第五章 分子生物学基本研究法(上)

P.sordida P.sordida T.versicolor
AB078605.1 AB078604.1 Z30668.1 AJ310930.1 D8649.3 AF102515.1 Z30667.1 Z30666.1 Z31011.1 AF007222.1 AF175710.1 AJ243977.1 U21878.1 U21879.1 AB016519.2 AB011546.1 AB035734.1 AF008585.1 AB078606.1 M60672.1 M77513.1 J04624.1
第 五 章 分子生物学基本研究法（上）
DNA、RNA及蛋白质操作技术 • 5.1 重组DNA技术史话 • 5.2 DNA基本操作技术 • 5.3 RNA基本操作技术
• 5.4 基因克隆技术
• 5.5 蛋白质与蛋白质组学技术
• 现代分子生物学的快速发展，得益于上个世纪中 叶以来研究方法、特别是基因操作和基因工程技 术的进步。
5. 2 DNA操作技术
一、核酸的凝胶电泳
琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶是按分子量大小分 离DNA的凝胶电泳技术。 生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子 化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴 离子，在电场中由负极向正电极迁移
凝胶类型及浓度 0.3%琼脂糖 0.7%琼脂糖 1.4%琼脂糖 4.0%聚丙烯酰胺
子，在紫外光照射下，
琼脂糖凝胶电泳中
DNA的条带便呈现出
橘黄色荧光，易于鉴 定。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2 - 50kb之间
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1-1000个碱基对
5. 2 DNA操作技术
细菌转化（transformation），是指一 种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株 的DNA而导致性状特征发生遗传改 变的过程。提供转化DNA的菌株叫 作供体菌株，接受转化DNA的细菌 菌株则被称为受体菌株。 将异源DNA分子引入一细胞株系， 使受体细胞获得新的遗传性状
• 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、杂交、
电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合 成、表达、定点突变和 PCR 扩增等，是分子生物 学研究的核心技术。
重组DNA技术发展史上的重大事件
三大成就：
一．在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子 载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； 二．50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机 制,解决了基因的自我复制和世代交替问题； 三．50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学 说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达 机制。
图5-2 DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体
图5-3 重组DNA操作过程示意图
第 五 章 分子生物学基本研究法（上）
DNA、RNA及蛋白质操作技术 • 5.1 重组DNA技术史话 • 5.2 DNA基本操作技术 • 5.3 RNA基本操作技术
• 5.4 基因克隆技术
• 5.5 蛋白质与蛋白质组学技术
5.1 基因操作的基本工具
（一）限制性核酸内切酶 1、命名
Hin dⅢ
属 系 株
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
2.限制性核酸内切酶的识别和切割
感受态 细胞
图5-5 细菌转化及蓝白斑筛选
DNA
5. 2 DNA操作技术
PCR反应体系
PCR反应条件
变性 复性
延伸
图5-7 聚合酶链式反应（PCR）技术
图5-8 PCR指数扩增时循环次数与DNA产物数量的比较
引物设计原则：提高扩增的效率和特异性
⑴ 长度15～30 b，过短特异性降低，过长则成本增加，产量也下降。 ⑵ 引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物 G+C 含量宜在45 ～ 55% 左右。 ⑶ 引物内部不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构，两个引物之间尤其在 3’ 末端不应有互补链存在，不然会形成引物二聚体。 ⑷ 引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性(<70%)或少于连续8个的互补碱基。要求在引 物设计时采用计算机进行辅助检索分析。
误配对时不同碱基的引发效率存在很大差异，最好选T、G、C，而不选A。
关于PCR引物设计 例题1：根据以下cDNA编码区片段的两末端已知序列， 如何设计下游引物，以扩增该cDNA片段。
5′CTTCCACGACGCTATC----//---GAGAGATTCGCCTGCA 3′
例题2: 如何利用网络技术和DNA分析软件设计简并引 物, 以PCR扩增某蛋白的cDNA? 演示: (1)登录NCBI等网站,收集有关cDNA序列信息; (2)利用DNA分析软件(如,DNAman等)对所收集 的cDNA序列进行比对分析,利用最保守序列设计引物。 再论cDNA
• 识别和切割位点：
– 回文结构 4～6 bp
– 出现两种末端： • 粘性末端 （粘端） • 平头末端 （平端）
产生了平 头末端
产生了粘 性末端
图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端。
EcoRI
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PvuII
（二）基因克隆的载体
载体三要素： 1.自我复制能力；2、携带外源基因片段大小； 3.插入位点多少； 具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体 （ vector ）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制 子都可以作为基因导入的载体。
⑸ 引物的 5′ 末端碱基：并没有严格的限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够 ，其 5′ 末端碱基可以不与模板DNA匹配呈游离状态。最多可游离10个碱基并不
影响PCR反应进行。
⑹ 引物的 3′ 末端碱基：原则上要求引物的3′末端与模板DNA一定要配对，另外 3′ 末端的末位碱基在很大程度上影响着 Taq 酶的延伸效率。 引物3′末端碱基在错
分离DNA片段的大小范围（bp） 50 000~1 000 20 000~1 000 6 000~300 1 000~100
10.0%聚丙烯酰胺
20.0%聚丙烯酰胺
500~25
50~1
凝胶浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。
图5-4 溴化乙锭染料的
化学结构及其对DNA
分子的插入作用。由
于插入了溴化乙锭分