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑 曲霉孢子悬液。 菌液制备后若在室温下放置，应在 2 小时内使用；若保存在 2～8℃，可在24 小时内 使用。黑曲霉孢子悬液可保存在 2～8℃，在验证过的贮存期内使用。 阴性对照 为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。 如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。 培养基适用性检查 微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适 用性检查。 按表 1 规定，接种不大于 100cfu 的菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼 脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置表 1 规定条件下培养。每一试验菌株平 行制备 2 管或 2 个平皿板。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在 0.5~2 范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养 基管比较，试验菌应生长良好。 计数方法适用性试验 ⒈供试液制备 根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若 需加温时，应均匀加热，且温度不应超过 45℃。供试液从制备至加入检验用培养基， 不得超过 1 小时。
微生物限度中国药典2020年版四部通则1105、1106、1107
微生物限度中国药典2020年版四部通则1105、1106、
1107
摘要：
一、微生物限度检查的重要性
二、中国药典2020 年版四部通则1105、1106、1107 介绍
三、微生物限度检查方法
四、微生物限度检查在药品质量管理中的作用
正文：
微生物限度检查在药品生产和质量控制中扮演着至关重要的角色。
它旨在确保药品中微生物的数量和种类符合规定标准，以避免微生物污染和药品失效。
在中国，药品的微生物限度检查主要依据《中国药典》进行。
《中国药典》2020 年版四部通则1105、1106、1107 对微生物限度检查进行了详细规定。
其中，1105 通则规定了非无菌药品微生物限度检查的基本要求和方法；1106 通则针对无菌药品的微生物限度检查进行了规定；1107 通则则对微生物限度检查中使用的培养基、试剂和仪器等进行了详细说明。
微生物限度检查方法主要包括计数法和定性法。
计数法是通过计算样品中微生物的数量来判断其是否符合规定标准；定性法则是通过观察和鉴定微生物的种类，以确定其是否为有害微生物。
这两种方法在实际应用中往往相互结合，以提高检查的准确性。
微生物限度检查在药品质量管理中发挥着重要作用。
首先，它为药品生产过程中的微生物控制提供了依据，帮助企业制定合理的生产工艺和质量控制策
略。
其次，微生物限度检查可以有效防止药品在生产和储存过程中的微生物污染，保证药品的安全性和有效性。
最后，微生物限度检查还有助于药品监管部门对药品质量进行监督和评价，确保药品市场秩序和公众用药安全。
总之，微生物限度检查在药品质量管理中具有重要意义。
2015版中国药典微生物限度
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑶油脂类供试品
• 取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶 解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌 聚山梨酯 80或其他无抑菌性的无菌表面 活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般 不超过 40℃（特殊情况下，最多不超过 45℃），小心混合，若需要可在水浴中进 行，然后加入预热的稀释液使成 1∶10供 试液，保温，混合，并在最短时间内形成 乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面 活性剂的稀释液进一步 10倍系列稀释。
– 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿计数 法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。
• 菌数报告规则
– 以相当于 1g、1ml 或10cm2 供试品的菌落数 报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以﹤1 报 告菌数（每张滤膜过滤1g、1ml 或10cm2 供 试品）,或﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑷需用特殊方法制备供试液的供试品
• 膜剂供试品 • 肠溶及结肠溶制剂供试品 • 气雾剂、喷雾剂供试品 • 贴膏剂供试品
1.4.2供试品检查
1. 平皿法
– 平皿法包括倾注法和涂布法。 – 除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性
试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每 稀释级每种培养基至少制备2个平皿。 – 培养和计数 除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养 基平板在30～35℃培养3~5天，沙氏葡萄糖琼脂 培养基平板在20～25℃培养5 ~7天， 观察菌落 生长情况,点计平板上生长的所有菌落数，必要时 可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告 。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落 数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌 数报告规则报告菌数。 – 若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15， 则两个平皿的菌落数不能相差1 倍或以上。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案目录1. 目的 (3)2. 适用范围 (3)3. 参考标准 (3)4. 接受标准 (3)5. 人员职责 (3)6. 抽样计划 (4)7. 设备、试剂和菌种信息 (4)8. 方法适用性试验 (5)9. 文件控制 (6)10. 不合格情况处理 (6)11. 再验证周期 (6)12. 附件清单 (6)1.目的根据中国药典2020版微生物限度检查法的要求，对产品的微生物限度检查法进行验证，以确定所采用的方法适合于本产品的微生物限度检查，即确认本品在该检查量及该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不计。
保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
2.适用范围适用于本司产品的微生物限度检查。
3.参考标准《中华人民共和国药典》（2020版第四部1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法）《医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分：产品上微生物总数的测定》《医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分：产品上微生物总数的估计》4.接受标准4.1.阴性对照组不长菌；4.2.回收率（试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值）应在0.5~2范围内；4.3.若回收率小于0.5，考虑产品有抑菌性，则重新考虑检查方法的建立。
5.人员职责5.1.成员及其职责详见表一：表一人员及职责5.2.培训要求确保参与验证的所有人员了解其职责和角色，以及验证的过程和要求。
验证开始前，负责本次验证的检验员将对参与确认执行的人员讲解验证的过程和要求，并记录在《培训记录》中。
适用时，培训考核记录作为附录包含在验证报告中。
6. 抽样计划随机抽取3个批次，每个批次随机抽取7套样品。
具体信息详见表二：表二 样品信息确认人/日期： 复核人/日期： 7. 设备、试剂和菌种信息 7.1. 设备信息详见表三表三 设备信息确认人/日期：复核人/日期： 7.2. 试剂信息详见表四表四 试剂信息确认人/日期： 复核人/日期： 7.3. 菌种信息详见表五表五 菌种信息确认人/日期：复核人/日期：7.4.菌液的制备用接种环取枯草芽孢杆菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取金黄色葡萄球菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取铜绿假单胞菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取白色念珠菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取黑曲霉的斜面培养物，向培养物中加入10mL0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，转移孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的孢子悬液。
微生物限度检查操作规程(中国药典2015版四部通则)
霉菌与酵母菌总数、控制菌得检查。
二、引用标准：《中国药典》２015年版（通则1１05-1106）三、目录1。
微生物限度标准2.设备、仪器及用具3。
消毒液、稀释剂、试液及培养基4。
检查总则(通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法,通则1106非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法）5。
微生物计数法检查6.控制菌检查法7．实验技术8、附件１.微生物限度标准非无菌药用原料及辅料得微生物限度标准(2)．目测霉变者以不合格论。
（３）。
“无”为标准依据或无相应规定。
准依据或无相应规定.2.设施、仪器及用具2、１、设施：2、１、1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查得要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染得措施不得影响供试品中微生物得检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
２、1、2．其她设备:高压蒸汽灭菌器;细菌培养箱(3０~3５℃);霉菌培养箱(２5～2８℃)；电炉(或其她适宜得加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱(250~３00℃)；电冰箱。
生化试剂储存箱。
2、2仪器及器皿2、2、1。
菌落计数器；显微镜（15０0X）;电子天平或药物天平（感量0、1ｇ）;ｐH 系列比色计。
2、2、2．玻璃器皿：锥形瓶(2５０~３００ml,内装玻璃珠若干)、研钵（玻璃或陶瓷制,∮10～12ｃm)、培养皿（∮9 ｃm）、量筒(１00ml）、试管（1８×180ｍm）及塞、吸管（1ml分度0、01，10ml分度0、１)、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。
2、2、3新购得玻璃器皿得清洁:先用流水冲洗，浸泡于1％~２%盐酸（工业用）液中约2～6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗.用于化学分析得玻璃仪器,需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2～3次，晾干备用。
2、3用过得玻璃器皿：2、3、1未被病原微生物污染得器皿：可随时洗涤.用清水冲洗(或浸泡)，除容量仪器外，可用毛刷与肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净,晾干备用.容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗,最后以纯化水涮洗2～3次.试管及培养皿:先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内,经1２1℃灭菌30 分钟.趁热倾出培养物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗,最后以流水涮净。
2015年版中国药典微生物限度检查法
1.1 总则：
• 环境： – 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要 求。(在不低于GMP 现行版要求的D 级洁净环境 、局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进 行)【10版：在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内】。 – 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检 出。 – 单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监 测。
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜 选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为 菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最 高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm² 供 试品中所含的微生物数。 – 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低 稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小 于1 时，以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备 – ⑴ 水溶性供试品
• 取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液，或pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪 大豆胨液体培养基溶解或稀释制成 1:10 供试液。若需要，调节供试液 pH 值至 6 ～8。必要时，用同一稀释液将供试液进 一步 10倍系列稀释。水溶性液体制剂也 可用混合的供试品原液作为供试液。
1.3.1菌液制备及使用
试验菌株 试验菌液的制备
金黄色葡萄球菌 〔CMCC(B) 26 003)〕
铜绿假单胞菌 〔CMCC（B)10 104〕 枯草芽孢杆菌 〔CMCC(B) 63 501〕 白色念珠菌 〔CMCC(F) 98 001〕
胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培 养基 【10版：营养肉汤或营养琼脂培养基】 30～35℃，18～24小时
微生物限度检查操作规程(中国药典2015版四部通则)
一、范围：本标准规定了微生物限度的检查方法和操作要求；适用于检品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。
二、引用标准：《中国药典》2015年版(通则1105-1106)三、目录1．微生物限度标准2．设备、仪器及用具3．消毒液、稀释剂、试液及培养基4．检查总则（通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法）5．微生物计数法检查6．控制菌检查法7．实验技术8. 附件1．微生物限度标准非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准*未做统一规定。
(1)．“—”为不得检出。
(2)．目测霉变者以不合格论。
说明：1．“—”为每100 cm中不得检出。
2．目测霉变者以不合格论。
3．“无”为标准依据或无相应规定。
2．设施、仪器及用具2.1、设施：2.1.1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
2.1.2．其他设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30~35℃）；霉菌培养箱（25~28℃）；电炉（或其他适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300℃）；电冰箱。
生化试剂储存箱。
2.2仪器及器皿2.2.1．菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；pH系列比色计。
2.2.2．玻璃器皿：锥形瓶（250~300ml，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，∮10~12cm）、培养皿（∮9 cm）、量筒（100 ml）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10 ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。
2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%~2%盐酸（工业用）液中约2~6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。
用于化学分析的玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次，晾干备用。
(优质医学)《中国药典》微生物基本知识
供试品检查部分-耐胆盐革兰阴性菌
取供试品，用胰酪大豆胨液体培养基作为稀释剂照“非无菌产品微生物限度 检查：微生物计数法”（通则1105）制成1:10供试液，混匀，在20~25 ℃ 培养，培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但不繁殖（约2小时）。
取相当于1g或1供试品的上述预培养物接种至适宜体积（经方法适用性试验 确定）肠道菌增菌液体培养基中，30~35 ℃培养24~48小时后，划线接种 于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，30~35 ℃培养18~24小时。如果平板上无 菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰阴性菌。
101 : 可接受的最大菌数为20; 102 : 可接受的最大菌数为200; 103 : 可接受的最大菌数为2000:以此类推。 虽然扩大了限度的标准，但是对过程控制的要求有了很大的提高，培养 基的营养能力也有了很多的提高，未来将向参数放行方向发展。
29
1101 无菌检查法-培养基
硫乙醇盐酸流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌培养；胰酪大豆胨液体培养基 用于真菌和需氧菌的培养。
表3 非无菌的药用原料及辅料微生物限度标准（新增） 表4 中药提取物及中药饮片的微生物限度标准（新增）
28
非无菌药品微生物限度标准
限度标准由“数量”向“数量级”转变 非无菌药品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数照“非无菌产品微生物
限度检查：微生物计数法”（通则1105）检查；非无菌药品的控制菌照 “非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”（通则1106）检查。各 品种项下规定的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数标准解释如下：
37
1101 无菌检查法-供试品无菌检查-培养及 观察
38
1101 无菌检查法-结果判断
阳性对照管应生长良好，阴性随着管无菌生长。若供试品管均澄清，或 虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一 管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定。
2020版药典微生物变更细则解读
增加：
若平皿上未见菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定 结果为非控制菌，判供试品未检出铜绿假单胞菌
铜绿假单胞菌
项目
2015版药典
2020版药典
铜绿假单胞菌检测 中氧化酶试验
斜面培养物
应进行绿脓菌素试 验
分离纯化培养物
应继续进行适宜的 鉴定试验，确认是 否为铜绿假单胞菌
删除：绿脓菌素试验
金黄色葡萄球菌
项目
2020版药典微生物 变更细则解读
2020年06月
-1-
涉及内容
药典三部： 生物制品通则：《生物制品生产检定用菌毒种管理规程》 总论：《微生态活菌制品总论》（变更）
通则
1101 《无菌检查法》（变更） 1105 《非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》 1106 《非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》 1107 《非无菌药品微生物限度标准》 3605 《细菌生化反应培养基》 1421 《灭菌法 》
数以白色念珠菌为对照菌，非致病杂菌计数以金黄色葡萄球菌为对照菌
排除目的菌干扰的
因供试品为活菌制品，应选用能抑制目的菌生长的选择性 培养基进行检查。除另有规定外，营养琼脂培养基用于非 致病性杂菌的计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于真菌计数。
也可采用其它经验 证的培养基
真菌计数
称取供试品1g，加到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜稀释液中，混匀， 做10倍系列稀释，取适宜稀释度供试品溶液0.1ml加到已备好的玫瑰红钠琼脂 培养基上，以玻棒涂匀，一式3份，倒置，于恒温培养箱中培养96小时，每天 观察结果，记录平皿上生长的真菌菌落数.
2. 理化检查 3. 活菌数测定
按本总论附录2方法测定每克制品中的活菌数，应符合规 定。多价制品应分别测定各单价活菌数。
《中国药典》2015年版控制菌检查法实例
1107 非无菌药品微生物限度标准（3/3）
1107 非无菌药品微生物限度标准----实例
微生物限度标准：需氧菌总数不得过103cfu/g，霉菌和酵母菌总数 不得过102cfu/g，金黄色葡萄球菌不得检出，铜绿假单胞菌不得检 出，大肠埃希菌不得检出，沙门菌不得检出，耐胆盐革兰阴性菌 应小于102cfu/g。
《中国药典》2015年版----控制菌检查法实例
中国药典2015年版
1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
• 计数培养基适用性检查 • 供试品计数方法适用性试验
1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法
• 培养基适用性检查 • 控制菌检查方法适用性试验
1107 非无菌药品微生物限度标准
• 沙，取10g或10mL供试品直接或处理后接种至适宜体积（经方法适用性试验确认）的TSB中
试验菌
• 按微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应试验菌株 • 耐胆盐革兰阴性菌的试验菌两种：铜绿假单胞菌、大肠埃希菌。
适用性 试验
• 试验组（样+菌），阳性组（菌），阴性
• 取规定量供试液及不大于100cfu的试验菌接入规定的培养基中；
与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。
培养基抑制能 力检查
• 分别接种不少于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基 中，在规定的温度和培养时间下，试验菌应不得生长。
培养基指示特 性检查
• 用涂布法分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对 照培养基平板上，在规定的温度和培养时间下，被检培养基
特性 促生长能力 抑制能力 促生长能力+指示特性 促生长能力 抑制能力 促生长能力+指示特性 促生长能力 抑制能力 促生长能力+指示特性 指示能力
限度检查法计算公式
限度检查法计算公式目的:制定微生物限度检查法标准操作规程。
范围:适用于微生物限度检查。
职责:QC室严格执行本规程，QC人员对相关项目的检验负责。
内容:1、依据:《中国药典》2015年版四部(1105、1106、1107)第140、145、149页。
2、概述:本检验操作规程依据中国药典2015年版四部《通则1105 非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法》和《通则1106非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法》进行检查。
3、微生物计数法:微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温钏菌和真菌的计数，计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法(MPN)。
3.1、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查3.1.1、供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。
3.1.1.1、菌种及菌液的制备试验用菌株的传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第О代)，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株沙氏葡萄糖琼脂35?，培养25?，培35?，培25?，培培养基或马铃薯时间不超养时间不养时间不养时间不过5天，接超过5天，超过5天，超过5天，葡萄糖琼脂培养黑曲霉菌种量不大接种量不接种量不接种量不Aspergillus niger基，培养温度20,[CMCC(F) 98003]25?，培养时间于100cfu。
大于大于大于5,7天，或直到获100cfu。
100cfu。
100cfu。
得丰富的孢子3.1.1.2、阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
3.1.1.3、培养基适用性检查按照表1规定，接种不大于100cfu 的菌液至胰酪大豆庥液休培养基或胰酪大豆陈琼脂培养基板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置规定的条件下培养。
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1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应规定的微生物限度标准时， 应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不适用于 活菌制剂的检查。 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌 操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、 工作台面及环境应定期进行监测。 如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活 剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂 或灭活剂的相容性。
计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验
供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。 供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品 的微生物计数。 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。
2020 年版第一次征求意见稿
表 1 试验菌液的制备和使用
⒉ 接种和稀释 按表 1 规定及下列要求进行供试液的接种和稀释,制备微生物回收试验用供试液。 所加菌液的体积应不超过供试液体积的 1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首 先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。 （1）试验组 取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每 1ml 供试液或 每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于 100cfu。 （2）供试品对照组 取制备好的供试液, 以稀释液代替菌液同试验组操作。 （3）菌液对照组 取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液,按试验组操作 加入试验菌液并进行微生物回收试验。 若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供试液进行方 法适用性试验时，应采用适宜的方法对供试液进行进一步的处理。如果供试品对微生物 生长的抑制作用无法以其他方法消除，供试液可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加 入试验菌悬液进行方法适应性试验。 ⒊ 抗菌活性的去除或灭活 供试液接种后，按下列“微生物回收”规定的方法进行微生物计数。若试验组菌落 数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌数值的 50%，可采用下述方法消除供 试品的抑菌活性。 ⑴ 增加稀释液或培养基体积。 ⑵ 加入适宜的中和剂或灭活剂。 中和剂或灭活剂（表 2）可用于消除抗菌剂的抑菌活性，最好在稀释剂或培养基灭 菌前加入。若使用中和剂或灭活剂，试验中应设中和剂或灭活剂对照组，即取相应量稀 释液替代供试品同试验组操作，以确认其有效性和对微生物无毒性。中和剂或灭活剂对 照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值应在 0.5～2 范围内。
⑶ 油脂类供试品 取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使 供试品乳化的无菌聚山梨酯 80 或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀。表面活性剂 的温度一般不超过 40℃（特殊情况下，最多不超过 45℃），小心混合，若需要可在水浴 中进行，然后加入预热的稀释剂使成 1:10 供试液，保温，混合，并在最短内形成乳状液。 必要时，用稀释液或含上述表面活性剂的稀释剂进一步 10 倍系列稀释。
2020 年版第一次征求意见稿
常用的供试液制备方法如下。如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其 他适宜的方法。
⑴ 水溶性供试品 取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或 pH7.2 磷 酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成 1:10 供试液。若需要，调节 供试品值至 6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步 10 倍系列稀释。水溶性液 体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
胰酪大豆胨琼脂 培养基，培养温度 30～35℃，培养时 间不超过5 天，接 种量不大于 100cfu
沙氏葡萄糖琼脂 培养基，培养温 度 20～25℃，培 养时间不超过 5 天，接种量不大 于 100cfu
胰大豆胨琼脂培 养基（MPN 法不适 用），培养温度 30～35℃，培养时 间不超过5 天，接 种量不大于 100cfu
胰酪大豆胨琼脂 培养基，培养温度 30～35℃，培养时 间不超过5 天，接 种量不大于 100cfu
沙氏葡萄糖琼脂 培养基，培养温 度 20～25℃，培 养时间不超过 5 天，接种量不大 于 100cfu
胰酪大豆胨琼脂 培养基（MPN 法不 适用），培 养温 度 30～35℃，培养 时间不超过 5 天，接种量不大于 100cfu
计数方法适用性试验
需氧菌
霉菌和酵母菌
总数计数
总数计数
胰酪大豆胨琼脂
培养基或大豆胨
液体培养基（MPN）
法，培养温度 30～
35℃，培养时间不
超过 3 天，接种
量不 大于100cfu
胰酪大豆胨琼脂
培养基或胰酪大
豆胨液体培养基
（MPN 法），培养
温度 30～35℃，培
养时间不超过 3
天，接种量不大
于 100cfu
枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 〔CMCC(B) 63501〕
胰酪大豆胨琼脂培养 基或胰酪大豆胨液体 培养基，培养温度 30～35℃，培养时间 18～24 小时
胰酪大豆胨琼脂 培养基和胰酪大 豆胨液体培养基， 培 养 温 度 30 ～ 35℃，培养时间不 超过3 天，接种量 不大于 100cfu
⑵ 水不溶性非油脂类供试品 取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或p H7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基制备成 1:10 供试液。分散力较差的供试 品，可在稀释剂中加入表面活性剂如 0.1%的聚山梨酯 80，使供试品分散均匀。若需要， 调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步 10 倍系列稀释。
沙氏葡萄糖琼 脂培养基，培养 温度 20～25℃， 培养时间不超 过5 天，接种量 不大于 100cfu
பைடு நூலகம்
注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基。
2020 年版第一次征求意见稿
菌种及菌液制备 菌种 试验用菌株的传代次数不得超过 5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第 0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。计数培养基 适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1。 菌液制备 按表 1 规定程序培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯 草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无 菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3～5ml 含 0.05％（m l/ml）聚山梨酯80 的 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子 洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含 0.05%（ml/ml）聚山梨酯 80 的 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢 子悬液。 菌液制备后若在室温下放置，应在 2 小时内使用；若保存在 2～8℃，可在24 小时内 使用。稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在 2～8℃，在验证过的贮存期内使用。 阴性对照 为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。 如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。 培养基适用性检查 微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适 用性检查。 按表 1 规定，接种不大于 100cfu 的菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼 脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置表 1 规定条件下培养。每一试验菌株平行 制备 2 管或 2 平皿。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在 0.5-2 范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养 基管比较，试验菌应生长良好。 计数方法适用性试验 ⒈ 供试液制备 根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若 需加温时，应均匀加热，且温度不应超过 45℃。供试液从制备至加入检验用培养基， 不得超过 1 小时。
⑷ 需用特殊方法制备供试液的供试品 膜剂供试品 取供试品，剪碎，加 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或 pH7.2 磷酸 盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基，浸泡，振摇，制备成 1∶10 的供试液。若需要，调 节供试液 pH 值至 6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步 10 倍系列稀释。 肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品，加入 pH6.8 无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂） 或 pH7.6 无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂），置 45℃水浴中,振摇,使溶解,制备成 1∶10 的供试液。必要时，用同一稀释液将供试液进一步 10 倍系列稀释。 气雾剂、喷雾剂供试品 取供试品,（置-20℃或其他适宜温度冷冻约 1 小时—15 版 原话）置冰冻室冷冻约 1 小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位 钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。（供试品亦可采取其 他适宜的方法取样--15 版有）用无菌注射器从每一容器中吸出全部药液于无菌容器中混 合，然后取样检查。 取供试品，置-20℃或其他适宜温度冷冻约 1 小时，取出，迅速消 毒供试品开启部位或阀门。正置容器，用无菌钢锥或针样设备在与阀门结构相匹配的适 宜位置钻一小孔，不同容器钻孔大小和深度应保持基本一致，拔出钢锥时应无明显抛射 剂抛出。轻轻转动容器，使抛射剂缓缓释出。亦可采用专用设备释出抛射剂。释放抛射
试验菌株
金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 〔CMCC(B)26
003〕
试验菌液 的制备
胰酪大豆胨琼脂培养 基或胰酪大豆胨液体 培养基，培养温度 30～35℃，培养时间 18～24 小时