流式细胞仪操作方法

—、样品制备

1、取样（大约lx cells ）,离心弃上清，以PBS 洗两遍，逐滴加入1 ml 70%的 冷

乙醇固定细胞，-20°C 冻存过夜。分析时，离心弃上清，以PBS 洗两遍，加入 100|j 啲Rnase （GenScript 试剂A ）, 37°C 水浴30min,然后再加入400』的PI 染 液

（GenScript 试剂B ）,在4°C 避光条件下孵ff30min 后即可上FCM 检测。每个

样品至少获取2xl04cells, 二、上流式测细胞

1」、打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属扌当板；取出鞘液

桶， 倒掉废液，将鞘液桶加至2/3满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS 或

FACSFLow ）,拧紧鞘液桶盖，安上金属扌当板，保证管路畅通无扭曲。检查废

液 桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开，倒掉废液（加鞘液一定要倒废液） 向废液桶中倒入400ml 浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。确实盖紧桶盖, 检查所有管路是否妥善安責。

1.2、 依此接通电源、打开稳压器电源（指示灯由bypass 变Ac putput ）、变

压 器电源，稳定5分钟。将FACSCalibur 开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应 是STANDBYo 如果需要打印，打开打印机电源。打开电脑（密码：

BDIS ）,等待 屏幕显示出标准的苹果标志（先开仪器，后开电脑主机）。 1.3、 将压力阀責于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路

开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。若滤器管路中有气泡，打开连接 头，挤出鞘液，以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME 功能一次，以排除 Flowce 呻的气泡（反向压力使鞘液从进样针中流岀）。结束后自动

STANDBY, 5分钟后即可进行试验。

2.1、从苹果画面中选取CELLQuest,最大化，选散点图标，打开，Plot type 选

择Acq-analysis, X 参数和丫参数分别取FSC-H 、SSC-H （选择散点图主要是确定 所需细胞的细胞群）。选择单参数图标，打开，Plot type 选择Acq-onalysis, X 参数选择FL2-H 1024（此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不

同的荧光，本 实验使用PI 作为荧光染料，故选择FL2-H ）

Y Parameter

Plot Source ：

|<

Select File...

X Parameter Mie ：| Acquisition

2.2、从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer （快捷键：歸+ B）进行电脑和仪器的连机。此时出现Parameter description对话框，选择BD files,设責文件存放的位責｛在Acquire指令栏中，选择Parameter Description, 以决定文件存储位H（folder）,文件名称（file）,样品代号以及各种参数的标记（panel）,即安排tubel, 2, 3…的检测参数。一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \XXX 和DNA文件夹中。文件根据日期命名。｝同时将岀现的Acquisiton Control^话框,将其移至合适位責。

2.3、从Cytometer 指令栏中，开启Detectors/Amps , Threshold , Compensation, Status等四个对话框，并将他们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取文件。也可以用&+1, 2, 3, 4获得此四个对话框。

2.4、在Detectors/Amps （可通过调整电压，是FSC、SSC放大或者缩小）对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式（amplifiermode）:线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时，FSC 和SSC多以线性模式Lin测量，且DDMParam选择FL2,而FL1, FL2, FL3皆以对数模式Log测量；分析细胞DNA含量时，FSC, SSC, FL1, FL2, FL3皆以Lin进行测量，且DDMParam选择FL2;分析血小板表型时，FSC, SSC, FL1, FL2, FL3皆以Log进行测量。

在Threshold对话框中选择适当的参数设定阀值，并调整Threshold的高低, 以减少噪音信号（细胞碎片）。一般做细胞表型时用FSC-H而做DNA时用FL2-H O Threshold并不影响检测器对信号的获取，但可改善画面质量。

在Compensation对话框中，根据所用的调整补偿用标准荧光样品调整双色（或多色）荧光染色所需的荧光补偿。•在Status对话框中，LaserPower:正常值-Run/Reody为14.7mW, Standby为5mW; LaserCurrent:正常值为6Amps 左右。

2.5、通过预设的获取模式文件进行样品分析。从Cytometer指令栏中选取Instrument Settings,在其对话框中选择Open以调岀以前存储的相同实验的仪器设定，按Set ,Done确定。

2.6、加样:混匀、上样、按run （放上待检测的样品，将流式细胞仪设定于RUN, 流速可在HIGH或LOW±）

............... ・・・・・・・・ , ・・・・・'・ I—■

. 口心二口》心心心心三三门心》1二Acquisition Control三三送三门圧三三三三三T三门亦

2.6.1.T具板中选择多角形区隔工具，FSC/SSC散点图上，R1区域的界定，

我们将以此区域来圈选本次测量的细胞。（如果要删除R1区域，您可以在工具

栏中点选Gates - Region list,以鼠标点选R1,再按Delete键删除R1区

在单参数的图上，gote位置选择“G1二R1”使在单参数的图上显示的是R1区域的细胞的荧光。

2.6.2选择“acquire” ―― “counters”打开计数器，本实验计数10000个细胞

为准。测量期间，几十秒后（待电压稳定），点击Abort,去掉勾选setup 开始测量，如需暂停请按a stndby\ 可按run继续。

三.样品分析

使用Modfit 软件分析数据。打开file--选择需要分析的文件。

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