waters_Breeze2仪器基础教程

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分
保存于棕色玻璃瓶中的超纯水
测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
3000
psi
2500
2000
1500
1000
500
0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
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mL/min
反压与温度的关系
温度对反压的影响是反比关系
温度升高，反压降低，对某些流动相的影响更大一些
psi
影响系统反压的主要因素:
— 流动相的溶剂组成 — 温度 — 流速
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反压与溶剂组成的关系
流动相的粘度是产生反压的主要原因 有机溶剂－水的粘度随组成而改变 其压力随组成变化如下图所示
1600 1400 1200 1000
流动相的脱气
流动相脱气的目的
— 使色谱泵的输液准确 o 输液量均匀准确，并且脉动减小 o 保留时间及色谱峰
— 面积的重现性提高 o 提高检测的性能 o 防止气泡引起的尖峰 o 基线稳定，信噪比增加 o 溶剂的紫外吸收本底降低
— 保护色谱柱 o 减少死体积 o 防止填料的氧化
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流动相脱气的方法
加热
— 简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化
抽真空
— 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果
超声波振荡
— 简单，但效果不够理想；超声时间不要太长(1分钟左右即可)
通惰性气体（一般用氦气）
— 可保持在线连续脱气，多用于低压梯度
在线脱气机 （in-line degasser)
进样器与系统的连接：
— 进样器的入口与色谱泵的出口相连 — 进样器的出口与色谱柱的入口相连 — 要求：出入口方向不能接错，接头不能留有空隙
进样器的连接管路：
— 出口管路一定要用细管(内径≤0.009″)，长度要短，尽量减少谱带扩 展
色谱泵及系统的清洗
清洗液用30%磷酸水溶液 30%磷酸配制:取85%浓磷酸35ml与65ml水混匀 清洗步骤如下：
— 取下色谱柱，用两通(Union)连接进样器和检测器 — 用纯水灌注泵头(二元泵的A、B二路各为50%) — 用30%磷酸清洗液洗系统(1ml/min流速)45分钟
(二元泵的A、B二路各为50%) — 换成清水洗至出口水pH显中性 — 用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用
液相色谱系统的清洗与钝化
色谱泵吸滤头，进出口阀及管路(包括进样器和检测池)若被污染， 应作清洗和钝化处理 一般采用30％磷酸水溶液作为清洗剂，用6M硝酸作为钝化剂，先清 洗再钝化 清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢 钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜
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— 可保持连续脱气，多用于低压梯度
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流动相的保存
有机溶剂流动相：
— 室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
— 当日现配现用 — 低温下密封保存，一般不超过3天 — 防止微生物生长
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:
Breeze2系统
仪器使用培训
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Breeze2系统组成
泵
— 1515/1525
进样器
717+/2707
检测器
— 2489 — 2998 — 2414 — SAT/IN
柱温箱
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注:泵排气后，应输液稳定(系统压力脉动小，一般在几十 Psi以内)， 否则，需重做排气操作
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1515/1525
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启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源
— 打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自检后，打开计算 机，启动色谱管理软件
准备流动相
— 过滤，脱气
色谱泵排气
— 用新配制的流动相灌注泵
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启动液相色谱仪器的流程
用准备好的流动相平衡色谱系统
— 15×5泵需在软件控制下操作 — 系统大约需平衡0.5--1小时方能稳定工作
准备样品
— 用流动相溶样或重组样品
编制仪器方法，开始实验
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液相色谱对流动相的要求
色谱柱对流动相的要求
故障排除-清洗单向阀
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关于色谱系统的反压
什么是反压(back pressure)
— 流动相流经管路及色谱柱时会有阻力，即所谓的反压， 又称系统反压 或系统压力
— Waters习惯用的压力单位是Psi(磅/平方英吋) — 其它单位有：Bar， Mpa
高速离心
— 大于：10,000rpm
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717/7725i
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进样器的使用
进样器的种类：
— 手动进样器－7725i — 自动进样器－717Plus
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色谱泵及系统的钝化
钝化液用6M硝酸水溶液 6M硝酸的配制:取浓硝酸40ml与60ml水混匀 钝化步骤如下：
— 在清洗步骤完成后进行钝化处理 — 确认清洗用的磷酸已基本洗净 — 用纯水灌注泵头(二元泵的A、B二路各为50%) — 用6M硝酸水溶液钝化系统(1ml/min流速)45分钟 — 换成清水洗至出口水pH显中性 — 用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用
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去除微粒的方法
过滤
— 过滤膜/过滤装置 o 有机滤膜(≤0.5 µ m)/水溶性滤膜(≤0.45 µ m) o 膜片可更换
— 一次性使用的膜“Cartridge” o 使用方便简单，交叉污染小 o 有更小内径，可用于微量样品的处理
800 600 400 200
0 0
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psi
Pressure vs. Organic-Water Percentage
20
40
60
80
Percent Organic Solvent
MeOH ACN
100
反压与流速的关系
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液相色谱对流动相的要求
液相色谱仪器对流动相的要求：
— 与检测器匹配 — 脱气 — 避免用含卤素离子的缓冲盐（不锈钢系统） — 溶剂的粘度 — 防止细菌的生长
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1星期 1天 新鲜配制
0
5
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10
15 分
20
25
色谱泵的排气操作
色谱泵实验前，应先确认泵头内没有气体，如有气体要按以下步骤排 气：
— 将泵入口管吸滤头放入脱过气的流动相中 — 打开泵及在线脱气机电源开关 — 将排液阀打开，或断开与色谱柱连接的管路 — 设置流速到6-9ml/min，排液阀出口有液流连续流出 — 停止泵流速，关闭排液阀，恢复断开的管路，备用
— 样品溶液要过滤除去微粒及杂质 — 了解样品对色谱柱的基质/填料是否有破坏作用
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复杂样品的预处理
样品预处理的目的
— 除去微粒 — 减少干扰杂质 — 浓缩微量的组份 — 提高检测的灵敏度及选择性 — 改善分离的效果 — 有利于保护色谱柱及仪器
— 低温密封保存 — 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
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保存于聚乙烯瓶中的超纯水
测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
500 0 10.0
20.0
Pressure vs. Temperature
30.0
40.0 Degrees, C
50.0
50% MeOH 50 % ACN 100% H2O 100% MeOH 100% ACN
60.0
70.0
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影响系统反压的其它因素
反压与色谱柱长度成正比 反压与填料颗粒度的平方成反比
— 2.5μm填料比3.5μm填料反压高
反压与管路直径的四次方成反比 (1/D4) 反压与管路的长度成正比
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色谱泵的维护保养
流动相要过滤 常用缓冲液时，停泵前要用水清洗泵头，并用水冲洗柱塞杆清洗孔 关闭排液阀时，不要太用力拧紧，以不渗液为准 更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,如不互溶，要用一种中间 溶剂过渡 色谱泵在停用时，应先用水洗去缓冲盐，然后用纯甲醇充满泵头及管 路，并保存在纯甲醇中
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色谱泵的运行
排气后的色谱泵即可用于实验运行
— 注意： o 排气后，先设流速为 0 o 恢复排气时断开的部分，如：进样器、色谱柱 o 如需要，恢复排气时断开的控制线
根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值 若使用缓冲盐流动相，用前和用后均需用水过渡(包括排气操作)
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— 过滤除去微粒 — 纯度的要求 — 超纯水，或用KMnO4处理过的双蒸水 — 有机溶剂：色谱纯(溶剂中的杂质含量尽可能低)，并与填料相匹配 — 缓冲液的pH值，在填料的允许范围(一般在pH2-8)内 — 缓冲液（盐）的浓度不要太高(≤100mM) — 流动相对样品的溶解度
o 调整有机溶剂和水的比例 o 最好用流动相溶样
流速对反压的影响是线性关系 流速增加，反压亦增大 下图的实验条件：
— 2.1×30mm Symmetry C18柱，20℃
5000 4500 4000 3500
Pressure vs. Flow Rate at 20?C
50% MeOH 50 % ACN 100% H2O 100% MeOH 100% ACN
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实验样品的制备
标样和样品
— 标样:又称对照品，它作为液相色谱定性和定量分析的参考标准物，一 般是纯度较高的纯物质
— 样品:待测物，一般是成分复杂的混合物
液相色谱对样品(包括标样)制备的要求：
— 必须能溶于流动相 o 如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，以免在进 样时样品在流动相中析出，堵塞管路和色谱柱