单克隆抗体制备 ppt课件
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实验研究的目的性 — 功能、形态、数量 实验设计的科学性 — 全面、动态、鲜明、对应、对照 实验方法的合理性 — 确切、先进 实验原理的内涵性 — 意义、要点 实验操作的规范性 — 准备、严格、准确、重复
单克隆抗体制备
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免疫血清和单克隆抗体的制备
单克隆抗体制备
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一、免疫血清的制备
1. 原理： 机体具有多种B细胞克隆，将适当的抗原物质注入人
单克隆抗体制备
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4. 抗原的处理
1）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐 剂，直接免疫。菌体数1×1010个/ml 为宜。
2）可溶性蛋白质抗原（如人IgG）、病毒抗原、细菌 可溶性抗原组分等，可以直接与弗氏完全佐剂
（1：1 V/V）混合、乳化。 3）半抗原（多糖、多肽、激素、化学药品）需与载
2. 种类
1）卡介苗（BCG）、短小棒状杆菌（CP）、脂
多糖（LPS）、细胞因子；
2）氢氧化铝、明矾；
3）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）和双
链多聚腺苷酸：鸟苷酸（poly A：U）；
4）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物
（ISCOMs）、CPG单克寡隆抗核体制备苷酸。
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3. 弗氏完全佐剂
1）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。 2）配方：羊毛脂：液体石蜡 为1：2，也可1：1。
体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（BSA）、钥 孔嘁血蓝素(KLH)、鸡血清蛋白（OA）；偶联剂 有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。KLH是最 常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联
剂。
单克隆抗体制备
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佐剂
1. 概念
佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或
预先注入机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应 答的类型。
1. 原理
根据致敏的单一B细胞克隆具有分泌特异性抗体和 骨髓瘤细胞在体外长期增殖的特性，采用细胞融合技术
在体外可将上述两种细胞融合形成杂交瘤细胞。杂交瘤
细胞因具备了B细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，即可分 泌抗体，又能在HAT培养基中长期存活。因此，可通 过HAT选择性培养，筛选出克隆化目的杂交瘤细胞株， 再利用杂交瘤细胞培养上清或杂交瘤细胞接种小鼠产生
单克隆抗体制备
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二 单克隆抗体的制备
1975年 Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞 与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的 杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立 了单克隆抗体杂交瘤技术，这项技术上的突破使血清 学的研究进入了一个高度准确的新纪元。
单克隆抗体制备
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或动物体内后可被不同的B细胞克隆同时识别，经过一定 时间，受刺激的B细胞克隆针对抗原表位的多少而产生相 应的特异性抗体，每一抗原表位都能诱发相应B细胞克隆 产生单克隆抗体，此获得的血清即为含多种单克隆抗体的 混合物，称之为多克隆抗体免疫血清，简称免疫血清。
优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫 原性，以及动物的免疫应答能力。此外，尚需考虑免疫途 径、抗原剂量、注射次数、时间间隔和有无佐剂等因素。
灭活卡介苗（2～ 20mg/ml）。
4. 弗氏不完全佐剂，成分不含卡介苗，其他同弗氏佐 剂。
5. 用法：佐剂与抗原等量混合，充分乳化。
单克隆抗体制备
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动物选择
对免疫动物的主要要求有： 1. 应选择与抗原物质亲缘关系远的动物，特别是在制
备抗免疫球蛋白血清时更要注意。抗原物质的来源 生物与被免疫动物亲缘关系越远，免疫应答能力越 强，抗体产生水平越高，抗体亲和力也越强。
的腹水，获取大量的来源于杂交瘤细胞分泌的单克隆抗
体（monoclonal antibody, mAb）。
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2. 试剂与器材
（1）细胞融合剂：聚乙二醇（PEG） （2）0.2mol/L L-谷氨酰胺贮存液 （3）200双抗（青、链霉素）溶液 （4）RPMI-1640培养液 （5）15%胎牛血清RPMI-1640培养液 （6）100氨基蝶呤（A）贮存液 （7）100次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液 （8）1 HAT培养液 （9）1HT培养液 （10）100 8-杂氮鸟嘌呤贮存液
2. 动物生理状态正常，发育成熟，体重符合规定。家 兔初始免疫体重通常在2～2.5kg。
3. 性别上以雄性成年动物较常用，也可采用雌性非妊 娠动物。不能应用患病或刚刚病愈、有免疫缺陷或 应用免疫抑制剂的动物。
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免疫方法
1. 免疫途径 1）注射方法：静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内和 淋巴结等。 2）免疫方法：小剂量、多点、多途径方法。 3）颗粒性抗原（细菌悬液、红细胞悬液）采用小 鼠腹腔注射。 4）可溶性抗原（如IgG）采用弗氏完全佐剂的乳 剂（油包水型），家兔背部多点皮下注射法。
4）如抗体效价较低，继续加强免疫，一般需4～5 次。若仍不能达到抗体效价要求，应考虑重新免
疫。
3. 颗粒性抗原免疫 第一周注射2次，随后每周加强免疫1次，4～5天 试血。
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3. 操作程序
1）健康雄性家兔体重2.5 ～ 3 kg，背部皮下多点注射。 2）基础免疫：抗原＋完ห้องสมุดไป่ตู้佐剂 (抗原剂量4mg/只) 2ml
(1:1V/V) 吸入两支注射器内，三通连接， 反复推拉混合至乳化悬液。
3）加强免疫：抗原＋不完全佐剂 (抗原剂量2.5mg/只)， 间隔7～10天加强一次。约2～3次。
4）试 血：末次注射后第7天取少量静脉血，免疫双 扩试验血清检测，抗血清效价1：32（或 ELISA法检测抗体效价1：10，000）时颈 动脉放血，分离血清，分装，保存。
单克隆抗体制备
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免疫原
1.抗原种类 微生物抗原、组织抗原和免疫球蛋白抗原。
2. 抗原纯度 一般的抗原只要达到亲合层析或SDS－PAGE电 泳纯即可。
3. 抗原用量 在一定范围内与免疫应答强度呈正相关。在应 用完全弗氏佐剂时，蛋白质类抗原剂量以0.5～ 1mg/kg体重为宜，加强免疫约为基础剂量的 1/2～1/3。
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2. 可溶性抗原免疫 1）方法：基础免疫（初次免疫）后三周左右，进行 加强免疫，以后每隔2周加强免疫一次。 2）加强免疫次数取决于试血结果。家兔耳缘静脉、 小鼠眶静脉少量采血，分离血清，免疫双扩实验
测定血清效价>1：32或ELISA法测定抗体效价 >1：10 000，表明抗体效价较高，可采兔颈动脉 或心脏全部血液，分离血清。
单克隆抗体制备
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免疫血清和单克隆抗体的制备
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一、免疫血清的制备
1. 原理： 机体具有多种B细胞克隆，将适当的抗原物质注入人
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4. 抗原的处理
1）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐 剂，直接免疫。菌体数1×1010个/ml 为宜。
2）可溶性蛋白质抗原（如人IgG）、病毒抗原、细菌 可溶性抗原组分等，可以直接与弗氏完全佐剂
（1：1 V/V）混合、乳化。 3）半抗原（多糖、多肽、激素、化学药品）需与载
2. 种类
1）卡介苗（BCG）、短小棒状杆菌（CP）、脂
多糖（LPS）、细胞因子；
2）氢氧化铝、明矾；
3）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）和双
链多聚腺苷酸：鸟苷酸（poly A：U）；
4）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物
（ISCOMs）、CPG单克寡隆抗核体制备苷酸。
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3. 弗氏完全佐剂
1）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。 2）配方：羊毛脂：液体石蜡 为1：2，也可1：1。
体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（BSA）、钥 孔嘁血蓝素(KLH)、鸡血清蛋白（OA）；偶联剂 有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。KLH是最 常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联
剂。
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佐剂
1. 概念
佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或
预先注入机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应 答的类型。
1. 原理
根据致敏的单一B细胞克隆具有分泌特异性抗体和 骨髓瘤细胞在体外长期增殖的特性，采用细胞融合技术
在体外可将上述两种细胞融合形成杂交瘤细胞。杂交瘤
细胞因具备了B细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，即可分 泌抗体，又能在HAT培养基中长期存活。因此，可通 过HAT选择性培养，筛选出克隆化目的杂交瘤细胞株， 再利用杂交瘤细胞培养上清或杂交瘤细胞接种小鼠产生
单克隆抗体制备
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二 单克隆抗体的制备
1975年 Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞 与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的 杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立 了单克隆抗体杂交瘤技术，这项技术上的突破使血清 学的研究进入了一个高度准确的新纪元。
单克隆抗体制备
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或动物体内后可被不同的B细胞克隆同时识别，经过一定 时间，受刺激的B细胞克隆针对抗原表位的多少而产生相 应的特异性抗体，每一抗原表位都能诱发相应B细胞克隆 产生单克隆抗体，此获得的血清即为含多种单克隆抗体的 混合物，称之为多克隆抗体免疫血清，简称免疫血清。
优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫 原性，以及动物的免疫应答能力。此外，尚需考虑免疫途 径、抗原剂量、注射次数、时间间隔和有无佐剂等因素。
灭活卡介苗（2～ 20mg/ml）。
4. 弗氏不完全佐剂，成分不含卡介苗，其他同弗氏佐 剂。
5. 用法：佐剂与抗原等量混合，充分乳化。
单克隆抗体制备
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动物选择
对免疫动物的主要要求有： 1. 应选择与抗原物质亲缘关系远的动物，特别是在制
备抗免疫球蛋白血清时更要注意。抗原物质的来源 生物与被免疫动物亲缘关系越远，免疫应答能力越 强，抗体产生水平越高，抗体亲和力也越强。
的腹水，获取大量的来源于杂交瘤细胞分泌的单克隆抗
体（monoclonal antibody, mAb）。
单克隆抗体制备
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2. 试剂与器材
（1）细胞融合剂：聚乙二醇（PEG） （2）0.2mol/L L-谷氨酰胺贮存液 （3）200双抗（青、链霉素）溶液 （4）RPMI-1640培养液 （5）15%胎牛血清RPMI-1640培养液 （6）100氨基蝶呤（A）贮存液 （7）100次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液 （8）1 HAT培养液 （9）1HT培养液 （10）100 8-杂氮鸟嘌呤贮存液
2. 动物生理状态正常，发育成熟，体重符合规定。家 兔初始免疫体重通常在2～2.5kg。
3. 性别上以雄性成年动物较常用，也可采用雌性非妊 娠动物。不能应用患病或刚刚病愈、有免疫缺陷或 应用免疫抑制剂的动物。
单克隆抗体制备
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免疫方法
1. 免疫途径 1）注射方法：静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内和 淋巴结等。 2）免疫方法：小剂量、多点、多途径方法。 3）颗粒性抗原（细菌悬液、红细胞悬液）采用小 鼠腹腔注射。 4）可溶性抗原（如IgG）采用弗氏完全佐剂的乳 剂（油包水型），家兔背部多点皮下注射法。
4）如抗体效价较低，继续加强免疫，一般需4～5 次。若仍不能达到抗体效价要求，应考虑重新免
疫。
3. 颗粒性抗原免疫 第一周注射2次，随后每周加强免疫1次，4～5天 试血。
单克隆抗体制备
10
3. 操作程序
1）健康雄性家兔体重2.5 ～ 3 kg，背部皮下多点注射。 2）基础免疫：抗原＋完ห้องสมุดไป่ตู้佐剂 (抗原剂量4mg/只) 2ml
(1:1V/V) 吸入两支注射器内，三通连接， 反复推拉混合至乳化悬液。
3）加强免疫：抗原＋不完全佐剂 (抗原剂量2.5mg/只)， 间隔7～10天加强一次。约2～3次。
4）试 血：末次注射后第7天取少量静脉血，免疫双 扩试验血清检测，抗血清效价1：32（或 ELISA法检测抗体效价1：10，000）时颈 动脉放血，分离血清，分装，保存。
单克隆抗体制备
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免疫原
1.抗原种类 微生物抗原、组织抗原和免疫球蛋白抗原。
2. 抗原纯度 一般的抗原只要达到亲合层析或SDS－PAGE电 泳纯即可。
3. 抗原用量 在一定范围内与免疫应答强度呈正相关。在应 用完全弗氏佐剂时，蛋白质类抗原剂量以0.5～ 1mg/kg体重为宜，加强免疫约为基础剂量的 1/2～1/3。
单克隆抗体制备
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2. 可溶性抗原免疫 1）方法：基础免疫（初次免疫）后三周左右，进行 加强免疫，以后每隔2周加强免疫一次。 2）加强免疫次数取决于试血结果。家兔耳缘静脉、 小鼠眶静脉少量采血，分离血清，免疫双扩实验
测定血清效价>1：32或ELISA法测定抗体效价 >1：10 000，表明抗体效价较高，可采兔颈动脉 或心脏全部血液，分离血清。