单克隆抗体制备 ppt课件
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单克隆抗体制备课件
单克隆抗体可以用于肿瘤免疫治疗,通过与肿瘤细胞表面的抗原结合,激活免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
肿瘤免疫治疗
单克隆抗体可以用于免疫调节治疗,通过与免疫细胞表面的受体或配体结合,调节免疫细胞的活性,治疗自身免疫性疾病和感染性疾病。
免疫调节治疗
单克隆抗体可以用于制备诊断试剂,通过与特定抗原或抗体结合,用于临床诊断和实验室检测。
单克隆抗体可以用于治疗疾病,如肿瘤、自身免疫性疾病等。
单克隆抗体可以用于生物标记,如免疫荧光、免疫组化等。
03
02
01
02
CHAPTER
单克隆抗体的制备流程
根据实验需求,选择适当的抗原作为免疫原,如蛋白质、多肽、细胞或组织等。
确定免疫原
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
对免疫原进行纯化,去除杂质,提高免疫效果。
免疫原的纯化
将免疫原与佐剂混合,增强免疫反应。
THANKS
感谢您的观看。
单克隆抗体由单一B细胞克隆产生,因此其结构和特性高度均一,具有很高的特异性。
高度均一
单克隆抗体与抗原的亲和力很高,可以检测出低浓度的抗原。
高亲和力
单克隆抗体可以在长期保存过程中保持稳定,便于长期保存和使用。
长期稳定
单克隆抗体可以用于诊断疾病,如免疫组化、酶联免疫吸附试验等。
诊断试剂
生物药物
生物标记
利用离心、过滤等方法去除细胞碎片和杂质,获得较为纯净的抗体溶液。
初步纯化
利用凝胶颗粒的孔径大小分离不同大小的抗体分子,去除杂蛋白和其他杂质。
凝胶过滤层析
利用抗体分子的电荷性质分离不同电荷状态的抗体分子,进一步提高纯度。
离子交换层析
04
CHAPTER
单克隆抗体的质量控制
肿瘤免疫治疗
单克隆抗体可以用于免疫调节治疗,通过与免疫细胞表面的受体或配体结合,调节免疫细胞的活性,治疗自身免疫性疾病和感染性疾病。
免疫调节治疗
单克隆抗体可以用于制备诊断试剂,通过与特定抗原或抗体结合,用于临床诊断和实验室检测。
单克隆抗体可以用于治疗疾病,如肿瘤、自身免疫性疾病等。
单克隆抗体可以用于生物标记,如免疫荧光、免疫组化等。
03
02
01
02
CHAPTER
单克隆抗体的制备流程
根据实验需求,选择适当的抗原作为免疫原,如蛋白质、多肽、细胞或组织等。
确定免疫原
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
对免疫原进行纯化,去除杂质,提高免疫效果。
免疫原的纯化
将免疫原与佐剂混合,增强免疫反应。
THANKS
感谢您的观看。
单克隆抗体由单一B细胞克隆产生,因此其结构和特性高度均一,具有很高的特异性。
高度均一
单克隆抗体与抗原的亲和力很高,可以检测出低浓度的抗原。
高亲和力
单克隆抗体可以在长期保存过程中保持稳定,便于长期保存和使用。
长期稳定
单克隆抗体可以用于诊断疾病,如免疫组化、酶联免疫吸附试验等。
诊断试剂
生物药物
生物标记
利用离心、过滤等方法去除细胞碎片和杂质,获得较为纯净的抗体溶液。
初步纯化
利用凝胶颗粒的孔径大小分离不同大小的抗体分子,去除杂蛋白和其他杂质。
凝胶过滤层析
利用抗体分子的电荷性质分离不同电荷状态的抗体分子,进一步提高纯度。
离子交换层析
04
CHAPTER
单克隆抗体的质量控制
单克隆抗体PPT课件
单克隆抗体的应用领域
01
02
03
04
基础研究
用于研究生物分子结构和功能 ,探索生命现象的本质。
诊断
用于检测生物样本中的抗原、 抗体、激素等生物分子,用于
疾病的诊断和监测。
治疗
用于治疗肿瘤、自身免疫性疾 病、感染性疾病等,通过与靶 分子结合,发挥治疗作用。
免疫学检测
用于检测食品、环境、生物武 器等中的有害物质和病原微生
高特异性
总结词
单克隆抗体具有极高的特异性,能够精确地识别和结合特定的抗原,几乎不会 与其它物质发生交叉反应。
详细描述
单克隆抗体的特异性表现在它能够精确地识别和结合细胞、蛋白质、病毒等抗 原的特定表位,这种结合具有高度的选择性,避免了与其他物质的交叉反应, 提高了检测和治疗的准确性。
高灵敏度
总结词
单克隆抗体可以用于鉴别血型、 检测血红蛋白病和白细胞表面抗 原,有助于血液疾病的诊断和治 疗。
生物标记与示踪研究
1 2
细胞分型
利用单克隆抗体标记不同细胞表面抗原,对细胞 进行分型和鉴定,有助于研究细胞发育、分化及 功能。
示踪研究
将单克隆抗体与荧光、放射性同位素等标记物结 合,追踪生物体内的物质分布、代谢和排泄过程。
良好的重复性
总结词
单克隆抗体的生产和制备具有高度的一致性和重复性,保证了产品质量和实验结果的可靠性。
详细描述
通过采用适当的细胞培养技术,可以在实验室条件下实现单克隆抗体的规模化生产和制备。由于单克 隆抗体的克隆来源单一,其生产和制备过程具有高度的一致性和重复性,这使得单克隆抗体的质量稳 定可靠,实验结果的可重复性强。
提高单克隆抗体的生产效率与质量
优化细胞培养条件
《单克隆抗体技术》课件
单克隆抗体的制备与纯化
单克隆抗体是通过杂交瘤细胞在体外培养或注射到动物体内进行体内培养产生的,经过一系列的分离 和纯化过程,最终获得高纯度、高特异性的单克隆抗体。
制备过程中通常采用各种层析技术、沉淀技术等对抗体进行分离和纯化,以确保获得高质量的单克隆 抗体。
单克隆抗体的鉴定与质量控制
鉴定是通过对单克隆抗体的免疫学特 性、生物学活性和分子结构等方面进 行检测和评估,以确定其特异性和质 量。
总结实验过程和结果,分析存在的问题和改 进方向,为后续实验提供参考和依据。
感谢您的观看
THANKS
生物标记物
用于研究细胞生物学、分子生物学 等领域。
03
02
生物药物
用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病等 。
免疫分析
用于检测生物样品中的抗原、抗体 等。
04
02 单克隆抗体技术的原理
杂交瘤细胞系的建立
杂交瘤细胞系的建立是单克隆抗体技 术的核心步骤之一,通过将免疫脾细 胞与骨髓瘤细胞融合,形成杂交瘤细 胞。
通过抗原-抗体反应检测杂交瘤细胞产生的 抗体特异性。
克隆筛选
通过选择性培养基筛选出能够产生所需抗体 的杂交瘤细胞克隆。
细胞培养与抗体纯化
将筛选出的杂交瘤细胞进行培养,并采用蛋 白质纯化技术获得单克隆抗体。
实验结果分析与总结
结果分析
对实验结果进行统计分析,评估杂交瘤细胞 的抗体产生能力和特异性。
总结
这些杂交瘤细胞既具有脾细胞无限增 殖的能力,又具有产生特异性抗体的 能力,从而为单克隆抗体的制备提供 了稳定的细胞源。
杂交瘤细胞的筛选与克隆化
在筛选过程中,通过抗原-抗体反应检 测杂交瘤细胞产生的抗体,筛选出能 够产生所需特异性抗体的杂交瘤细胞 。
《单克隆抗体》课件
05
单克隆抗体的未来发展
新型单克隆抗体的研发
总结词
随着生物技术的不断发展,新型单克 隆抗体的研发将更加活跃,以满足更 多治疗需求。
详细描述
新型单克隆抗体将通过基因工程技术 、蛋白质工程技术等手段进行设计和 优化,以改善其疗效、降低副作用和 降低生产成本。
单克隆抗体与其他技术的结合应用
总结词
单克隆抗体将与其他治疗手段和技术相结合,以实现更有效的疾病治疗和诊断 。
03
类型
IgG、IgM、IgA等。
单克隆抗体的发现和发展历程
1901年
Ehrlich提出“侧链学说”,认为抗体是 由细胞产生的化学物质。
1986年
FDA批准第一个单克隆抗体药物上市, 用于治疗非霍奇金淋巴瘤。
1975年
Kohler和Milstein首次成功制备出单克隆 抗体。
2014年
FDA批准第一个全人源单克隆抗体药物 上市,用于治疗类风湿性关节炎。
生物治疗
总结词
单克隆抗体在生物治疗中具有显著疗效 ,可用于治疗癌症、自身免疫病等多种 疾病。
VS
详细描述
通过靶向肿瘤细胞表面抗原或免疫系统中 的特定分子,单克隆抗体能够发挥抗癌作 用。例如,针对某些癌症的单克隆抗体药 物能够抑制肿瘤生长、扩散和转移,提高 患者生存率和生活质量。此外,在自身免 疫病治疗中,单克隆抗体也具有良好疗效 ,能够调节免疫系统,缓解单克隆抗体的概述 • 单克隆抗体的制备 • 单克隆抗体的特性 • 单克隆抗体的应用实例 • 单克隆抗体的未来发展
01
单克隆抗体的概述
单克隆抗体的定义
01
单克隆抗体
由单一B细胞克隆产生的具有 高度特异性识别抗原表位的抗
(培训课件)单克隆抗体PPT幻灯片
• 种类:氢氧化铝佐剂、短小棒状杆菌、脂多 糖、细胞因子、明矾等,其中弗氏不完全佐 剂(羊毛脂:石蜡油=1:5)和弗氏完全佐剂 (弗氏不完全佐剂+灭活的分枝结核杆菌) 是目前动物实验中最常用佐剂。
4
• 抗体:机体免疫细胞被激活后,由分化成熟的 B淋巴细胞-浆细胞合成、分泌的免疫球蛋白。
5
6
脾脏与B淋巴细胞(B lymphocytes)
淀)。
18
(2)HAT培养基的筛选
融合后细胞混合液
HAT培养基
2 weeks later
HT培养基
1 week later
正常培养基
19
HAT培养基筛选
H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶
(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)
骨髓瘤细胞 (myeloma cells)的选择原则
①克隆效应高,能在体外连续生长,倍增期短于24小时; ②缺乏HGPRT酶和TK酶; ③本身不合成Ig,且不抑制杂交瘤细胞中的Ig合成基因。 ④与小鼠淋巴细胞融合率相当高;
脾细胞的选择
由于目前常用的骨髓瘤细胞普遍来自Bal b/c小鼠,因此应尽 量选择同源的Bal b/c健康小鼠(8-12周)作为免疫动物。
死亡
20
3、阳性杂交瘤细胞的筛选(抗体的检测)
• 检测时间:杂交瘤细胞布满孔底1/10时开 始检测特异性抗体,进行筛选。
• 检测方法:最常用酶联免疫吸附法(ELISA) 间接免疫荧光法(IFA) 放射免疫法(RIA) 双相扩散法
3)离心,弃上清,加15mL HAT培养基,混匀,转入96孔 板(预先有HAT培养基培养的饲养细胞),每孔100 ul。
4
• 抗体:机体免疫细胞被激活后,由分化成熟的 B淋巴细胞-浆细胞合成、分泌的免疫球蛋白。
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6
脾脏与B淋巴细胞(B lymphocytes)
淀)。
18
(2)HAT培养基的筛选
融合后细胞混合液
HAT培养基
2 weeks later
HT培养基
1 week later
正常培养基
19
HAT培养基筛选
H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶
(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)
骨髓瘤细胞 (myeloma cells)的选择原则
①克隆效应高,能在体外连续生长,倍增期短于24小时; ②缺乏HGPRT酶和TK酶; ③本身不合成Ig,且不抑制杂交瘤细胞中的Ig合成基因。 ④与小鼠淋巴细胞融合率相当高;
脾细胞的选择
由于目前常用的骨髓瘤细胞普遍来自Bal b/c小鼠,因此应尽 量选择同源的Bal b/c健康小鼠(8-12周)作为免疫动物。
死亡
20
3、阳性杂交瘤细胞的筛选(抗体的检测)
• 检测时间:杂交瘤细胞布满孔底1/10时开 始检测特异性抗体,进行筛选。
• 检测方法:最常用酶联免疫吸附法(ELISA) 间接免疫荧光法(IFA) 放射免疫法(RIA) 双相扩散法
3)离心,弃上清,加15mL HAT培养基,混匀,转入96孔 板(预先有HAT培养基培养的饲养细胞),每孔100 ul。
高二生物选修三《单克隆抗体的制备》课件
单 点
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击 此
处
添 添
加 副
加 标
题
标 题
植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较项目
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞膜的流动性 细胞的全能性
细胞膜的流动性
细胞融合的步骤
去除细胞壁后诱导 原生质体融合
使细胞分散后诱导 细胞融合
诱导方法 用途
物理(离心、振荡、 电刺激)
化学(聚乙二醇)
获得杂种植株
物理、化学方法 (同左) 灭活的病毒
主要用于制备 单克隆抗体
○
三
二一
.
○
..
浆来 。结的抗概 抗
二 、
B
细 胞 (
源 :
淋 巴 细 胞 )
合 的 具
、 并 能
体 是 机
念 :
体
有与体
单 克
免该受 疫抗抗
隆
功原原 能发刺
抗
的生激 球特后
体
蛋异产
白性生
传统血清抗体的制备
特异性差、纯度低; 产量低、反应不够灵敏
2.单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的 原因是 每__一__种__B_淋__巴__细__胞__只__能__分__泌__一__种__特__异__性__抗体
3.产生抗体的细胞是_效__应__B_细__胞__(__浆__细_ 胞) 产生单克隆抗体的细胞是杂__交__瘤__细__胞__
抗原 刺激 动物体 抗原不纯
浆细胞 抗体
抗体不纯
每个浆细胞(B淋巴细胞)只能分泌一种抗体,由一 个B淋巴细胞增殖产生的细胞群分泌的抗体化学成份是单 一的。
如何获得化学性质单一、特异性强的抗体?
体外培养单个B淋巴细胞,提取分泌的抗体
击
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添 添
加 副
加 标
题
标 题
植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较项目
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞膜的流动性 细胞的全能性
细胞膜的流动性
细胞融合的步骤
去除细胞壁后诱导 原生质体融合
使细胞分散后诱导 细胞融合
诱导方法 用途
物理(离心、振荡、 电刺激)
化学(聚乙二醇)
获得杂种植株
物理、化学方法 (同左) 灭活的病毒
主要用于制备 单克隆抗体
○
三
二一
.
○
..
浆来 。结的抗概 抗
二 、
B
细 胞 (
源 :
淋 巴 细 胞 )
合 的 具
、 并 能
体 是 机
念 :
体
有与体
单 克
免该受 疫抗抗
隆
功原原 能发刺
抗
的生激 球特后
体
蛋异产
白性生
传统血清抗体的制备
特异性差、纯度低; 产量低、反应不够灵敏
2.单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的 原因是 每__一__种__B_淋__巴__细__胞__只__能__分__泌__一__种__特__异__性__抗体
3.产生抗体的细胞是_效__应__B_细__胞__(__浆__细_ 胞) 产生单克隆抗体的细胞是杂__交__瘤__细__胞__
抗原 刺激 动物体 抗原不纯
浆细胞 抗体
抗体不纯
每个浆细胞(B淋巴细胞)只能分泌一种抗体,由一 个B淋巴细胞增殖产生的细胞群分泌的抗体化学成份是单 一的。
如何获得化学性质单一、特异性强的抗体?
体外培养单个B淋巴细胞,提取分泌的抗体
单克隆抗体技术医学PPT
可溶性抗原:多糖、药物、激素、肽类等分子量小于 5000 Da 物质。
注意:可溶性抗原需与BSA、OA等载体交联后成颗粒性抗 原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体。
2、免疫动物
• (1)动物选择:一般采用与骨髓瘤细胞供体来源同一品 系的动物进行免疫(如:小鼠)。由于免疫动物品系与所 采用的骨髓瘤细胞差异较远,产生的杂交瘤细胞稳定性越 差。
(2)融合技术 一种是加入融合剂后直接离心使两种细胞紧密接触
(R<3000r/min),另一种是加入融合剂后轻轻搅动融 合。
• (3)提高融合频率的可能途径
•
融合过程中由于细胞特性、操作过程、PEG毒性等
多种因素都可能影响融合而减少融合频率。
•
方法:对亲本细胞预处理,改进融合技术,加入饲养
层细胞促进杂交瘤生长。
(1)体外制备
• 体外使用旋转培养瓶大量培养杂交瘤细胞,从上清 中获取单克隆抗体。但此方法产量低,一般培养液含量为 10~60μg/ ml。如果大量生产,费用较高。
• 随着大规模的生产,需大量血清而使成本增加,同 时血清会影响单抗的纯度,大量血清的存在干扰抗体活性。 1978年iscove用补充大豆类脂,牛血清蛋白,转铁蛋白等 添加成分的无血清培养基培养杂交瘤细胞成功。
• HAT选择性培养基: 培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H,氨基喋呤
Aminoopterin A及胸腺嘧啶核苷Thymidine T。
单克隆抗体制备原理
• HAT培养基的选择原理:
• (1)氨基蝶呤(A)是叶酸拮抗剂,可阻断细胞利用正常途 径合成DNA,细胞在含有氨甲蝶呤的培养基中不能通过正 常途径合成DNA。
3. 骨髓瘤细胞的准备
• 细胞株处于良好的生长状态,本身不能分泌任何抗体或免疫 球蛋白; • 瘤细胞的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系,以便两者组 织相容性抗原一致; • 细胞株保持HGPRT缺陷状态或TK缺陷状态。
注意:可溶性抗原需与BSA、OA等载体交联后成颗粒性抗 原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体。
2、免疫动物
• (1)动物选择:一般采用与骨髓瘤细胞供体来源同一品 系的动物进行免疫(如:小鼠)。由于免疫动物品系与所 采用的骨髓瘤细胞差异较远,产生的杂交瘤细胞稳定性越 差。
(2)融合技术 一种是加入融合剂后直接离心使两种细胞紧密接触
(R<3000r/min),另一种是加入融合剂后轻轻搅动融 合。
• (3)提高融合频率的可能途径
•
融合过程中由于细胞特性、操作过程、PEG毒性等
多种因素都可能影响融合而减少融合频率。
•
方法:对亲本细胞预处理,改进融合技术,加入饲养
层细胞促进杂交瘤生长。
(1)体外制备
• 体外使用旋转培养瓶大量培养杂交瘤细胞,从上清 中获取单克隆抗体。但此方法产量低,一般培养液含量为 10~60μg/ ml。如果大量生产,费用较高。
• 随着大规模的生产,需大量血清而使成本增加,同 时血清会影响单抗的纯度,大量血清的存在干扰抗体活性。 1978年iscove用补充大豆类脂,牛血清蛋白,转铁蛋白等 添加成分的无血清培养基培养杂交瘤细胞成功。
• HAT选择性培养基: 培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H,氨基喋呤
Aminoopterin A及胸腺嘧啶核苷Thymidine T。
单克隆抗体制备原理
• HAT培养基的选择原理:
• (1)氨基蝶呤(A)是叶酸拮抗剂,可阻断细胞利用正常途 径合成DNA,细胞在含有氨甲蝶呤的培养基中不能通过正 常途径合成DNA。
3. 骨髓瘤细胞的准备
• 细胞株处于良好的生长状态,本身不能分泌任何抗体或免疫 球蛋白; • 瘤细胞的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系,以便两者组 织相容性抗原一致; • 细胞株保持HGPRT缺陷状态或TK缺陷状态。
杂交瘤技术制备单克隆抗体PPT医学课件
磷酸核糖转移酶-HGPRT和胸腺嘧啶核苷激酶-TK两种 酶的参与)
HAT选择作用:
淋巴细胞:不能生长,5~7天死亡;DNA合成的主要 途径被A阻断 骨髓瘤细胞:不能生长,5~7天死亡;HGPRT和TK 缺乏,DNA合成的替代途径受阻 融合细胞:具有亲代双方的遗传性能,具有来自于淋 巴细胞的HGPRT和TK,可采用补救途径合成DNA, 因此可在HAT培养基上存活和繁殖。
免疫脾细胞
处于免疫状态脾脏中的B淋 巴母细胞或浆母细胞
动 物:
6~12周龄 20g~25g体重
2、骨髓瘤缺陷细胞株的培养和选择
对骨髓瘤细胞的要求:
(1)与免疫动物属同一品系(融合效率高、便于接种杂交瘤细胞在同一品 系小鼠腹腔中产生大量的单克隆抗体。) (2)选择HGPRT—株(次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型)或TK(胸 腺嘧啶核苷激酶)缺陷型的骨髓瘤细胞(细胞系在核酸类似物存在时会产生 HGPRT缺乏的突变株,该突变株不能在HAT培养基上生长。) (3)在细胞融合前两周复苏骨髓瘤细胞,保证骨髓瘤细胞处于对数 生长期。
骨髓瘤细胞的培养
1、采用一般的动物细胞培养液,小牛血清的浓度一般 在10%~20%,细胞的最大密度不得超过106cells/mL。
2、骨髓瘤细胞可以悬浮或半贴壁形一 般扩大培养以1:10稀释传代。)
HAT选择培养基的原理
HAT培养基:
H(Hypoxanthine):次黄嘌呤 A(Aminopterin):氨基喋呤;叶酸拮抗物,阻断DNA合成主要 途径 T(Thymidine):胸腺嘧啶核苷;“核苷酸前体”,供细胞通过替 代途径合成DNA
杂交瘤细胞的选择性培养
细胞DNA合成途经:
1.正常途径: 糖、氨基酸 核苷酸 DNA(可被A-氨基蝶呤阻断) 2、补救途径: 核苷酸前体 核苷酸 DNA (需要次黄嘌呤鸟嘌呤
HAT选择作用:
淋巴细胞:不能生长,5~7天死亡;DNA合成的主要 途径被A阻断 骨髓瘤细胞:不能生长,5~7天死亡;HGPRT和TK 缺乏,DNA合成的替代途径受阻 融合细胞:具有亲代双方的遗传性能,具有来自于淋 巴细胞的HGPRT和TK,可采用补救途径合成DNA, 因此可在HAT培养基上存活和繁殖。
免疫脾细胞
处于免疫状态脾脏中的B淋 巴母细胞或浆母细胞
动 物:
6~12周龄 20g~25g体重
2、骨髓瘤缺陷细胞株的培养和选择
对骨髓瘤细胞的要求:
(1)与免疫动物属同一品系(融合效率高、便于接种杂交瘤细胞在同一品 系小鼠腹腔中产生大量的单克隆抗体。) (2)选择HGPRT—株(次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型)或TK(胸 腺嘧啶核苷激酶)缺陷型的骨髓瘤细胞(细胞系在核酸类似物存在时会产生 HGPRT缺乏的突变株,该突变株不能在HAT培养基上生长。) (3)在细胞融合前两周复苏骨髓瘤细胞,保证骨髓瘤细胞处于对数 生长期。
骨髓瘤细胞的培养
1、采用一般的动物细胞培养液,小牛血清的浓度一般 在10%~20%,细胞的最大密度不得超过106cells/mL。
2、骨髓瘤细胞可以悬浮或半贴壁形一 般扩大培养以1:10稀释传代。)
HAT选择培养基的原理
HAT培养基:
H(Hypoxanthine):次黄嘌呤 A(Aminopterin):氨基喋呤;叶酸拮抗物,阻断DNA合成主要 途径 T(Thymidine):胸腺嘧啶核苷;“核苷酸前体”,供细胞通过替 代途径合成DNA
杂交瘤细胞的选择性培养
细胞DNA合成途经:
1.正常途径: 糖、氨基酸 核苷酸 DNA(可被A-氨基蝶呤阻断) 2、补救途径: 核苷酸前体 核苷酸 DNA (需要次黄嘌呤鸟嘌呤
人教版高中生物选修三《单克隆抗体的制备及应用》教学课件
阳性细胞
二、单克隆抗体的应用
(1)作为诊断试剂——最广泛应用
准确、高效、简易、快速
(如利用同位素标记的 单克隆抗体,可定位诊 断肿瘤、心血管畸形等)
二、单克隆抗体的应用
(2)运载药物
ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成。
ADC的抗体和药物各具有什么作用? 抗体主要发挥靶向运输作用;药物发挥治疗效应,如杀伤靶细胞。
一个极富创造力的方案: B淋巴细胞 骨髓瘤细胞
(能产生抗体)(能大量增殖)
融合细胞
(既能产生抗体,又能大量增殖)
米尔斯坦
科勒
一、单克隆抗体的制备
探究一
小组合作利用太空泥模拟细胞融合的过程(只考虑两个细胞融合)
随机融合后培养基中细胞的类 型有哪些?
一、单克隆抗体的制备
探究二
已知细胞分裂过程中,合成DNA有D和S两条途径,其中D途径能被氨基喋 呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径,但不能分裂增殖,其本 身也不能在体外长期存活。 鼠骨髓瘤细胞中只有D途径,没有S途径,但 可以在体外无限增殖,如果它的D途径被阻断的话,它会因为不能合成 DNA而死亡。
二、单克隆抗体的应用
(3)直接用于治疗疾病
实例:利妥昔单抗(美罗华)是一种针对 CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体,是第 一个被FDA批准用于临床治疗的单抗。进 入人体后能通过介导抗体依赖的细胞毒性 作用、补体依赖的细胞毒性作用和抗体与 CD20分子结合引起的直接效应,抑制细胞 生长,改变细胞周期以及凋亡等方式杀死 淋巴瘤细胞。
一、单克隆抗体的制备
1.传统抗体制备方法及缺陷 (1)方法: 向动物体内反复注射某种抗原
从动物血清中分离所需抗体 (2)缺点: 产量低、纯度低、特异性差
单克隆抗体技术讲解PPT课件
8
局限性 : (1)固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范 围 (2)反应强度不如多克隆抗体 (3)制备技术复杂、费时费工、价格较高
9
三、单克隆抗体技术的应用
1.检验医学诊断
(1)病原微生物抗原抗体的检测:乙肝表面抗原试纸
(2)肿瘤抗原的检测
(3)免疫细胞及其亚群的检测 (4)激素测定:早孕检测试纸、女性排卵检测试纸 (5)细胞因子的测定 (6)其他:吗啡类毒品检测试纸等
抗体工程制药
单克隆抗体的制备
1
掌握:单克隆抗体的概念和特点、制备原理, 制备方法及基本过程 熟悉:单克隆抗体技术的应用 了解:单克隆抗体的发展
2
主要内容
1.单克隆抗体的发展 2.单克隆抗体的概念和特点 3.单克隆抗体技术的应用
4.单克隆抗体的制备过程
3
没有单克隆抗体前人类所遇见的问题
银屑病
手口足病
陷细胞可以在此培养基中生存。是常用的骨髓杂交瘤细胞选择性培
养对筛选方法的要求: 多——大量样品一次检测; 快——迅速取得检测结果; 准——检测结果可靠性高; 灵——检测方法灵敏度高。 常用筛选方法: ELISA、IFA等
15
6. 克隆化过程
方法:有限稀释法 克隆建立的标准:连续两次以上100%阳性孔 饲养细胞:同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞
2.蛋白质的提纯
3.肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术
10
四、单克隆抗体制备过程
致敏淋巴细胞的准备
骨髓瘤细胞的准备
细胞融合 选择性培养 抗体分泌细胞的筛选 克隆化过程
单克隆抗体的制取
11
1.致敏淋巴细胞的准备
动物选择:品系、年龄、性别、健康状态 抗原接种:方式—体内、体外 剂量—0.5-100g 次数—视抗原而定 间隔—视抗原而定 佐剂—视抗原而定 收集时间:末次接种后72 h
单克隆抗体-公开课课件
B.不经过免疫的T淋巴细胞 D.不经过免疫的B淋 巴细胞
【例5】单克隆抗体是由下列哪种细胞产生的
( D)
• B淋巴细胞
B.T淋巴细胞
C.骨髓瘤细胞
D.杂交瘤细胞
【例6】用动物细胞工程技术获取单克隆抗体,下
列实验步骤中错误的是( B )
A.将抗原注入小鼠体内,获得能产生抗体的B淋 巴细胞
B.用纤维素酶×处理B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞
行常用__聚__乙__二__醇_____或___灭__活__的__病__毒__的诱导。
(3)假设仅考虑某两个细胞的融合,则可形成 3 种
类型的C细胞,因此需用____选__择__性__培养基筛选出D细 胞用于培养,D细胞的名称是 杂交瘤细胞 ,其特点
是___既__能__无__限__增__殖__又__能__产__生__特__异__性__抗__体__________。
二、单克隆抗体
1.抗体是由何种细胞产生的? 效应B细胞(浆细胞)
2.一个B淋巴细胞(浆细胞)能分 泌多种抗体吗?
每一个B淋巴细胞只分泌一 种特异性抗体 3.一种抗原侵入机体之后,引起 机体免疫反应产生的抗体只有一 种吗?
动物在免疫反应过程中,体 内产生的特异性抗体种类可多达 百万种以上
Ø出现在抗原分子表面、决定 抗原特异性Байду номын сангаас特殊化学基团.
(3)该方案的目的是__制__备__单__克__隆__抗__体___________。
3、治疗疾病和运载药物
主要用于治疗癌症治疗,单克隆抗体作为载体,运载抗 癌药物,形成“生物导弹”,准确杀伤癌变细胞。
“生物导弹” =单克隆抗体+药物
单抗导向,药物为弹头
【例4】科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融 合,得到杂交细胞,经培养可产生大量的单
单克隆抗体的制备.ppt
单克隆抗体制备
总结
单克隆抗体是由单一B淋巴细胞克隆所产生 的、只作用于一个特定抗原表位的均一抗体。
动物免疫 细胞融合 HAT选择性培养
阳性杂交瘤细胞的筛选
克隆化培养
建系与冻存
单克隆抗体的大量制备
谢 谢!
Balb/c 6-8周龄
3天
免疫脾细胞
单克隆抗体制备
制备流程 细胞融合
免疫脾细胞
+
PEG
SP2/0
骨髓瘤细胞(HGPRT-/TK-)
几种细胞类型? ?
单克隆抗体制备
制备流程 选择性培养:HAT培养基
HGPRT-/ TK- 不能生长
死亡
HGPRT+, TK+ 能够长期生长
生长繁殖
单克隆抗体制备
制备流程
单克隆抗体制备
单克隆抗体
(monoclonal antibody, McAb)
由单一B淋巴细胞克隆所产生的、只作 用于一个特定抗原表位的均一抗体。
三个“一”
单克隆抗体制备
制备原理
致敏的B淋巴细胞 骨髓瘤细胞
杂交瘤
杂交瘤技术
单克隆抗体制备
制备流程
动物免疫
1 23
采用与骨髓瘤细胞系来源相同的品系动物。
单克隆抗体制备
制备流程 杂交瘤细胞的建系与冻存
1、连续两次克隆化阳性率达100%; 2、体外连续传代三个月以上仍能稳定分泌抗体。
单克隆抗体制备
制备流程 单克隆抗体的大量制备
体外培养法(产量10-100μg/ml)
单克隆抗体制备
制备流程
单克隆抗体的大量制备 动物体内诱生法 (产量3-10mg/ml)
临床免疫学检验技术
单克隆抗体制备(共44张PPT)
单克隆抗体制备流程图
亲本细胞的选择与制备
骨髓瘤细胞 (NS-1)
骨髓瘤细胞需定期用
细胞株稳定,易传代培养;
细胞株本身不产生Ig
是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖 转换酶 缺陷株
(hypoxanthine-guanine phos phoribosyl transferase ,HGPRT)
最常用的骨髓瘤细胞是NS-1 和SP2/0细胞株
PEG可导致细胞膜上 脂类物质的物理结构 重排,使细胞膜容易 打开而有助于细胞融 合。
常见的几种融合形式
细胞DNA合成途经
HAT选择培养基
三种关键成分:
次黄嘌呤(hypoxanthine,H)
氨基蝶呤(aminopterin,A)
胸腺嘧啶(thymidine ,T)
◆是根据细胞内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的 生物合成途径设计的用于筛选杂交瘤细胞
因此在传统抗血清中,都含有许多种不同的抗体,分别针对这些不同的eptope。
每 mL 含有100 个 但除非抗原来源困难或有其它目的,我们仍采用传统方法,因免疫反应的启动机制非常复杂,生物整体的免疫反应是最可靠的。
单克隆抗体的制备流程和应用
细胞,若只要取一个 试采血 确定有抗体产生后,即可取出 脾脏以收集脾脏细胞(大多为B 细胞) 与骨髓瘤细胞进行 细胞融合。
2)体外增量培养法: 把杂交瘤细胞在大型培养槽 中培养,收集培养液上清即得抗体,但每 mL 只得 约数 mg,浓度较腹水稀约一千倍。最近有一种细 胞培养瓶,可产生如腹水般浓度的上清,但价格极 为昂贵 (IBS Integra Bioscience: Integra Celline)。
单克隆抗体的性质鉴定
种抗体;因此在传统抗血清中, 都含有许多种不同的抗体,分
《单克隆抗体应用》课件
单克隆抗体的特性
总结词
单克隆抗体具有高度特异性、一致性和稳定性。
详细描述
由于单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的,因此它具有高度特异性,能够与特 定的抗原结合。此外,由于单克隆抗体的生产过程是高度控制的,因此其质量和 性能具有一致性和稳定性。
02
单克隆抗体的应用领域
生物医学研究
抗体标记技术
利用单克隆抗体与特定抗原的结 合特性,对生物样本中的抗原进 行标记,用于检测、定位和追踪 抗原的表达和分布。
利用单克隆抗体标记的免疫细胞对肿瘤进行攻击,提高肿瘤治疗的疗效和患者的生存率。
03
单克隆抗体的研究进展
新药研发
肿瘤免疫治疗
利用单克隆抗体作为肿瘤免疫治 疗的靶点,通过激活免疫系统来 攻击肿瘤细胞。
自身免疫性疾病治
疗
针对自身免疫性疾病,如类风湿 性关节炎、红斑狼疮等,单克隆 抗体可以抑制免疫反应,缓解症 状。
《单克隆抗体应用》ppt课件
CONTENTS
• 单克隆抗体的基础知识 • 单克隆抗体的应用领域 • 单克隆抗体的研究进展 • 单克隆抗体的挑战与前景 • 单克隆抗体的未来展望
01
单克隆抗体的基础知识
单克隆抗体的定义
总结词
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的具有高度特异性的免疫球蛋白。
详细描述
单克隆抗体是由杂交瘤细胞产生的,这种细胞是由免疫的B细胞和骨髓瘤细胞融 合而成。这种杂交瘤细胞能够大量繁殖,并且只产生一种类型的抗体。
免疫疗法
单克隆抗体可以与免疫疗法结合,通过调节免疫 反应来增强抗肿瘤效果。
基因治疗
通过将基因导入单克隆抗体,可以实现更精确的 靶向治ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ,提高治疗效果并降低副作用。
单克隆抗体和基因工程抗体的制备 ppt课件
课件
11
(二) 杂交瘤细胞的选择性培养
杂交瘤细胞的筛选: 两种亲本细胞经PEG或其他方法处理后, 可融合 成不同类型的融合体, 正常的脾细胞在培养基中存活 仅5~7天,无需特别筛选,细胞的多聚体形式也容易 死去。而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。 要从中筛选出真正的杂交瘤细胞, 必须进行选择 性培养。目前,常用HAT培养基。 HAT培养基:
课件 13
细胞DNA生物合成途径示意图
糖+氨基酸
正常途径
氨基喋呤(A)
次黄嘌呤(H) HMP
HGPRT
核苷酸Βιβλιοθήκη 核苷酸前体DNA应急途径
TK
胸腺嘧啶(T) 课件
TMP
14
用来融合的瘤细胞是经毒性培养基选择 出来的缺乏 HGPRT 的细胞株,所以在 HAT选择培养基中不能生长。只有杂交 瘤细胞具有亲代双方的遗传特性,即既 有骨髓瘤细胞在体外无限繁殖的生命力 又有 B细胞经辅助途径合成 DNA 的能力, 故可在HAT培养基中长期存活并繁殖。
课件
7
2.小鼠骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞为B细胞系恶性肿瘤,能在体外 长期增殖并容易与B细胞融合。
课件
8
用于杂交瘤技术的骨髓瘤细胞 应符合的条件
①本身不分泌免疫球蛋白; ②为次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转化酶 (hypoxanthine-guanine- phospheribosyl-transfer ase , HGPRT ) 或 胸 腺 嘧 啶 激 酶 ( thymidinekinase,TK)缺陷的细胞株; ③瘤细胞能与B细胞杂交形成稳定的杂交瘤细胞; ④与B细胞融合率高。
课件
3
第一节 杂交瘤技术的基本原理
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实验研究的目的性 — 功能、形态、数量 实验设计的科学性 — 全面、动态、鲜明、对应、对照 实验方法的合理性 — 确切、先进 实验原理的内涵性 — 意义、要点 实验操作的规范性 — 准备、严格、准确、重复
单克隆抗体制备
1
免疫血清和单克隆抗体的制备
单克隆抗体制备
2
一、免疫血清的制备
1. 原理: 机体具有多种B细胞克隆,将适当的抗原物质注入人
单克隆抗体制备
4
4. 抗原的处理
1)颗粒性抗原:红细胞、菌体等制成悬液,不需佐 剂,直接免疫。菌体数1×1010个/ml 为宜。
2)可溶性蛋白质抗原(如人IgG)、病毒抗原、细菌 可溶性抗原组分等,可以直接与弗氏完全佐剂
(1:1 V/V)混合、乳化。 3)半抗原(多糖、多肽、激素、化学药品)需与载
2. 种类
1)卡介苗(BCG)、短小棒状杆菌(CP)、脂
多糖(LPS)、细胞因子;
2)氢氧化铝、明矾;
3)双链多聚肌苷酸:胞苷酸(poly I:C)和双
链多聚腺苷酸:鸟苷酸(poly A:U);
4)矿物油、脂质体、免疫刺激复合物
(ISCOMs)、CPG单克寡隆抗核体制备苷酸。
6
3. 弗氏完全佐剂
1)成分:羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。 2)配方:羊毛脂:液体石蜡 为1:2,也可1:1。
体偶联。常用载体有牛血清白蛋白(BSA)、钥 孔嘁血蓝素(KLH)、鸡血清蛋白(OA);偶联剂 有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。KLH是最 常用的载体蛋白,碳化二亚胺是最常用的偶联
剂。
单克隆抗体制备
5
佐剂
1. 概念
佐剂属非特异性免疫增强剂,与抗原一起注射或
预先注入机体时,可增强机体免疫应答或改变免疫应 答的类型。
1. 原理
根据致敏的单一B细胞克隆具有分泌特异性抗体和 骨髓瘤细胞在体外长期增殖的特性,采用细胞融合技术
在体外可将上述两种细胞融合形成杂交瘤细胞。杂交瘤
细胞因具备了B细胞和骨髓瘤细胞的双重特性,即可分 泌抗体,又能在HAT培养基中长期存活。因此,可通 过HAT选择性培养,筛选出克隆化目的杂交瘤细胞株, 再利用杂交瘤细胞培养上清或杂交瘤细胞接种小鼠产生
单克隆抗体制备
11
二 单克隆抗体的制备
1975年 Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞 与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的 杂交瘤细胞既可产生抗体,又可无性繁殖,从而创立 了单克隆抗体杂交瘤技术,这项技术上的突破使血清 学的研究进入了一个高度准确的新纪元。
单克隆抗体制备
12
或动物体内后可被不同的B细胞克隆同时识别,经过一定 时间,受刺激的B细胞克隆针对抗原表位的多少而产生相 应的特异性抗体,每一抗原表位都能诱发相应B细胞克隆 产生单克隆抗体,此获得的血清即为含多种单克隆抗体的 混合物,称之为多克隆抗体免疫血清,简称免疫血清。
优质免疫血清的产生,主要取决于抗原的纯度和免疫 原性,以及动物的免疫应答能力。此外,尚需考虑免疫途 径、抗原剂量、注射次数、时间间隔和有无佐剂等因素。
灭活卡介苗(2~ 20mg/ml)。
4. 弗氏不完全佐剂,成分不含卡介苗,其他同弗氏佐 剂。
5. 用法:佐剂与抗原等量混合,充分乳化。
单克隆抗体制备
7
动物选择
对免疫动物的主要要求有: 1. 应选择与抗原物质亲缘关系远的动物,特别是在制
备抗免疫球蛋白血清时更要注意。抗原物质的来源 生物与被免疫动物亲缘关系越远,免疫应答能力越 强,抗体产生水平越高,抗体亲和力也越强。
的腹水,获取大量的来源于杂交瘤细胞分泌的单克隆抗
体(monoclonal antibody, mAb)。
单克隆抗体制备
13
2. 试剂与器材
(1)细胞融合剂:聚乙二醇(PEG) (2)0.2mol/L L-谷氨酰胺贮存液 (3)200双抗(青、链霉素)溶液 (4)RPMI-1640培养液 (5)15%胎牛血清RPMI-1640培养液 (6)100氨基蝶呤(A)贮存液 (7)100次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液 (8)1 HAT培养液 (9)1HT培养液 (10)100 8-杂氮鸟嘌呤贮存液
2. 动物生理状态正常,发育成熟,体重符合规定。家 兔初始免疫体重通常在2~2.5kg。
3. 性别上以雄性成年动物较常用,也可采用雌性非妊 娠动物。不能应用患病或刚刚病愈、有免疫缺陷或 应用免疫抑制剂的动物。
单克隆抗体制备
8
免疫方法
1. 免疫途径 1)注射方法:静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内和 淋巴结等。 2)免疫方法:小剂量、多点、多途径方法。 3)颗粒性抗原(细菌悬液、红细胞悬液)采用小 鼠腹腔注射。 4)可溶性抗原(如IgG)采用弗氏完全佐剂的乳 剂(油包水型),家兔背部多点皮下注射法。
4)如抗体效价较低,继续加强免疫,一般需4~5 次。若仍不能达到抗体效价要求,应考虑重新免
疫。
3. 颗粒性抗原免疫 第一周注射2次,随后每周加强免疫1次,4~5天 试血。
单克隆抗体制备
10
3. 操作程序
1)健康雄性家兔体重2.5 ~ 3 kg,背部皮下多点注射。 2)基础免疫:抗原+完ห้องสมุดไป่ตู้佐剂 (抗原剂量4mg/只) 2ml
(1:1V/V) 吸入两支注射器内,三通连接, 反复推拉混合至乳化悬液。
3)加强免疫:抗原+不完全佐剂 (抗原剂量2.5mg/只), 间隔7~10天加强一次。约2~3次。
4)试 血:末次注射后第7天取少量静脉血,免疫双 扩试验血清检测,抗血清效价1:32(或 ELISA法检测抗体效价1:10,000)时颈 动脉放血,分离血清,分装,保存。
单克隆抗体制备
3
免疫原
1.抗原种类 微生物抗原、组织抗原和免疫球蛋白抗原。
2. 抗原纯度 一般的抗原只要达到亲合层析或SDS-PAGE电 泳纯即可。
3. 抗原用量 在一定范围内与免疫应答强度呈正相关。在应 用完全弗氏佐剂时,蛋白质类抗原剂量以0.5~ 1mg/kg体重为宜,加强免疫约为基础剂量的 1/2~1/3。
单克隆抗体制备
9
2. 可溶性抗原免疫 1)方法:基础免疫(初次免疫)后三周左右,进行 加强免疫,以后每隔2周加强免疫一次。 2)加强免疫次数取决于试血结果。家兔耳缘静脉、 小鼠眶静脉少量采血,分离血清,免疫双扩实验
测定血清效价>1:32或ELISA法测定抗体效价 >1:10 000,表明抗体效价较高,可采兔颈动脉 或心脏全部血液,分离血清。
单克隆抗体制备
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免疫血清和单克隆抗体的制备
单克隆抗体制备
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一、免疫血清的制备
1. 原理: 机体具有多种B细胞克隆,将适当的抗原物质注入人
单克隆抗体制备
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4. 抗原的处理
1)颗粒性抗原:红细胞、菌体等制成悬液,不需佐 剂,直接免疫。菌体数1×1010个/ml 为宜。
2)可溶性蛋白质抗原(如人IgG)、病毒抗原、细菌 可溶性抗原组分等,可以直接与弗氏完全佐剂
(1:1 V/V)混合、乳化。 3)半抗原(多糖、多肽、激素、化学药品)需与载
2. 种类
1)卡介苗(BCG)、短小棒状杆菌(CP)、脂
多糖(LPS)、细胞因子;
2)氢氧化铝、明矾;
3)双链多聚肌苷酸:胞苷酸(poly I:C)和双
链多聚腺苷酸:鸟苷酸(poly A:U);
4)矿物油、脂质体、免疫刺激复合物
(ISCOMs)、CPG单克寡隆抗核体制备苷酸。
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3. 弗氏完全佐剂
1)成分:羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。 2)配方:羊毛脂:液体石蜡 为1:2,也可1:1。
体偶联。常用载体有牛血清白蛋白(BSA)、钥 孔嘁血蓝素(KLH)、鸡血清蛋白(OA);偶联剂 有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。KLH是最 常用的载体蛋白,碳化二亚胺是最常用的偶联
剂。
单克隆抗体制备
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佐剂
1. 概念
佐剂属非特异性免疫增强剂,与抗原一起注射或
预先注入机体时,可增强机体免疫应答或改变免疫应 答的类型。
1. 原理
根据致敏的单一B细胞克隆具有分泌特异性抗体和 骨髓瘤细胞在体外长期增殖的特性,采用细胞融合技术
在体外可将上述两种细胞融合形成杂交瘤细胞。杂交瘤
细胞因具备了B细胞和骨髓瘤细胞的双重特性,即可分 泌抗体,又能在HAT培养基中长期存活。因此,可通 过HAT选择性培养,筛选出克隆化目的杂交瘤细胞株, 再利用杂交瘤细胞培养上清或杂交瘤细胞接种小鼠产生
单克隆抗体制备
11
二 单克隆抗体的制备
1975年 Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞 与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的 杂交瘤细胞既可产生抗体,又可无性繁殖,从而创立 了单克隆抗体杂交瘤技术,这项技术上的突破使血清 学的研究进入了一个高度准确的新纪元。
单克隆抗体制备
12
或动物体内后可被不同的B细胞克隆同时识别,经过一定 时间,受刺激的B细胞克隆针对抗原表位的多少而产生相 应的特异性抗体,每一抗原表位都能诱发相应B细胞克隆 产生单克隆抗体,此获得的血清即为含多种单克隆抗体的 混合物,称之为多克隆抗体免疫血清,简称免疫血清。
优质免疫血清的产生,主要取决于抗原的纯度和免疫 原性,以及动物的免疫应答能力。此外,尚需考虑免疫途 径、抗原剂量、注射次数、时间间隔和有无佐剂等因素。
灭活卡介苗(2~ 20mg/ml)。
4. 弗氏不完全佐剂,成分不含卡介苗,其他同弗氏佐 剂。
5. 用法:佐剂与抗原等量混合,充分乳化。
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动物选择
对免疫动物的主要要求有: 1. 应选择与抗原物质亲缘关系远的动物,特别是在制
备抗免疫球蛋白血清时更要注意。抗原物质的来源 生物与被免疫动物亲缘关系越远,免疫应答能力越 强,抗体产生水平越高,抗体亲和力也越强。
的腹水,获取大量的来源于杂交瘤细胞分泌的单克隆抗
体(monoclonal antibody, mAb)。
单克隆抗体制备
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2. 试剂与器材
(1)细胞融合剂:聚乙二醇(PEG) (2)0.2mol/L L-谷氨酰胺贮存液 (3)200双抗(青、链霉素)溶液 (4)RPMI-1640培养液 (5)15%胎牛血清RPMI-1640培养液 (6)100氨基蝶呤(A)贮存液 (7)100次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液 (8)1 HAT培养液 (9)1HT培养液 (10)100 8-杂氮鸟嘌呤贮存液
2. 动物生理状态正常,发育成熟,体重符合规定。家 兔初始免疫体重通常在2~2.5kg。
3. 性别上以雄性成年动物较常用,也可采用雌性非妊 娠动物。不能应用患病或刚刚病愈、有免疫缺陷或 应用免疫抑制剂的动物。
单克隆抗体制备
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免疫方法
1. 免疫途径 1)注射方法:静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内和 淋巴结等。 2)免疫方法:小剂量、多点、多途径方法。 3)颗粒性抗原(细菌悬液、红细胞悬液)采用小 鼠腹腔注射。 4)可溶性抗原(如IgG)采用弗氏完全佐剂的乳 剂(油包水型),家兔背部多点皮下注射法。
4)如抗体效价较低,继续加强免疫,一般需4~5 次。若仍不能达到抗体效价要求,应考虑重新免
疫。
3. 颗粒性抗原免疫 第一周注射2次,随后每周加强免疫1次,4~5天 试血。
单克隆抗体制备
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3. 操作程序
1)健康雄性家兔体重2.5 ~ 3 kg,背部皮下多点注射。 2)基础免疫:抗原+完ห้องสมุดไป่ตู้佐剂 (抗原剂量4mg/只) 2ml
(1:1V/V) 吸入两支注射器内,三通连接, 反复推拉混合至乳化悬液。
3)加强免疫:抗原+不完全佐剂 (抗原剂量2.5mg/只), 间隔7~10天加强一次。约2~3次。
4)试 血:末次注射后第7天取少量静脉血,免疫双 扩试验血清检测,抗血清效价1:32(或 ELISA法检测抗体效价1:10,000)时颈 动脉放血,分离血清,分装,保存。
单克隆抗体制备
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免疫原
1.抗原种类 微生物抗原、组织抗原和免疫球蛋白抗原。
2. 抗原纯度 一般的抗原只要达到亲合层析或SDS-PAGE电 泳纯即可。
3. 抗原用量 在一定范围内与免疫应答强度呈正相关。在应 用完全弗氏佐剂时,蛋白质类抗原剂量以0.5~ 1mg/kg体重为宜,加强免疫约为基础剂量的 1/2~1/3。
单克隆抗体制备
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2. 可溶性抗原免疫 1)方法:基础免疫(初次免疫)后三周左右,进行 加强免疫,以后每隔2周加强免疫一次。 2)加强免疫次数取决于试血结果。家兔耳缘静脉、 小鼠眶静脉少量采血,分离血清,免疫双扩实验
测定血清效价>1:32或ELISA法测定抗体效价 >1:10 000,表明抗体效价较高,可采兔颈动脉 或心脏全部血液,分离血清。