解淀粉芽胞杆菌BaX030的分离鉴定及抗菌功能
解淀粉芽孢杆菌抑菌作用及在养猪业中的应用
动物营养学报2019,31(6):2502⁃2506ChineseJournalofAnimalNutrition㊀doi:10.3969/j.issn.1006⁃267x.2019.06.008解淀粉芽孢杆菌抑菌作用及在养猪业中的应用唐文杰㊀余㊀冰㊀虞㊀洁㊀陈代文∗(四川农业大学动物营养研究所,动物抗病营养教育部重点实验室,雅安625014)摘㊀要:随着生猪产业的快速发展,肠道健康问题备受关注㊂病原微生物感染和各种应激造成猪腹泻㊁肠道功能紊乱,甚至导致猪死亡㊂通过使用微生态制剂等营养调控因子可以缓解这些问题㊂在前人的研究中,从解淀粉芽孢杆菌中分离纯化了多种有效抑菌物质,并明确了其中部分物质的组成结构,为进一步阐明解淀粉芽孢杆菌对细菌和真菌抑制能力提供了理论基础㊂本文结合解淀粉芽孢杆菌抑菌机理,对其在养猪业中的应用情况进行综述,为开发解淀粉芽孢杆菌作为益生素的应用价值提供参考㊂关键词:解淀粉芽孢杆菌;养猪业;益生菌;应用中图分类号:S816.7;S828㊀㊀㊀㊀文献标识码:A㊀㊀㊀㊀文章编号:1006⁃267X(2019)06⁃2502⁃05收稿日期:2018-11-21基金项目:国家生猪产业技术体系(CARS⁃35);四川省科技支撑计划 生猪现代产业链关键技术研究与集成示范(2016NZ0006);四川省科技支撑计划-生猪现代产业链关键技术研究与集成示范(2013NZ0056)作者简介:唐文杰(1995 ),男,四川安岳人,硕士研究生,从事猪营养研究㊂E⁃mail:992275384@qq.com∗通信作者:陈代文,教授,博士生导师,E⁃mail:dwchen@sicau.edu.cn㊀㊀前人研究结果表明,肠道菌群对胃肠道屏障功能㊁胃肠道发育㊁肠道神经系统功能和肠道免疫功能等诸多方面产生重要的影响[1-5]㊂肠道菌群中的厚壁菌门和拟杆菌门占到菌群数量的70%75%[6-7],并对健全动物肠道功能和平衡生理健康中起到重要作用㊂芽孢杆菌属于厚壁菌门类,能黏附在猪胃肠道中并与宿主产生良好共生关系[8]㊂解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefa⁃ciens)作为芽孢杆菌属,在其培养过程中能产生多种抑制其他真菌和细菌活性的代谢产物[9-10]㊂伴随全基因组测序工作飞速发展,关于解淀粉芽孢杆菌抑菌基因和抑菌机理的研究正在逐渐深入[11]㊂解淀粉芽孢杆菌的部分代谢产物对食源性病原体有抑制作用,提示其在益生菌添加剂开发领域的应用前景㊂本文旨在就解淀粉芽孢杆菌产生抑菌物质㊁抑菌机理及其在养猪业生产应用方面进行综述㊂1㊀解淀粉芽孢杆菌产生的主要抑菌物质㊀㊀解淀粉芽孢杆菌属革兰氏阳性菌,与枯草芽孢杆菌具有较近的亲缘关系[12]㊂解淀粉芽孢杆菌可从土壤㊁植物和部分畜禽肠道分离培养[13-15]㊂2007年,解淀粉芽孢杆菌FZB42全基因组测序的公布,使其产生抗菌物质的相关研究逐步深入㊂大量研究显示,解淀粉芽孢杆菌的次级代谢产物含有多种抑制动植物病原菌的物质[16-21],主要包括具有抑菌作用的小肽和蛋白类㊁聚酮类化合物和非核糖途径形成的脂肽类等㊂1.1㊀小肽和蛋白类㊀㊀Herzner等[22]发现解淀粉芽孢杆菌FZB42可产生的羊毛硫抗生素,是一种含有硫醚氨基酸和甲基羊毛硫氨酸的小肽类抗生素㊂羊毛硫抗生素对部分食源性病原菌有抑制作用,例如李斯特菌㊁金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌㊂Kim等[23]结合硫酸铵沉淀㊁液相色谱和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS⁃PAGE)等方法,从解淀粉芽孢杆菌MET0908的发酵产物中分离出一种可以抑制刺盘孢菌的蛋白,该蛋白在80ħ高温条件下处理20min后仍具有抑菌效果㊂Alfonzo等[24]从解淀粉芽孢杆菌AG1菌株的发酵液中分离一种对葡6期唐文杰等:解淀粉芽孢杆菌抑菌作用及在养猪业中的应用萄孢致病真菌有拮抗作用的抗菌肽,相对分子质量为2510 3480,具有一定耐热㊁酸碱稳定性㊂Lee等[25]从发酵大豆制品中分离出的解淀粉芽孢杆菌CH86⁃1具有较强的溶解纤维蛋白能力,采用串联质谱法分离提纯其中的纤维蛋白酶 AprE86⁃1㊂解淀粉芽孢杆菌中编码AprE86⁃1蛋白酶的相关基因与枯草芽孢杆菌具有较高同源性[26],且从微生物中提取的纤维蛋白酶在动物体内具有血栓溶解作用[27]㊂1.2㊀聚酮类化合物㊀㊀Goodson等[28]证实解淀粉芽孢杆菌能够产生聚酮类化合物并探究了其可能机制㊂聚酮类化合物是由脂肪酸在聚酮合酶(polyketidesynthase,PKS)催化下经过类似长链脂肪酸合成途径生成的,是一类结构多样化和生物活性多样化的天然产物㊂Chen等[29]在植物相关解淀粉芽孢杆菌的研究表明,其产生2种具有生物活性的聚酮类化合物[地非西丁(difficidin)和杆菌溶素(bacily⁃sin)]在防治植株火疫疾病上有作用㊂现已证实这2种聚酮类化合物的合成是通过在解淀粉芽孢杆菌FZB42的PKS⁃3基因簇编码聚酮合成酶复合体催化完成㊂1.3㊀脂肽类抑菌物质㊀㊀脂肽类物质是解淀粉芽孢杆菌产生的主要抗菌物质之一,例如表面活性素(surfaction)㊁伊枯草菌素(iturin)和丰原素(fengycin)等[17,21,30-31]㊂桑建伟等[32]通过PCR检测解淀粉芽孢杆菌BEB17与脂肽类化合物合成相关的多个基因,结合基质协助激光解吸附离子化-飞行时间质谱(MALDI⁃TOF⁃MS)和液相色谱-质谱联用分析,发现了该菌株能产生表面活性素㊁泛革素和伊枯草菌素3类脂肽类化合物㊂Arrebola等[33]报道伊枯草菌素A是解淀粉芽孢杆菌PPCB004发挥抑制真菌作用的主要成分㊂Chen等[34]从深海沉积物中分离的1株解淀粉芽孢杆菌SH⁃B10,研究发现了2种具有抗真菌的脂肽类:丰原素A和6⁃Abu丰原素㊂向亚萍等[35]利用特异性引物对解淀粉芽孢杆菌B1619中3种脂肽类抗生素合成相关基因 表面活性素㊁伊枯草菌素A和丰原素B进行检测,通过盐酸沉淀㊁甲醇抽提法等方法得到脂肽类抗生素粗提物㊂2㊀解淀粉芽孢杆菌抑菌机理㊀㊀近年来,国内外研究发现,解淀粉芽孢杆菌的抑菌机制主要包括产生拮抗作用和溶菌作用等方面㊂2.1㊀拮抗作用㊀㊀拮抗作用是通过微生物形成一个不利于病原菌生长的环境条件而间接抑制病原菌的生长,微生物可通过分泌次级代谢产物抑制病原菌生长㊂例如解淀粉芽孢杆菌通过产生抗生素㊁细菌素㊁细胞壁降解酶类和其他抗菌蛋白及挥发性抗菌物质等抗菌成分来抑制病原菌生长繁殖,而其本身不受影响㊂Stöver等[36]研究发现,解淀粉芽孢杆菌YN⁃1菌株代谢产物中含有广谱抑菌活性蛋白TasA,可竞争性抑制其他革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的生长㊂王选等[37]以痢疾杆菌菌株作为病原指示菌,从健康青年牛的粪便中,分离出对痢疾杆菌具有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌株㊂解淀粉芽孢杆菌在动物肠道中可通过与病原菌竞争宿主细胞黏附位点,来影响病原菌在肠上皮细胞的定植能力[38]㊂解淀粉芽孢杆菌在代谢产物中含有机酸,维持偏酸性的胃肠道环境,间接影响潜在致病菌侵染肠上皮细胞,改善肠道健康[39]㊂2.2㊀溶菌作用㊀㊀溶菌作用是解淀粉芽孢杆菌代谢产生的溶菌物质能使菌丝裂解及细胞质消解,或溶解细胞壁和细胞膜㊂程敏等[40]通过扫描电镜观察,同时结合其他研究者对芽孢杆菌抑制真菌的机制成果推测,得出结论:解淀粉芽孢杆菌及其代谢物对病原菌的抑制作用主是通过破坏菌丝和孢子细胞壁和细胞膜,使细胞内原生质的泄露,导致菌丝和孢子萎缩,使细胞代谢无法正常进行,最终杀死病原菌细胞㊂有研究报道表明,表面活性素具有极强的生物表面活性剂特性,对真菌㊁细菌甚至病毒都有良好的抑制效果,在芽孢杆菌次级代谢产物中,表面活性素和伊枯草菌素可通过改变细胞膜通透性,破坏病原菌细胞膜结构而引起细胞死亡[41]㊂曹广添[38]研究表明,解淀粉芽孢杆菌的上清中的脂肽类抑菌物质主要通过破坏病原菌的细胞膜来发挥其杀菌作用,试验显示其成分中含有为伊枯草菌素和表面活性素等㊂付瑞敏等[42]将解淀粉芽孢杆菌BA⁃16⁃8所产丰原素和多烯类抗真菌化合物纳他霉素分别与病原菌DNA进行体外结合,结3052㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报31卷果表明丰原素的抑菌作用除改变病原菌细胞膜通透性以外,还可进入细胞内部作用于核酸,抑制DNA合成和影响其他细胞器的生理作用㊂3㊀解淀粉芽孢杆菌在养猪业中应用㊀㊀解淀粉芽孢杆菌具有抗逆性强㊁广谱抑菌活力㊁代谢产物丰富等特点,作为益生菌添加在饲料中,通过抑制病原菌黏附㊁生物夺氧㊁拮抗病原菌以及分泌多种消化酶等,营造健康肠道环境,促进饲料转化效率,提高生猪生产水平㊂Ji等[43]研究发现,解淀粉芽孢杆菌SC06可通过影响仔猪肠上皮细胞中丝裂原活化蛋白激酶信号传导途径缓解肠毒性大肠杆菌K88诱导的促炎症反应,改善仔猪肠黏膜物理和免疫屏障功能,提示了饲粮中添加解淀粉芽孢杆菌SC06能缓解仔猪腹泻,促进仔猪生长㊂在育肥猪饲粮中添加解淀粉芽孢杆菌能显著提高小肠绒毛膜高度,增强肠道中厚壁菌门优势地位,有效抑制部分革兰氏阴性致病菌感染,促进肠道微生态平衡,改善肠道微生物屏障功能,促进育肥猪肠道健康[44]㊂沈勇涛[45]研究发现,在妊娠母猪饲粮中添加1ˑ107CFU/g解淀粉芽孢杆菌可改善母猪肠道微生态环境,通过母猪微生态的改善可以影响仔猪肠道微生态,并对初生仔猪建立肠道微生态环境平衡有促进作用,从而提高仔猪生长性能㊂宁豫昌等[46]从猪肠道内容物中筛选出解淀粉芽孢杆菌MY⁃6,该菌株能够产生胞外中性丝氨酸蛋白酶,该蛋白酶对于玉米蛋白㊁大豆蛋白和鱼粉蛋白均有较好的水解能力,尤其是对于内源性蛋白酶分泌不足的断奶仔猪而言,额外补充蛋白酶能够提高饲料转化率,减少营养性腹泻的发生㊂4㊀小㊀结㊀㊀芽孢杆菌属菌种具有在恶劣条件下形成孢子且可在猪肠道中定植,形成菌膜,分泌抑菌代谢产物等特点,可作为益生菌添加剂应用于生猪产业㊂解淀粉芽孢杆菌与其他芽孢杆菌具有很多共同之处,随着分子生物学的发展,证实了解淀粉芽孢杆菌同样具备开发为益生菌添加剂的潜力㊂近年来,有学者发现断奶仔猪和育肥猪饲粮中添加解淀粉芽孢杆菌饲料后可以改善其肠道免疫功能,提高饲料转化率㊂此类研究提示了解淀粉芽孢杆菌在养猪业中作为益生菌的开发价值,对提高猪的肠道健康具有一定意义㊂目前,国内外针对解淀粉芽孢杆菌应用于养猪业生产的相关研究并不多,不同来源的解淀粉芽孢杆菌菌株的稳定性㊁安全性以及有效性还尚不明确㊂针对解淀粉芽孢杆菌在猪肠道微生态环境中的次级代谢产物代谢与宿主互作机制和促进猪的生长机理的研究还有待深入㊂参考文献:[1]㊀GAREAUMG,SILVAMA,PERDUEMH.Patho⁃physiologicalmechanismsofstress⁃inducedintestinaldamage[J].CurrentMolecularMedicine,2008,8(4):274-281.[2]㊀GOEHLERLE,PARKSM,OPITZN,etal.Campy⁃lobacterjejuniinfectionincreasesanxiety⁃likebehav⁃iorintheholeboard:possibleanatomicalsubstratesforviscerosensorymodulationofexploratorybehavior[J].Brain,Behavior,andImmunity,2008,22(3):354-366.[3]㊀LYTEM,LIW,OPITZN,etal.Inductionofanxiety⁃likebehaviorinmiceduringtheinitialstagesofinfec⁃tionwiththeagentofmurinecolonichyperplasiaCitrobacterrodentium[J].Physiology&Behavior,2006,89(3):350-357.[4]㊀MACPHERSONAJ,UHRT.InductionofprotectiveIgAbyintestinaldendriticcellscarryingcommensalbacteria[J].Science,2004,303(5664):1662-1665.[5]㊀TEITELBAUMAA,GAREAUMG,JURYJ,etal.Chronicperipheraladministrationofcorticotropin⁃re⁃leasingfactorcausescolonicbarrierdysfunctionsimi⁃lartopsychologicalstress[J].AmericanJournalofPhysiology:GastrointestinalandLiverPhysiology,2008,295(3):G452-G459.[6]㊀DIAMANTM,BLAAKEE,DEVOSWM.Donutri⁃ent⁃gut⁃microbiotainteractionsplayaroleinhumano⁃besity,insulinresistanceandtype2diabetes[J].Obe⁃sityReviews,2011,12(4):272-281.[7]㊀LAYC,SUTRENM,ROCHETV,etal.Designandvalidationof16SrRNAprobestoenumeratemembersoftheClostridiumleptumsubgroupinhumanfaecalmicrobiota[J].EnvironmentalMicrobiology,2010,7(7):933-946.[8]㊀LESERTD,AMENUVORJZ,JENSENTK,etal.Cul⁃ture⁃independentanalysisofgutbacteria:thepiggastro⁃intestinaltractmicrobiotarevisited[J].AppliedandEn⁃vironmentalMicrobiology,2002,68(2):673-690.[9]㊀CHIZ,RONGYJ,LIY,etal.Biosurfactinsproduc⁃40526期唐文杰等:解淀粉芽孢杆菌抑菌作用及在养猪业中的应用tionbyBacillusamyloliquefaciensR3andtheiranti⁃bacterialactivityagainstmulti⁃drugresistantpathogen⁃icE.coli[J].BioprocessandBiosystemsEngineer⁃ing,2015,38(5):853-861.[10]㊀RAVURR,JACOBMR,CHENXL,etal.Bacil⁃lusinA,anantibacterialmacrodiolidefromBacillusamyloliquefaciensAP183[J].JournalofNaturalProd⁃ucts,2015,78(4):924-928.[11]㊀CHENXH,KOUMOUTSIA,SCHOLZR,etal.Comparativeanalysisofthecompletegenomese⁃quenceoftheplantgrowth⁃promotingbacteriumBacil⁃lusamyloliquefaciensFZB42[J].NatureBiotechnolo⁃gy,2007,25(9):1007-1014.[12]㊀MANZOORS,NIAZIA,BEJAIS,etal.Genomese⁃quenceofaplant⁃associatedbacterium,BacillusamyloliquefaciensstrainUCMB5036[J].GenomeAn⁃nouncements,2013,1(2):e00111-13.[13]㊀LARSENN,THORSENL,KPIKPIEN,etal.Char⁃acterizationofBacillusspp.strainsforuseasprobioticadditivesinpigfeed[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2014,98(3):1105-1118.[14]㊀郭政宏,周彪,严亨秀.藏猪源解淀粉芽孢杆菌的益生性㊁安全性和应用性研究[J].江苏农业科学,2017,45(14):137-140.[15]㊀卞丽娟.鸡源解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其对肉鸡的饲用效果[D].硕士学位论文.广州:华南农业大学,2016.[16]㊀YUANJ,ZHANGF,WUY,etal.Recoveryofseveralcellpellet⁃associatedantibioticsproducedbyBacillusamyloliquefaciensNJN⁃6[J].LettersinAppliedMi⁃crobiology,2014,59(2):169-176.[17]㊀DEBOISD,JOURDANE,SMARGIASSON,etal.SpatiotemporalmonitoringoftheantibiomesecretedbyBacillusbiofilmsonplantrootsusingMALDImassspectrometryimaging[J].AnalyticalChemistry,2014,86(9):4431-4438.[18]㊀邓建良,刘红彦,刘玉霞,等.解淀粉芽孢杆菌YN⁃1抑制植物病原真菌活性物质鉴定[J].植物病理学报,2010,40(2):202-209.[19]㊀牛力轩.深海来源解淀粉芽孢杆菌SH⁃B74抗植物病原真菌活性产物的研究[D].硕士学位论文.北京:中国科学院研究生院,2011.[20]㊀姜威,李晶,孟利强,等.解淀粉芽孢杆菌TF28抗菌蛋白AP1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an625014,China)Abstract:Withtherapiddevelopmentofpigindustry,intestinalhealthissuesofpigshavedrawnmuchatten⁃tion.Pathogenicmicrobialinfectionsandvariousstressescausediarrhea,intestinaldysfunctionandevendeathinpigs.Theseproblemscanbealleviatedbyusingnutritionregulatorssuchasprobiotics.Inpreviousstudies,avarietyofeffectiveantibioticsubstanceswereisolatedandpurifiedfromBacillusamyloliquefaciens,andthecompositionalstructureofthemwasclarified,whichprovidedatheoreticalbasisforfurtherelucidatingtheanti⁃bacterialabilitiesofBacillusamyloliquefaciensagainstbacteriaandfungi.Inthisreview,theantibacterialmechanismofBacillusamyloliquefaciensisintroduced,anditsapplicationinpigindustryisreviewedinordertoprovidereferencefordevelopmentoftheapplicationofBacillusamyloliquefaciensasaprobiotics.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2019,31(6):2502⁃2506]Keywords:Bacillusamyloliquefaciens;pigindustry;probiotics;application6052。
生防菌解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的研究进展
生防菌解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的研究进展出晓铭1,2,林毅雄1,2,张珅1,2,严芬1,3,林河通1,2(1.福建农林大学食品科学学院,福州350002;2.福建农林大学农产品产后技术研究所,福州350002;3.福州大学生物科学与工程学院,福州350108)摘要:生防解淀粉芽孢杆菌具有强烈抑制真菌和细菌的能力,在果蔬采后病害防治方面具有巨大的应用潜力。
该文对解淀粉芽孢杆菌产生的抗菌蛋白、蛋白的分离纯化、抑菌机理和生防应用等方面进行了综述,并对其在果蔬采后病害防治应用前景进行了展望。
关键词:解淀粉芽孢杆菌;抗菌蛋白;采后病害;生物防治中图分类号:S476;TS255.3文献标志码:A 文章编号:1005-1295(2014)06-0049-06doi :10.3969/j.issn.1005-1295.2014.06.013Research Advances of Antifungal Proteins Produced by Biocontrol Bacterium ,Bacillus amyloliquefaciensCHU Xiao-ming1,2,LIN Yi-xiong 1,2,ZHANG Shen1,2,YAN Fen1,3,LIN He-tong 1,2(1.College of Food Science ,Fujian Agriculture and Forestry University ,Fuzhou 350002,China ;2.Institute of Postharvest Technology of Agricultural Products ,Fujian Agriculture and Forestry University ,Fuzhou 350002,China ;3.College of Biological Science and Engineering ,Fuzhou University ,Fuzhou 350108,China )Abstract :Bacillus amyloliquefaciens is a kind of biocontrol bacterium which has great ability against fungi and bacteria ,thereby it has high research values and potential for development in biological control of posthar-vest diseases of fruits and vegetables.The separation and purification of antifungal proteins produced by Bacil-lus amyloliquefaciens ,the disease resistant mechanisms and the application of biocontrol of antifungal proteins were summarized.The future potential application in biocontrol of postharvest diseases of fruits and vegetables was also discussed.Key words :Bacillus amyloliquefaciens ;antifungal proteins ;postharvest diseases ;biological control 收稿日期:2014-06-23;修稿日期:2014-07-16基金项目:国家科技支撑计划专项(2007BAD07B06);福建省高等学校新世纪优秀人才支持计划(闽教科〔2007〕20号)资助作者简介:出晓铭(1990-),男,硕士,研究方向为食品科学。
抗嗜水气单胞菌解淀粉芽孢杆菌的抗菌机理研究及其微胶囊制剂的安全性评价
FOOD INDUSTRY · 61 杨柳 袁文 刘迎 河北农业大学对比,解淀粉芽孢杆菌的优良菌株共有65个差异蛋白质点,其中包含36个高丰度的差异差异蛋白质,经鉴定与蛋白质的合成与修饰,能量的代谢,菌体抗逆的自我保护等等生理功能有关,揭示了 解淀粉芽孢杆菌的优良菌株产生的抗菌蛋白直接参与抗菌作用,并且其对环境的抗逆能力也具有很重要的意义。
解淀粉芽孢杆菌的优良菌株中仅仅只含有伊枯草菌素合成的必须基因,该基因与枯草胞杆菌MH25的亲缘关系最近,除此之外,解淀粉芽孢杆菌的优良菌株与伊枯草菌素合成的必需基因的编码产物不具有明显的跨膜结构,但是该基因的结构中存在着AMP结合位点和PP结合位点。
抗嗜水气单胞菌解淀粉芽孢杆菌微胶囊制剂的安全性评价抗嗜水气单胞菌解淀粉芽孢杆菌微胶囊在最终浓度为0.2mg/L ̄2000mg/L时对小球藻的生长具有很强的促进作用,对小球藻的半数抑制浓度则大于2000mg/L,并且对于大型的蚤和斑马鱼以及草鱼致死浓度也是大于2000mg/L。
若在养殖的水体中加入解淀粉芽孢杆菌微胶囊至浓度为0.2mg/L ̄2000mg/L后的14天之内,各个浓度组的氨氮含量和硫化物的含量以及PH值均会缓慢的下降,只有亚硝酸盐的氮含量会稍稍升高后逐渐缓慢的降低,但是这些理化因子的变化与抗嗜水气单胞菌解淀粉芽孢杆菌微胶囊的加入量呈负相关的关系,故此推出,抗嗜水气单胞菌解淀粉芽孢杆菌微胶囊制剂实际无毒,对养殖水的氨氮,亚硝酸盐氮以及硫化物,PH等因子的影响均控制在诸多水产养殖动物的安全浓度内,此结论为抗嗜水气单胞菌解淀粉芽孢杆菌微胶囊制剂在水产养殖中的安全应用提供了重要的科学依据。
通过研究抗嗜水气单胞菌解淀粉芽孢杆菌的比较蛋白质组学我们清楚地了解到抗嗜水气单胞菌解淀粉芽孢杆菌所培育出的优良菌株其产生的抗菌蛋白可以直接参与抗菌,对环境的超强抗逆能力,对生长性能的抗菌能力都使得它的存在具有重要的意义。
解淀粉芽孢杆菌产抗菌物质发酵工艺研究
14 号培养基:玉米粉 20.0 g,豆饼粉 30.0 g,麸皮 20.0 g,柠 檬 酸 铵 5.0 g,KH2PO3 0.3 g,K2HPO4 1.0 g, CaCl2 1.0 g,水 1000 ml。
的抗生素如肽类、脂肽类、细菌素以及高分子量蛋白类 抗菌物质等[4-6]。为了更好的利用这类有益微生物分泌 的抗菌物质,目前在医药卫生和植物保护等领域,有关 芽孢杆菌发酵条件和发酵工艺的研究很多 。笔 [7-12] 者 从杏树根际土壤中分离到的一株解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)BJ-6,室内试验发现它可产 生抗菌物质,该类抗菌物质耐高温、可被硫酸铵沉淀,
0 引言 芽孢杆菌(Bacillus)是植物病害生物防治研究中
的重要微生物之一,其种类多分布广,是土壤和植物微 生态的优势种群[1-3]。该类微生物通过分泌抗生物质和 生长竞争,在防治植物病害方面发挥多种有益作用,大 量研究发现一些芽孢杆菌可以产生对植物病原真菌有 抑菌活性的抗菌物质,这些抗菌物质主要有低分子量
15 号培养基:麸皮 50.0 g,蛋白胨 2.5 g,尿素 2.5 g, NaCl 5.0 g,K2HPO4 1.0 g,MgSO·4 7H2O 0.2 g,水1000 ml。
16 号培养基:玉米粉 46.0 g,豆饼粉 35.0 g,葡萄糖 1.0 g,K2HPO4 3.2 g,MgSO·4 7H2O 0.1 g,水 1000ml。
一株抗真菌的解淀粉芽孢杆菌的鉴定及其抗菌性研究
一株抗真菌的解淀粉芽孢杆菌的鉴定及其抗菌性研究陈成,崔堂兵,于平儒(华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州 510006)摘要:本实验室从广州地区土壤中分离得到一株产抗真菌物质的菌株HN06。
经检测其对黑曲霉(Aspergillus niger)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)和苦瓜枯萎病菌(cucurbit wilt)均有良好的抑制作用。
经生理生化实验及16S rDNA同源性序列分析,鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。
并对其产生的抗真菌物质的部分性质进行了研究。
关键词:抗真菌;解淀粉芽孢杆菌;鉴定文章篇号:1673-9078(2011)1-36-39Identification of an Anti-fungal Strain of Amyloliquefaciens Bacillus and the Properties of the Antifungal SubstanceCHEN Cheng, CUI Tang-bing, YU Ping-ru(School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China) Abstract: A bacterial strain HN06 with anti-fungal effect was isolated from the soil in Guangzhou. This stain showed high inhibitory effects on Aspergillus niger, Magnaporthe oryzae, Rhizoctonia solani and Cucurbit wilt. It was identified as Bacillus amyloliquefaciens by physiological-biochemical properties and phylogenetic analysis of 16S rDNA sequence. And the properties of the antifungal substance produced by HN06 were also studied.Key words: anti-fungal; amyloliquefaciens bacillus; identification据联合国粮农组织(FAO)统计,每年因植物遭受病害造成的平均减产量为总产量的10%~15%[1],而植物病害主要是由真菌引起的。
一株解淀粉芽孢杆菌抑菌成分的分离与抑菌特性
步法農划律2019年第60卷第9期文献著录格式:徐燕尔,丁鹏辉,陈明路.一株解淀粉芽抱杆菌抑菌成分的分离与抑菌特性[J]•浙江农业科学,2019,60(9):1516-1520.DOI:10.16178/j.issn.0528-9017.20190908一株解淀粉芽抱杆菌抑菌成分的分离与抑菌特性徐燕尔,丁鹏辉,陈明路(浙江农林大学农业与食品科学学院,浙江临安31300)摘要:以马藻、金鱼藻等水藻为材料,分离得到24株芽抱杆菌,从中筛选得到1株对金黄色葡萄球菌有较强抑菌作用的解淀粉芽抱杆菌,该菌的抑菌成分主要集中在培养液的酸沉组分中+通过硅胶柱层析对酸沉组分进行初步分离,100%甲醇洗脱组分对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强+理化特性分析结果表明,该菌抑菌组分热稳定性高,对蛋白酶不敏感,pH对其抑菌活性无明显影响。
关键词:生物防治;金黄色葡萄球菌;解淀粉芽抱杆菌;抑菌成分中图分类号:TQ465.92文献标志码:A文章编号:0528-9017(2019)09-1516-04微生物污染作为生活中的常见污染问题对人类的生活产生了极大影响,它不但会导致食品腐败变收稿日期:2019-06-25基金项目:浙江农林大学创新创业项目(2013200039)作者简介:徐燕尔(1997—),女,浙江湖州人,学士,研究方向为食品微生物,E-mail:522217978@qq.gm。
笋根腐病是引起芦笋连作障碍的重要原因,芦笋根腐病病原为镰刀菌,是一种土壤习居真菌,易在土壤中累积+在设施栽培中,由于环境条件适宜,更易累积+芦笋是引进作物,芦笋根腐病的主要病原是尖抱镰刀菌石刁柏专化型[2-,芦笋根腐病菌可能由引种进入我国;根据对笋区长期的实践经验,20世纪90年代前,芦笋根腐病很少见,此后渐多,现已成为一种常见的芦笋病害+3.2蚕沙对设施连作土壤改良和对芦笋根腐病的防病作用本研究表明,蚕沙有较强的抑制芦笋根腐病菌生长和产抱作用,可能是蚕沙中含有的异槲皮苷、芦丁、紫云英苷等黄酮类和生物碱类等物质具有抑菌作用有关[7-+蚕沙是一种安全、优质的有机肥,在很多作物上都有应用[%-。
一株解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其生物学特性研究
一株解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其生物学特性研究杨冬静;张成玲;徐振;赵永强;孙厚俊;谢逸萍【期刊名称】《江西农业学报》【年(卷),期】2017(029)009【摘要】从土壤中分离筛选到一株具有广谱抗菌活性的拮抗细菌,命名为XZ-1.采用平板对峙培养法测定其抑菌活性,结果显示:XZ-1对大蒜叶枯病菌、草莓炭疽病菌等8种重要农作物病害的病原真菌均具有较强的拮抗活性,且抑菌带直径均大于10mm.采用PCR扩增16SrDNA片段并用MEGA6.0软件构建系统发育进化树,结果表明XZ-1与解淀粉芽孢杆菌16SrDNA序列KY828923聚为一簇,因此初步鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).采用单因素试验设计对XZ-1的生物学特性进行研究,结果表明:XZ-1在pH值为6时生长最佳,在氯化钠浓度为0~10g/L之间时生长情况相对较好;对光暗不敏感,致死温度为100℃、10min.【总页数】6页(P69-74)【作者】杨冬静;张成玲;徐振;赵永强;孙厚俊;谢逸萍【作者单位】江苏徐淮地区徐州农业科学研究所/农业部甘薯生物学与遗传育种重点实验室,江苏徐州 221131;江苏徐淮地区徐州农业科学研究所/农业部甘薯生物学与遗传育种重点实验室,江苏徐州 221131;江苏徐淮地区徐州农业科学研究所/农业部甘薯生物学与遗传育种重点实验室,江苏徐州 221131;江苏徐淮地区徐州农业科学研究所/农业部甘薯生物学与遗传育种重点实验室,江苏徐州 221131;江苏徐淮地区徐州农业科学研究所/农业部甘薯生物学与遗传育种重点实验室,江苏徐州 221131;江苏徐淮地区徐州农业科学研究所/农业部甘薯生物学与遗传育种重点实验室,江苏徐州 221131【正文语种】中文【中图分类】S476【相关文献】1.一株抗真菌解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件的初步研究 [J], 权春善;王军华;徐洪涛;范圣第2.一株产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其酶促反应适宜条件初步研究[J], 刘宇;李阳;尹珺伊;侯美茹;王岩;秦平伟;史同瑞;朱战波3.一株具有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌的筛选、鉴定及生物学特性研究 [J], 蒋凯丽; 周新丽; 高海燕4.一株具有广谱抗真菌活性的解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定 [J], 刘小玉;付登强;刘立云;黄丽云;齐兰5.一株具有产IAA能力的解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及功能评价 [J], 陈迪;芮凯;曾涛;田威;马瑞;谢圣华;罗诗彤因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
一株产抗菌活性物质解淀粉芽孢杆菌的筛选及鉴定
一株产抗菌活性物质解淀粉芽孢杆菌的筛选及鉴定杨胜远;韦锦;李云;姚虹;黄月丹【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2010(031)021【摘要】从菜园土壤中分离筛选到1株产广谱抗菌活性物质的菌株K6,其抗菌活性物质对藤黄微球菌、大肠杆菌、铜绿假单孢菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、酿酒酵母、匍枝根霉和白色念珠菌均有抑制作用,其中对革兰氏阳性菌的抑菌作用最强,对霉菌的抑制作用相对较弱.通过形态特征、16SrDNA序列分析和系统发育分析,菌株K6与B.amyloliquefaciens位于同一簇群,同源性达99%,将其初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌.【总页数】5页(P208-212)【作者】杨胜远;韦锦;李云;姚虹;黄月丹【作者单位】韩山师范学院生物系,广东,潮州,521041;韩山师范学院图书馆,广东,潮州,521041;韩山师范学院生物系,广东,潮州,521041;韩山师范学院生物系,广东,潮州,521041;韩山师范学院生物系,广东,潮州,521041【正文语种】中文【中图分类】Q939【相关文献】1.一株抗木霉菌解淀粉芽孢杆菌的筛选与鉴定 [J], 努尔孜亚;管建华;贾培松;魏鹏;罗影;贾文捷;郝敬喆2.一株高产淀粉酶枯草芽孢杆菌的筛选、鉴定及产酶条件的优化 [J], 陈相达;戴慧慧;刘燕;李圆圆;翁丛丛;茹波;曾爱兵3.一株抗烟草赤星病解淀粉芽孢杆菌的筛选及鉴定 [J], 司世飞;宋莉莎;任静;刘仁祥;李忠4.一株具有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌的筛选、鉴定及生物学特性研究 [J], 蒋凯丽; 周新丽; 高海燕5.一株具有产IAA能力的解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及功能评价 [J], 陈迪;芮凯;曾涛;田威;马瑞;谢圣华;罗诗彤因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
解淀粉芽孢杆菌抑菌活性成分鉴定及机理研究
摘要解淀粉芽孢杆菌是生物防治领域中重要的菌株之一,其发酵分泌的多种抑菌物质,对真菌、细菌、放线菌、病毒均有较强的拮抗作用。
在医药、保健品、饲料、食品和化妆品等领域有广阔的应用前景。
以金黄色葡萄球菌为指示菌,选上清液的抑菌活性和乳酸浓度为指标,从实验室保藏的菌株中挑选初始乳酸产量为2.05 g⋅L-1,抑菌圈直径为15.4 mm的菌株,将其编号为B815。
对其进行分子生物学与生理生化鉴定,明确B815菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
对B815菌株进行常温常压等离子诱变(ARTP),结合特定的高通量筛选,获得乳酸产量为3.92 g⋅L-1,抑菌圈直径为20.3 mm,且能稳定遗传的突变菌株,将其编号为B815-1。
对B815-1菌株的培养基、培养条件进行优化,获得最优配方:麦芽糖10 g⋅L-1,蛋白胨15 g⋅L-1,MgSO4·7H2O 2 g⋅L-1,活性CaCO3 10 g⋅L-1;最优培养条件:培养温度50℃,初始pH 7,种龄3 h,接种量2%,装液量50 mL。
优化后,菌株的抑菌圈直径为25.6 mm,乳酸产量达到8.42 g⋅L-1。
菌株B815-1上清液中总抑菌物质的基本特性表征:热稳定范围为60℃以下,pH稳定范围为6~9,对中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、大豆多肽水解酶不敏感,胃蛋白酶对其活性略有影响;对肠炎沙门氏菌、铜绿芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、单核增生李斯特菌均有抑制活性。
菌株B815-1经模拟胃、肠液处理3 h后,活菌存活率分别为86.14%、95.14%。
菌株B815-1经80℃处理5 min后,活菌数由原来的7.00×108 CFU⋅mL-1下降为5.40×108 CFU⋅mL-1,存活率为77.4%。
建立酸沉、有机溶剂萃取,DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析,半制备型RP-HPLC(反向高效液相)的分离纯化方案,从发酵上清液中得到两种抑菌活性成分。
解淀粉芽孢杆菌功能简介
解淀粉芽孢杆菌
【适用范围】生物肥料、生物农药、饲料添加剂、水产养殖的应用。
【产品特点】
1、抗病抑菌、广谱高效。
经试验证明,解淀粉芽孢杆菌对番茄叶霉病菌、早疫病菌、灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、炭疽病菌、甜瓜枯萎病菌、辣椒晚疫病菌、小麦、水稻纹枯病菌、玉米小斑病菌、大豆根腐病菌等土传病害有很好的防效。
2、抗逆防衰、促进生长。
解淀粉芽孢杆菌能诱导作物产生超氧化物歧化酶(SOD),加多酚氧化酶(PPO),过氧化物酶(POD)等,提高作物抗逆性;能诱导植物快速分泌内源生长素,促进作物快速生根,提高根系发育能力,促进植物健壮生长。
3、改良土壤、增进肥力。
解淀粉芽孢杆菌可改善作物根际微生态,活化土壤中难溶的磷、钾等潜在养分,改良土壤,疏松板结,遏制土壤退化,提高土壤肥力。
4、降低农残、优质增产。
解淀粉芽孢杆菌可降解土壤及果实中的残留农药,减少亚硝酸盐含量,提高果蔬维生素和糖含量,改善农产品品质,提高作物产量,易贮藏运输。
【主要成分】解淀粉芽孢杆菌活芽孢、发酵代谢产物、固态发酵基质。
解淀粉芽孢杆菌——环保抑菌的生物农药
解淀粉芽孢杆菌属革兰氏阳性芽孢杆菌,需氧,革兰氏阳性菌,呈短杆状,具有防治植物病害、促进植物生长、改善根际土壤微生物种群结构等作用,对于病害防治、植物促生和果蔬采后保鲜等具有重要意义。
该菌可以通过产生3-吲哚乙酸以及其他代谢产物促进农作物生长,其合成的脂肽类化合物、聚酮类化合物、细菌素能够对土壤中的致病菌产生拮抗作用,抑制病原菌的生长或繁殖,从而达到防治病害的作用。
解淀粉芽孢杆菌能够调控植物自身基因表达从而增强对非生物胁迫的抗性,对调整土壤真菌群落结构进行调整,降低镰刀菌属等致病菌的丰度,提升子囊菌门、接合菌门和担子菌门等腐生菌的丰度,极大改善了土壤的微生态环境。
图1 解淀粉芽孢杆菌菌落图菌株解淀粉芽孢杆菌主要通过四种机制发挥作用:1、产生抗菌物质,分泌大分子抑菌蛋白,小分子抑菌肽类以及酶等抗菌物质。
2、溶菌作用,分泌的脂肽类和聚酮类等次级代谢产物,对病原真菌的生长和繁殖有抑制作用,导致菌丝顶端膨大或菌丝溶解。
3、诱导抗性,解淀粉芽孢杆菌会引起苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等一系列酶类活性变化,通过组织木质化、产生植保素、增强细胞机械强度,共同作用,抵抗病毒、细菌和真菌,从而提高宿主的抗病性。
4、在空间和营养物质上的竞争,在果实的表面或者植株的体内器官迅速增殖,占据部分位点,通过与其菌丝相互缠绕,分泌特定的抗生素,或影响菌核形成,从而抑制霉菌菌丝生长[2]。
在环境保护上的应用解淀粉芽孢杆菌可有效降解环境中的一些有毒物质,有些解淀粉芽孢杆菌菌株可把多种有机污染物作为主要碳源,不仅能抵抗海洋污损细菌,而且还对海带孢子的萌发和藤壶幼虫有明显的抑制作用。
而解淀粉芽孢杆菌抑制蓝藻的机理有很多方面,但是主要是产生多种抑菌物质,比如可以分泌抗生素、抗菌蛋白或多肽等活性物质来抑制藻类生长。
解淀粉芽孢杆菌不仅抑藻效果明显,对水体的负面影响小,而且对人畜也无危害。
解淀粉芽孢杆菌研究进展
4生物技术世界 BIOTECHWORLD1 前言解淀粉芽孢杆菌是一种好氧产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌。
该菌在自然界分布广泛,易分离培养,对人畜无毒无害,不污染环境。
其代谢产物较为丰富,具有广谱抗菌活性和较强的抗逆能力,生长快,稳定性较好。
很适合作为生防菌大量生产和应用。
近年来大量学者对解淀粉芽孢杆菌进行了研究,为了方便以后对解淀粉芽孢杆菌的深层开发,本文将近年来国内外的部分研究进展归结于下。
2 解淀粉芽孢杆菌的分离、筛选以及鉴定解淀粉芽孢杆菌在自然界分布广泛,不但可在土壤、植物根际体表、深海水中及外界环境中存在,同时还在植物体内常见。
解淀粉芽孢杆菌易分离、易培养,通过抑菌作用筛选,再通过个体形态、生理生化特性、脂肪酸测定、16S rDNA 同源性序列分析,HPLC-MS 分析等方法鉴定。
解淀粉芽孢杆菌形态特征:革兰氏阳性;菌体杆状、形成芽孢,芽孢卵圆形,孢囊膨大;最适生长温度为28-30℃,最适宜生长的pH6.5-7.0。
生理生化性质:还原硝酸盐;水解淀粉;可利用D -葡萄糖,L-阿拉伯糖,甘露醇,D-木糖作为碳源;接触酶阳性;氧化酶阴性。
3 培养优化解淀粉芽孢杆菌的菌株,培养基成分和培养会影响菌的数量及代谢产物的分泌,不适宜的培养条件和配方,会导致菌株生长不良,胞外活性产物代谢量减少,具体体现在对培养基营养、温度、转速以及培养基的pH 值、接菌量、供氧量、光照等因素的调节。
优化实验方法多采用单因素实验、正交实验、响应面实验等方法进行单一或多种方法组合分析设计。
优化多以菌数,抑菌效果、杀线效果、产芽孢量、酶活力等作为指标,绘制其生长曲线。
实验室培养基碳源多为淀粉、葡萄糖等,为了获得特定代谢产物会以不同物质作为碳源,如褐藻酸钠为碳源,可收获高产的褐藻胶裂解酶,工业上多采用麦麸等价格较低廉的为营养物质,还可以利用有机废水作为碳源,不仅经济还可以处理废水,降低废水浓度。
4 活性物质分析解淀粉芽孢杆菌通过产生低分子量的抗生素以及抗菌蛋白质多肽等活性物质抑制病原菌及线虫,其大多代谢产物的活性物质具有热稳定性、对紫外照射和蛋白酶处理不敏感,耐酸耐碱性等特性。
解淀粉芽孢杆菌
解淀粉芽孢杆菌解淀粉芽孢杆菌,属于芽孢杆菌属,革兰氏阳性菌,呈短杆状。
由于它可以产生液化淀粉酶分解淀粉而被命名为解淀粉芽孢杆菌。
解淀粉芽孢杆菌在农业植物病害的生物防治研究中,对植物真菌病害病原具有广泛的拮抗作用。
其对如黄曲霉菌、赭曲霉菌、三线镰刀菌等种储粮产毒真菌都具有拮抗作用;对辣椒疫霉、枯萎菌(黄瓜、西瓜、香蕉)、炭疽菌(香蕉、芒果、辣椒)等真菌病害病原与植物细菌病害病原水稻纹枯病菌均具有拮抗作用。
其次,解淀粉芽孢杆菌对病原细菌也有一定的抑制作用。
如对藤黄微球菌、白色念珠菌、大肠杆菌、铜绿假单孢菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌等细菌均有不同程度的抑制作用。
线虫也是解淀粉芽孢杆菌拮抗的作用对象,解淀粉芽孢杆菌菌株对松材线虫、香蕉穿孔线虫和水稻干尖线虫等具有较高的杀线虫活性。
解淀粉芽孢杆菌是一种广泛分布于大自然中的革兰氏阳性菌,具有很强应用潜力。
解淀粉芽孢杆菌属于芽孢杆菌属,由于它可以产生液化淀粉酶分解淀粉而被命名为解淀粉芽孢杆菌。
将解淀粉芽孢杆菌施入土壤或水体中,能够降解自然界中一些有毒物质,净化被污染的土壤和河流湖泊。
解淀粉芽孢杆菌又是典型的植物促生菌,能够分泌抗菌蛋白、抗生素、酶或多肽等活性物质,促进植物生长,防治植物真菌病害。
由于解淀粉芽孢杆菌能够分泌多种抗菌活性物质,对果蔬表面的病菌有广泛的抗性,能够解决果蔬保鲜和长期储存问题。
解淀粉芽孢杆菌的这些优良特性在环境保护、农业生产方面都有很大应用潜力近年来,解淀粉芽孢杆菌对农业生产的作用逐渐受到重视。
现已从土壤、植物根际体表、深海水中以及多种植物体内发现了解淀粉芽孢杆菌。
解淀粉芽孢杆菌能通过多种机制与植物互作,能够较好地促进植物生长、控制植物病害、提高作物品质。
目前解淀粉芽孢杆菌在农业上的应用主要有以下几点:1) 作为生物肥料促进植株生长,提高植物品质;2)作为水果蔬菜的保鲜剂;3)防治多种植物病害,降低植株感病率。
一种解淀粉芽孢杆菌发酵液中抗菌脂肽的分离方法[发明专利]
专利名称:一种解淀粉芽孢杆菌发酵液中抗菌脂肽的分离方法专利类型:发明专利
发明人:田露,王旭阳,刘荣杰,龚国利
申请号:CN202011060014.4
申请日:20200930
公开号:CN112079899B
公开日:
20220408
专利内容由知识产权出版社提供
摘要:本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌发酵液中抗菌脂肽的分离方法,将解淀粉芽孢杆菌发酵液离心,使所得发酵清液起泡后收集并冷却泡沫,然后将由泡沫生成的无泡清液经酸沉、抽提、浓缩、干燥,得到脂肽成品,本发明通过在发酵液粗分离工艺中引入起泡操作,使发酵产生的大部分脂肽通过附着在泡沫上而简便、快速的富集。
本发明的分离工艺简单,并且脂肽收率高、纯度高。
申请人:陕西科技大学
地址:710021 陕西省西安市未央区大学园
国籍:CN
代理机构:西安通大专利代理有限责任公司
代理人:范巍
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一株解淀粉芽孢杆菌及其分离筛选方法和应用[发明专利]
专利名称:一株解淀粉芽孢杆菌及其分离筛选方法和应用专利类型:发明专利
发明人:刘小玉,付登强,黄丽云
申请号:CN202010556485.8
申请日:20200617
公开号:CN111662843B
公开日:
20220531
专利内容由知识产权出版社提供
摘要:本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌,该菌株于2020年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号:CGMCCNo:19565;采用本发明所提供的一株解淀粉芽孢杆菌,对椰子茎腐病和花生果腐病的抑制率达到79%,对槟榔炭疽病、椰子灰斑病、槟榔心腐病、油棕心腐病、板栗疫病、油茶叶斑病等致病菌的抑制率超过70%,且该菌株发酵液的抗菌活性在80℃下处理120min后无显著变化,热稳定性强。
该菌株在热区作物病害的生物防治中具有较大的应用潜力。
申请人:中国热带农业科学院椰子研究所
地址:571339 海南省文昌市文清大道496号
国籍:CN
代理机构:北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人:赵蕊红
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73188872298 ; Email: dingxuezhi@hunnu. edu. cn 通信作者。Tel / Fa787400602@qq. com 男, 硕士研究生, 主要从事芽胞杆菌代谢活性物的分离纯化与功能研究。E作者简介: 何浩( 1989 - ) , 0401 ; 修回日期: 20150629 收稿日期: 2015-
“863 计划”( 2011AA10A203 ) ; 湖南省高校创新平台开放基金项目 ( 13CY002 ,10CY013 ) ; 基金项目: 国家自然科学基金( 31370116 ) ; 国家 湖南省生物发育工程及新产品研发协同创新中心项目 ( 20134486 ) ; 国家级大学生创新训练项目( 201410542009 )
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有抑菌活性的芽胞杆菌, 并通过分离纯化发酵产物 得到了一些蛋白类、 肽类及生物小分子类物质, 如枯 [9 ] AFP2 和 AFP3 ; 多 草芽胞杆菌产生抗菌肽 AFP1 、 粘类芽胞杆菌能产生肽类、蛋白质类、核苷类、 吡 [10 ] 嗪类和酚类等多种抗菌物质 。 芽胞杆菌产生的 非蛋白类抑菌活性物在高温、 强酸、 强碱的环境中活 因此对芽胞杆菌非蛋白类活性物的研究 性较稳定, 具有重要的理论意义和实际应用前景 。
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Hao He et al. / Acta Microbiologica Sinica( 2015 ) 55 ( 9 )
解淀粉芽胞杆菌在自然界中分布广泛, 易分离 培养, 对人畜无毒无害, 不污染环境。具有丰富的自 身代 谢 产 物, 产 生 多 种 抗 菌 活 性 物,如 抗 真 菌 蛋 [11 ] [1213 ] [14 ] 、 白 、 表面活性素 伊枯草菌素 、 几丁质 、 其大多数肽类活性物具有热稳定 蛋白酶等, 性、 对紫外照射和蛋白酶处理不敏感 , 耐酸耐碱性等 酶 特性。已有研究表明解淀粉芽胞杆菌对植物病原真 [1617 ] [18 ] 菌 和食物腐败菌致病菌 有很好的抑制效果。 目前, 越来越多解淀粉芽胞杆菌被应用到动植物病 虫害的防治中。 本研究采用水浴加热和稀释平板涂布等方法从 土壤中分离得到一株解淀粉芽胞杆菌, 结合形态观 察、 生理生化特征和 16S rRNA 基因序列同源性分 析对该菌进行分类鉴定; 探索抑菌谱, 分离鉴定抑菌 活性物, 为解淀粉芽胞杆菌抑菌机理研究与生物防 治应用奠定重要基础。
果。BaX030 48 h 发 酵 上 清 液 ( 8000 × g 离 心 30 min, 60 、 过 0. 22 μm 滤膜处理) 分别经温度梯度 40 、 80 、 100 ℃ 处理 1 h, 121 ℃ 处理 30 min 后各取 5 μL 3、 5、 7、 9、 10 、 13 处理 1 h 用于抑菌试验。pH 梯度 1 、 后调 pH 至中性, 各取 5 μL 用于抑菌试验。 蛋白酶 K 和胰蛋白酶分别处理 1 h 后各取 5 μL 用于抑菌 试验。48 h 发酵上清液经体积排阻色谱层析和 C18 反相高效液相色谱纯化后收集各组分进行抑菌试 验。用 游 标 卡 尺 检 测 抑 菌 效 果: 抑 菌 圈 环 半 径 ( mm) = 抑菌圈半径( mm) - 滤纸片半径( mm) 。 1. 4. 2 拮抗植物病原真菌: 采用平板对峙培养法, PDA 在 平板中心位置接种直径为 6 mm 的植物病原 真菌菌落 ( 水稻稻瘟病菌菌丝、 辣椒尖胞炭疽病菌
研究报告
解淀粉芽胞杆菌 BaX030 的分离鉴定及抗菌功能
何浩, 朱颖龄, 迟立庆, 赵子昭, 王婷, 左明星, 张通, 周逢娟, 夏立秋, 丁学知
湖南师范大学生命科学学院 , 微生物分子生物学国家重点实验室培育基地 , 湖南 长沙 410081
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: 【目的】芽胞杆菌是微生物活性物的重要来源 , 摘要 从全国各地采集的 72 份土壤样品中分离出 339 株芽胞 杆菌, 研究各菌株抑菌活性, 分离纯化抑菌活性物, 为丰富芽胞杆菌菌种资源和微生物次级代谢物的挖掘奠 。【方法】采用水浴加热和稀释平板涂布等方法从河南花生地采集的土壤中筛选得到一株 定实际应用基础 具有很强抑菌活性的芽胞杆菌, 结合形态观察、 生理生化特征和 16S rRNA 基因序列同源性比对分析, 对该 C18 反相柱层析得到 Bacillus amyloliquefaciens X030 抑菌活性 菌株进行鉴定。丙酮沉淀、 葡聚糖凝胶柱层析、 LCMS / MS 鉴定其分子量。利用滤纸片扩散法和平板对峙培养法测定抑菌谱及拮抗性质。【结果 】筛选 物, 分离得到一株解淀粉芽胞杆菌, 归类并命名为解淀粉芽胞杆菌 Bacillus amyloliquefaciens X030 。 BaX030 对金 黄色葡萄球菌 ( Staphylococcus aureus) 、 白色念珠菌 ( Candida albicans) 、 酵母菌( Saccharomycetes) 有较强抑制 效果, 对水稻稻瘟病菌 ( Pyriculariaoryzae ) 、 辣椒尖胞炭疽病菌 ( Chili pointed cell anthrax ) 、 枇杷炭疽病菌 ( Gloeosporium eriobotryae speg ) 、 烟草黑胫病菌 ( Phytophthora parasitica ) 有良好拮抗活性。 初步确定 BaX030 。【结论】分离得到的 B. amyloliquefaciens X030 产生了一个对病原细菌 产生的抑菌活性物为多肽类化合物 具有较强抑制作用的多肽, 同时该菌株在拮抗植物病原真菌方面也有明显的效果 。 关键词: 解淀粉芽胞杆菌, 抑菌, 分离纯化, 多肽 : Q939 : 00016209 ( 2015 ) 09113311 中图分类号 文章编号 微生物代谢产物中蕴藏大量潜在的药物资 [4 ] [56 ] 、 , 源 食品资源 与生物能源 其中关于抑菌 和杀虫方面的微生物新药物研究成果显著 , 开发出 [7 ] [8 ] 了一批微 生 物 食 品 防 腐 剂 和 微 生 物 新 农 药 。 芽胞杆菌是微生物库中活性产物来源最丰富 、 最重 要的菌种之一, 生长周期短, 繁殖速度非常快, 在生 长繁殖过程中产生种类繁多的代谢产物 。 目前, 国 内外在芽胞杆菌研究方面进展较快, 筛选出多种具
形态观察: 菌株 BaX030 接种到 LB 平板上, 30 ℃ 培养 48 h, 观察菌落形态, 并接种到 LB 液体培
菌丝、 枇杷炭疽病菌菌丝、 黄瓜疫霉病菌菌丝、 水稻 纹枯病菌菌丝、 油菜菌核病菌菌丝和烟草黑胫病菌 28 ℃ 菌丝) , 距离中心两侧各 2 cm 处加 5 μL 菌液,
何浩等: 解淀粉芽胞杆菌 BaX030 的分离鉴定及抗菌功能 . / 微生物学报( 2015 ) 55 ( 9 )
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30 ℃ 、 180 r / min, 养基中, 培养 48 h, 在培养过程中 观察色素产生和菌体的生长。从固体平板上挑单菌 落, 进行革兰氏染色并观察细菌形态; 收集 12 h 和 48 h 菌体, 双蒸水洗 10 次, 戊二醛固定后在扫描电 镜下观察菌体形态和芽胞。 1. 3. 2 生理生化特征观察: 参照《常见细菌系统鉴 定手册》 方法进行。 1. 3. 3 16S rRNA 基因扩增测序与构建系统发育 树 : 以实验 室 已 有 16S rRNA 基 因 通 用 引 物 , 对各 PCR 16S rDNA , 16S _ F: 分离菌 株 进 行 菌 落 扩增 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3' , 16S _ R: 5'ACGGCTACCTTGTTACGACTT3' 扩增总体积100 μL, 94 ℃ 4 min, 94 ℃ 0. 5 min, 52 ℃ 0. 5 min, 72 ℃ 1. 5 min, 72 ℃ 10 min。 PCR 产物进行 进行 30 个循环, 回收( 用北京百泰克生物技术有限公司多功能 DNA pMD18T 载体连接, 纯化回收试剂盒 ) , 上海英骏生 e 数据库中 物技术有限公司完成测序。 从 EzTaxon获取与 分 离 菌 株 亲 源 关 系 较 近 的 模 式 菌 株 16S rRNA 基因, 结合在 GenBank 中经 BLAST 获取到的 2菌株 16S rRNA 基因, 运用 MEGA 4. 1 的 KimuraParameter 模型, J) 构建系统发育树 采用邻接法 ( N( Replications = 1000 , Bootstrap 值取百分比) 。 1. 4 1. 4. 1 生物活性测定 抑制病原细菌: 滤纸片法检测 BaX030 对产 气肠杆菌、 枯草芽胞杆菌、 金黄色葡萄球菌、 白色念 珠菌、 酵母菌、 鼠伤寒沙门氏菌和绿脓杆菌的抑菌效
Research Paper
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica 55 ( 9 ) : 1133 - 1143 ; 4 September 2015 ISSN 0001 - 6209 ; CN 11 - 1995 / Q http: / / journals. im. ac. cn / actamicrocn doi: 10. 13343 / j. cnki. wsxb. 20150152
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材料和方法
材料
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土样和目的菌株: 通过多点取样法从河南花 生 地 中 采 集 土 样,筛 选 得 到 解 淀 粉 芽 胞 杆 菌 BaX030 。
1. 1. 2 供试菌株: 产气肠杆菌( Enterobacteraerogenes) 、 枯 ( Bacillus subtillis ) 、 草芽 胞 杆 菌 金黄色葡萄球菌 ( Staphylococcus aureus ) 、白 色 念 珠 菌 ( Candida albicans) 、 酵母菌 ( Saccharomycetes ) 、 鼠伤寒沙门氏 菌 ( Salmonellatyphimurium ) 、 绿 脓 杆 菌 ( Pseudomonasaeruginosa ) 、 水 稻 稻 瘟 病 菌 ( Pyriculariaoryzae) 本实验室保藏。辣椒尖胞炭疽病 菌 ( Chili pointed cell anthrax ) 、枇 杷 炭 疽 病 菌 ( Gloeosporium eriobotryae speg ) 、黄 瓜 疫 霉 病 菌 ( Cucumber phytophthora bacteria ) 、 烟草黑胫病菌 ( Phytophthora parasitica) 、 油菜菌核病菌 ( Sclerotinia sclerotiorum) 、 水稻纹枯病菌( Rhizoctonia solani) 湖南 农业大学植物病理学实验室惠赠 。 1. 1. 3 培养基: LB 培养基[19]、 PDA 培养基[20]。 1. 2 1. 3 1. 3. 1 菌株分离 [21 ] 参照 Grundmann 等 菌株分离方法进行。 菌株鉴定