实验一附录_植物转基因载体的介绍

水稻转基因载体
RNAi载体
pZY载体
植物转基因技术的应用
1.转报告基因研究植物基因的表达与调控 2.研究基因的功能
3.利用转基因植物生产外源蛋白质
4.改良植物品种
1.报告基因研究植物基因的表达与调控
植物对环境中的光、重力等因素尤为敏感。这些因素均可
诱导基因的表达。利用报告基因环境因素的变化对基因表 达的影响，是植物分子生物学的重要内容。 在植物中常用的报告基因有：
植物转基因载体的介绍
根癌农杆菌
农杆菌细胞呈杆状，0.8×1.5-3.0mM，以1-4根周生鞭毛运动。
常有纤毛，不形成芽孢，革兰氏染色呈阴性。菌落无色素， 随着菌龄的增加，光滑的菌落逐渐变成有条纹，但也有许多 菌株生成的菌落呈粗糙型。 根癌农杆菌广泛存在于双子叶植物中。一般认为单子叶植物 对农杆菌不敏感，但是近年来的研究表明，农杆菌对单子叶 植物也有浸染能力。
常用载体的构造
花椰菜花叶病毒Cauliflower mosaic virus 35S启动子(CaMV 35S) 胭脂碱合成酶Nopaline syntheses terminator 3'转录终止子(NOS) 标记基因新霉素-3‘-磷酸转移酶Neomycin phosphotransferase-Ⅱ(NPTⅡ)，抗卡那霉素
Ti质粒的功能
1. 2. 3. 4. 5.
6.
7.
为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力； 参与寄主细胞合成植物激素IAA和一些细胞分裂素的活动； 诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和 冠瘿瘤充分； 赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力； 赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性； 决定寄主菌株的植物寄主范围； 有的Ti质粒能够抑制某些根瘤土壤杆菌噬菌体的生长和发 育，即具有对噬菌体的“排外性”。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
双元载体系统
微型Ti质粒：含有T-DNA边界，缺失vir基因的Ti质粒，转化
的植物不会产生肿瘤。除含有T-DNA的左右边界外，还具 有广谱的质粒复制位点及选择标记基因。 辅助Ti质粒：含有Vir区的Ti质粒。实际上辅助Ti质粒是TDNA缺失的突变型Ti质粒，完全丧失了致瘤功能，因此是相 当于在共整合载体系统中的卸甲Ti质粒。主要作用是提供vir 基因功能，激活T-DNA转移。最常用的辅助质粒是根癌农 杆菌ＬＢＡ４４０４所含有的Ti质粒ｐＡＬ４４０４。
2.研究基因的功能
（1）基因的过量表达 （2）RNAi载体：基因的抑制表达
3.利用转基因植物生产外源蛋白质
（1）异源蛋白药物：利用哺乳类动物细胞产生蛋白药物是极其昂贵的， 而植物生长成本较低，农田里可换得大量蛋白质药物。目前这方面的 项目仍在实验室里进行：如人的脑腓肽、人血清蛋白、及小鼠的单克 隆抗体等。举例说明：小鼠的抗体轻链和重链基因分别在两种烟草植 物中表达。然后两种植物品系杂交，产生的子代植物表达小鼠的重链 轻链两种蛋白。从烟草的叶子里可检测到完整的抗体分子，含量为叶 细胞蛋白总量的1.5%。实验还表明，植物的蛋白分泌系统能够识别小 鼠抗体前体的信号肽顺序。 （2）食用或工业用油：首批大规模生产并取得商业效益的非食用性转基 因植物产品是工业用油，其中包括制造肥皂和去垢剂的月桂酸（12个 碳原子）。科学家们仅表达一个特殊的基因就使油菜生产月桂酸而不 是通常的18个碳原子的不饱和脂肪酸。这个实验田试验结果极其成功， 经济效益显著。此外，利用油菜易于生长及产量高的特点，人们还致 力于用它生产其它工业用油。如，作用润滑油及尼龙生产的原料芥酸； 用于麦淇淋生产的6－十八碳烯酸等等。 （3）高分子材料：通过转基因植物获得的高分子原材料范围极其广泛。 包括：可被生物降解的聚羟丁酯塑料（PHB）以及天然棉花与聚酯的 混合纤维等。
农杆菌感染植物的原理

农杆根瘤菌之所以会感染 植物根部是因为植物根部 损伤部位分泌出酚类物质 乙酰丁香酮和羟基乙酰丁 香酮，这些酚类物质可以 诱导Vir（Virulence region) 基因的启动表达，Vir基因 的产物将Ti质粒上的一段TDNA单链切下，而位于根 瘤染色体上的操纵子基因 产物则与单链T－DNA结合， 形成复合物，转化植物根 部细胞。
Ti质粒的结构
1. T-DNA——transferred-DNA regions:是农杆菌浸染植物细胞 时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，故称 之为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 2. Vir区—virulence region：该区段的基因能够激活T-DNA转移， 使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA区和Vir区在 质粒DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质粒的三分之一。 3. Con区——regions encoding conjugations：该区段上存在着 与细菌间结合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌 之间的转移。冠瘿瘤碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因 此称之为结合转移编码区。 4. Ori区——origin of replication：该区段基因调控Ti质粒的自 我复制，故称之为复制起始区。

opines有三个成员：
octopine＝精氨酸与丙酮酸的缩合物 章鱼碱 Napaline＝精氨酸与－酮戊二酸的缩合物 胭脂碱
Agropine＝谷氨酸与二环糖的缩合物 农杆碱
据此可将Ti质粒分为三大类，感染的植物诱导合成这些有机碱，但不能 利用它们，其分解酶基因在Ti质粒上，分解产物为氨基酸和糖类，供根 癌农杆菌使用作为氮源及碳源。
Ti质粒转化植物细胞的战略
天然的Ti质粒不能作为表达载体使用的理由：
1.
生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长素和分裂素阻止 了细胞再生长为整株植物，因此，必须除去生长素和分裂素基因。
2.
有机碱的合成与T-DNA的转化无关，而且可能会影响植物细胞生 长，因为有机碱合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必须去除有 机碱合成基因（tmt）。
一元载体和双元载体系统的比较
双元载体系统不需要共整合过程； 微型Ｔｉ质粒具有大肠杆菌的复制位点，可以在大


肠杆菌中自主复制，拷贝数增加１０－１００倍， 而且分子质量小，可以直接在体外进行遗传操作； 双元载体系统的构建简单； 微型质粒转化农杆菌更容易，构建频率高； 双元载体中不需要共整合过程，所以基因变异的可 能性降低； 双元载体转化农杆菌后，微型Ｔｉ质粒的稳定性要 差些，容易丢失。
植物细胞转化的双元系统

目前T-DNA转化植物细胞的标准方法是双 元系统，即穿梭质粒。插入外源基因的重 组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的根瘤农 杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。与共 整合系统所不同的是，含外源基因的质粒 可在农杆菌内自主复制并保留下来。农杆 菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动 Ti质粒上的Vir基因（在Helper质粒） ，随 后将穿梭质粒的T-DNA切割下来，转移到 植物细胞中。 双元载体主要包括两个Ti质粒，即微型Ti 质粒和辅助Ti质粒。
1.大肠杆菌的β－葡萄糖苷酸酶（GUS）：当于在微生物及动物 系统中使用的β－半乳糖苷酶，只是其作用底物为葡萄糖苷酸。该酶 在脊椎动物和微生物中表达，植物细胞中几乎不表达。当gus基因转 入植物细胞内表达时，若与X－葡萄糖苷酸酶（X-gluc，与X-gal相 似），保温后，就会产生蓝色反应，借此可以预测报告基因的表达程 度，但是该酶不能分泌在细胞外，因此在测定酶活时，须将细胞杀死， 破碎。 2.昆虫的荧光素酶基因：荧光酶基因(luc)是O2和荧 光素存在下发出荧光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用X-光 片或专门仪器进行检测。

T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反 复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。 tms由两个基因组成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH）生长素 tmr由一个基因组成iptz：分裂素 tmt由若干基因构成，合成稀有氨基酸衍生物（opines），即冠瘿碱。
Ti质粒的结构
Ti质粒大约在160～240kB之间。其中T-DNA大约在15kb-
30kb。Vir基因区在36kb左右。除此之外，Ti质粒上还存在 Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。
T-DNA的组成结构

T-DNA克隆在大肠杆菌质粒上，含 有E.coli的选择标记和植物选择标记 Kmr。首先在E.coli中筛选重组分子， 然后将重组质粒转化到农杆菌中， 质粒与Ti质粒上的同源序列发生同 源重组，将外源基因整合到Ti质粒 上，用于侵染植物细胞。T-DNA重 组分子整合到植物细胞染色体DNA 上，Km筛选转化细胞。
4.改良植物品种
（1）控制果实成熟的转基因植物 （2）抗虫害的转基因植物 （3）抗病的转基因植物 （4）抗除草剂的转基因植物 （5）改变花型及花色的转基因植物 （6）抗环境压力的转基因植物 （7）改良作物的品质 （8）雄性不育
Ti质粒约为200kb，重组操作非常困难，也很难找到单一的酶切位 点。 Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，为了使重组质粒DNA的大量扩增， 须添加入大肠杆菌复制子。 加入植物细胞的筛选标记，使用植物 细胞启动子及末端polyA信号，加入多聚人工接头（多克隆位点） 以利于外源基因的克隆。
3.
4.
植物细胞转化的共整合系统 （一元载体系统）