抗体的制备ppt课件
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E、表面活性剂处理：在一定的条件下，表 面活性剂能与细胞膜脂蛋白形成微泡， 使膜的通透性发生改变而使细胞破碎。 提取核酸时常用此法。
19
B、冷热交替法：将材料投入沸水中，90 ℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中。 在细菌或病毒中提取蛋白质及核酸可用 此法。
C、超声波破碎法：是利用超声波的机械振 动而使细胞破碎的方法。微生物和组织 细胞破碎多用此法，但真菌厚膜孢子则 较难打破。
.
20
D、酶处理法：酶在一定的条件下能消化 细菌和细胞。例如在碱性(pH8.0)下，溶 菌酶可专一破坏G+菌细胞壁。此法适用 于多种微生物。
最重要的性质是免疫原性（immunogenicity）
免疫原—天然抗原、人工合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原
.
14
1. 颗粒性抗原的制备
(1)红细胞抗原的制备：
A、新鲜血经无菌NS洗涤3次，取压积红细 胞并配制成2~5%，直接进行注射免疫。
B、新鲜血+抗凝剂— 4℃保存4W，免疫前 取适量抗凝绵羊血，按A处理。
抗体的制备
.
1
一、一些基本概念
▪ 1. 克隆(clone) ▪ 是指无性繁殖细胞系，是由单一个祖先细胞
分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。在这个家 族的所有成员中，如无突变发生，其基因是 完全相同的。 ▪ 细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团
.
2
2. 抗原决定簇 是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学 基团，又称表位(epitope)，抗原结合位点
.
18
2. 可溶性抗原的制备
可溶性抗原可分为：细胞膜蛋白抗原、 细胞浆抗原、细胞核及核膜抗原。
(1)细胞破碎：有如下方法：
A、反复冻融法：置-15~-20 ℃冻结，然后 缓慢融化，反复2次，大部分细胞因胞内 冰晶的形成和溶剂浓度的突然改变而被 融破。此法适用于组织细胞，对微生物 的细胞作用较差。
.
1
4
Ag
2 3
抗原(antigen，Ag)
.
3
▪ 3.单克隆抗体
(Monoclonal Antibody, McAb)
由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生 的同源抗体。
▪ 4.多克隆抗体
(Polyclonal Antibody，pAb)
用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动 物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多 种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清 实际上是含有多种抗体的混合物。
.
17
粉碎方法有两种，一是高速组织捣碎机法： 注意要高速(1万rmp)，间断(每次30秒 ~1min)进行，时间过长会导致产热，破 坏抗原。另一种是研磨法(有时加入洗过 的海沙使研磨更有效)。
匀浆液经离心，沉淀中含大量的组织细胞 和碎片，上清液可提取可溶性抗原。
消化是用胃蛋白酶或胰酶，通过酶解将细 胞间质消化，获得游离单个细胞。
C、新鲜血去除纤维蛋白原后按B处理。
.
15
(2)细菌抗原的制备：取标准菌株，接种。 H抗原：取有动力的菌株液，用 0.3~0.5%甲醛处理。 O抗原：菌液于100℃2.5h。 Vi抗原：杀菌后，加入1%的氯化钙溶 液。
(3)虫卵也可作为抗原，例如日本血吸虫 卵悬液。
.
16
(4)组织细胞粗抗原：所用的组织必须是 新鲜或处理后低温(-40℃)保存的。器 官或组织材料得到后立即去除表面的 包膜或结缔组织及大血管，用无菌NS 进行灌注、洗涤至没有残血、污物， 在冷浴中将组织剪成小块后粉碎(匀 浆)/消化。
酶联免疫吸附实验，酶联免疫分析)
.
10
抗体的制备技术经历了三代：
• 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用 抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗 体（polyclonal antibody）；
• 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对 抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆 抗体(monoclonal antibody, McAb)；
.
பைடு நூலகம்
4
1 4
Ag 2
3
B1
B2
B3
B4
多克隆抗体
B3 B3 B3 B3
单克隆抗体
.
5
单克隆抗体的特点
+ 抗体的性质相同，容易纯化、标记。 + 特异性强，具有抗原结合位点的专一
性。(不是抗原的专一性！) + 因结合位点的单一性，有时不易捕捉
抗原，一株单克隆抗体与抗原不易产 生凝集反应或沉淀反应。
.
6
.
12
抗体制备技术
（二）单克隆抗体制备的技术要点 （三）影响杂交瘤技术的因素 （四）单克隆抗体的应用 • 三、基因工程抗体技术 （一）人源化抗体 （二）小分子抗体 （三）双特异性抗体 （四）抗体库技术
.
13
二、多克隆抗体制备
(一)免疫原的制备
免疫原(immunogen)指能刺激机体免疫系统
产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原
但单克隆抗体有交叉反应
是由于不同的抗原上有完全相同的表 位(100%的交叉反应)，或有相似的表 位(不同程度的交叉反应)。
.
7
多克隆抗体的特点
+ 多抗是单抗的混合物，因此多抗的性 质是一个群体综合的性质。
+ 特异性一般比单抗差 因为由不同性质的抗体组成，只要其 中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉 反应，所以多抗更容易有交叉反应。
.
8
比单抗更容易捕捉抗原。 因为含有抗不同表位的抗体，多种抗 体都可与抗原结合。
抗体的纯化、标记比单抗难 因为含有各种不同类型、亚类的抗体， 提纯、标记的方法有所差别。同时，血 清中含有的杂蛋白比较多。
.
9
购买抗体时要注意厂商的标注
适合于做什么实验，使用浓度多少
+ WB（Western blotting ，免疫印迹) + IHC (Immunohistochemistry, 免疫组织化学) + ICC (Immunocytochemistry, 免疫细胞化学) + IEM (Immunelectron microscopy,免疫电镜) + FCM (Flow Cytometry,流式细胞仪) + ELISA(enzyme linked immunosorbent assey,
• 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来， 称为基因工程抗体(genetic engineering antibody)。
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11
抗体制备技术
• 一、多克隆抗体制备 （一）免疫原的制备 （二）免疫动物 （三）免疫血清的纯化 （四）免疫血清的鉴定 （五）免疫血清的保存 • 二、单克隆抗体制备 （一）单克隆抗体制备原理
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B、冷热交替法：将材料投入沸水中，90 ℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中。 在细菌或病毒中提取蛋白质及核酸可用 此法。
C、超声波破碎法：是利用超声波的机械振 动而使细胞破碎的方法。微生物和组织 细胞破碎多用此法，但真菌厚膜孢子则 较难打破。
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D、酶处理法：酶在一定的条件下能消化 细菌和细胞。例如在碱性(pH8.0)下，溶 菌酶可专一破坏G+菌细胞壁。此法适用 于多种微生物。
最重要的性质是免疫原性（immunogenicity）
免疫原—天然抗原、人工合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原
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1. 颗粒性抗原的制备
(1)红细胞抗原的制备：
A、新鲜血经无菌NS洗涤3次，取压积红细 胞并配制成2~5%，直接进行注射免疫。
B、新鲜血+抗凝剂— 4℃保存4W，免疫前 取适量抗凝绵羊血，按A处理。
抗体的制备
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一、一些基本概念
▪ 1. 克隆(clone) ▪ 是指无性繁殖细胞系，是由单一个祖先细胞
分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。在这个家 族的所有成员中，如无突变发生，其基因是 完全相同的。 ▪ 细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团
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2. 抗原决定簇 是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学 基团，又称表位(epitope)，抗原结合位点
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2. 可溶性抗原的制备
可溶性抗原可分为：细胞膜蛋白抗原、 细胞浆抗原、细胞核及核膜抗原。
(1)细胞破碎：有如下方法：
A、反复冻融法：置-15~-20 ℃冻结，然后 缓慢融化，反复2次，大部分细胞因胞内 冰晶的形成和溶剂浓度的突然改变而被 融破。此法适用于组织细胞，对微生物 的细胞作用较差。
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Ag
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抗原(antigen，Ag)
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▪ 3.单克隆抗体
(Monoclonal Antibody, McAb)
由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生 的同源抗体。
▪ 4.多克隆抗体
(Polyclonal Antibody，pAb)
用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动 物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多 种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清 实际上是含有多种抗体的混合物。
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粉碎方法有两种，一是高速组织捣碎机法： 注意要高速(1万rmp)，间断(每次30秒 ~1min)进行，时间过长会导致产热，破 坏抗原。另一种是研磨法(有时加入洗过 的海沙使研磨更有效)。
匀浆液经离心，沉淀中含大量的组织细胞 和碎片，上清液可提取可溶性抗原。
消化是用胃蛋白酶或胰酶，通过酶解将细 胞间质消化，获得游离单个细胞。
C、新鲜血去除纤维蛋白原后按B处理。
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(2)细菌抗原的制备：取标准菌株，接种。 H抗原：取有动力的菌株液，用 0.3~0.5%甲醛处理。 O抗原：菌液于100℃2.5h。 Vi抗原：杀菌后，加入1%的氯化钙溶 液。
(3)虫卵也可作为抗原，例如日本血吸虫 卵悬液。
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(4)组织细胞粗抗原：所用的组织必须是 新鲜或处理后低温(-40℃)保存的。器 官或组织材料得到后立即去除表面的 包膜或结缔组织及大血管，用无菌NS 进行灌注、洗涤至没有残血、污物， 在冷浴中将组织剪成小块后粉碎(匀 浆)/消化。
酶联免疫吸附实验，酶联免疫分析)
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抗体的制备技术经历了三代：
• 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用 抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗 体（polyclonal antibody）；
• 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对 抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆 抗体(monoclonal antibody, McAb)；
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பைடு நூலகம்
4
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Ag 2
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多克隆抗体
B3 B3 B3 B3
单克隆抗体
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单克隆抗体的特点
+ 抗体的性质相同，容易纯化、标记。 + 特异性强，具有抗原结合位点的专一
性。(不是抗原的专一性！) + 因结合位点的单一性，有时不易捕捉
抗原，一株单克隆抗体与抗原不易产 生凝集反应或沉淀反应。
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抗体制备技术
（二）单克隆抗体制备的技术要点 （三）影响杂交瘤技术的因素 （四）单克隆抗体的应用 • 三、基因工程抗体技术 （一）人源化抗体 （二）小分子抗体 （三）双特异性抗体 （四）抗体库技术
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二、多克隆抗体制备
(一)免疫原的制备
免疫原(immunogen)指能刺激机体免疫系统
产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原
但单克隆抗体有交叉反应
是由于不同的抗原上有完全相同的表 位(100%的交叉反应)，或有相似的表 位(不同程度的交叉反应)。
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多克隆抗体的特点
+ 多抗是单抗的混合物，因此多抗的性 质是一个群体综合的性质。
+ 特异性一般比单抗差 因为由不同性质的抗体组成，只要其 中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉 反应，所以多抗更容易有交叉反应。
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8
比单抗更容易捕捉抗原。 因为含有抗不同表位的抗体，多种抗 体都可与抗原结合。
抗体的纯化、标记比单抗难 因为含有各种不同类型、亚类的抗体， 提纯、标记的方法有所差别。同时，血 清中含有的杂蛋白比较多。
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购买抗体时要注意厂商的标注
适合于做什么实验，使用浓度多少
+ WB（Western blotting ，免疫印迹) + IHC (Immunohistochemistry, 免疫组织化学) + ICC (Immunocytochemistry, 免疫细胞化学) + IEM (Immunelectron microscopy,免疫电镜) + FCM (Flow Cytometry,流式细胞仪) + ELISA(enzyme linked immunosorbent assey,
• 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来， 称为基因工程抗体(genetic engineering antibody)。
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抗体制备技术
• 一、多克隆抗体制备 （一）免疫原的制备 （二）免疫动物 （三）免疫血清的纯化 （四）免疫血清的鉴定 （五）免疫血清的保存 • 二、单克隆抗体制备 （一）单克隆抗体制备原理