单克隆抗体制备技术

细胞的冻存与复苏
单抗的制备是一个较长的过程，中途可能会发生污 染而前功尽弃，所以要及时进行细胞的冻存：各个 时期的阳性孔杂交瘤细胞都要冻存。 将生长状态良好的细胞吹起后，1000rpm离心 5min，弃上清，用冻存液将细胞重悬，之后冻存， 程序如下：4 ℃放置1h，-20 ℃放置4h，-80 ℃过 夜，然后置液氮中保存。 细胞的复苏：从液氮中取出细胞，迅速置于37 ℃ 水浴锅中迅速融化细胞，营养液稀释后1000rpm离 心5min，弃上清，用营养液将细胞重悬之后常规培 养。
SP2/0细胞的准备 饲养层细胞的制备 免疫脾细胞的制备 融合 阳性杂交瘤的筛选 细胞的冻存与复苏 单克隆抗体的制备
SP2/0细胞的准备
SP2/0细胞在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基 作适应培养，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感 性。 融合前24-48 h将SP2/0细胞分瓶扩大培养，融合前 6 h，弃去瓶中培养液，换上新液。 融合时，选择形态良好、呈对数生长的SP2/0细胞， 将其从瓶壁上轻轻吹下，收集于15 mL离心管内， 1000 rpm离心5 min，用5 mL无血清的1640悬浮沉 淀，再离心一次，然后用无血清的1640培养液重 新悬浮，细胞计数，取107细胞悬液备用。
饲养层细胞的制备
融合前一天制备饲养细胞，一般选用8周龄Balb/C小鼠腹 腔巨噬细胞，步骤如下： 1. 将Balb/C小鼠摘除眼球采血（留做阴性对照），然后拉 颈处死，浸泡在75%酒精内，5min。 2. 用无菌剪刀剪开皮肤，用无菌镊子撕开皮肤，暴露腹膜。 3. 用5mL无菌注射器吸取5mL HAT选择培养液注入到小鼠 腹腔中（严禁刺破肠管），注射器不拔出，然后用无菌 镊子轻轻触动几次左右两侧腹膜，吸出营养液。 4. 重复1次上步操作，补足20mL HAT选择培养液，混匀后 加入2块96孔板，100μL/孔，放入37℃ CO2培养箱培养。 （此为经验操作，标准操作要进行细胞计数，浓度为 1×105/mL；如果做2块饲养细胞，吹两次即可，如果做3 块则加吹一次）
杂交瘤细胞的亚克隆的方法
24孔中细胞生长状态良好的杂交瘤细胞可以进行亚 克隆，将细胞用营养液吹起，适当稀释后进行细胞 计数，取100个细胞加入到20mL含20% FBS营养液 中，混匀后加到96孔板中，200μL/孔。也可以亚克 隆前一天制备饲养层细胞，再进行亚克隆。当细胞 长至孔底1/5-1/10时（大约10天）进行检测，将具 有单个克隆的阳性细胞孔继续进行第二次亚克隆， 当亚克隆之后检测到每个杂交瘤细胞孔都为阳性为 止，一般要经过3次亚克隆。
McAb相对亲和力的鉴定
采用ELISA法，用抗原包被ELISA板，一抗 为不同稀释度的单抗，二抗为羊抗鼠IgG， ABTS显色后测定A值。再以单抗的浓度的浓 度为横坐标，以其相应的A值为纵坐标，绘 制标准曲线。从标准曲线上根据直线中点对 应的各株单抗的浓度，即可求出各株单抗的 相对亲和力。
McAb识别抗原表位的鉴定
采用间接ELISA法相加试验，计算相加指数（AI） 来分析单抗决定簇，具体做法如下： 在包被好抗原的ELISA板中分别加入各种单抗（均 为稀释5倍）各100μL，以及各单抗两两组合各50 μL，37℃孵育1 h，后序步骤与常规ELISA相同。根 据下列公式计算AI，A1，A2分别为各株单抗的A值， A1+2为两两组合的混合单抗的A值。AI 大于10%表 示两株单抗针对不同抗原表位，具有相加效应； AI小于10%则表示两株单抗针对抗原表位相同或相 近。 AI= （A1+2- A1）/ A2×100%
性抗原不用佐剂，每次腹腔注射1×l06-1×107。
检测方法的建立及免疫效果的评价
A：建立成熟的检测方法是关键，一般有以下 几种方法： ELISA IPMA 免疫荧光 B：免疫效果的评价 一般于三免疫后一周，通过尾静脉采血检测 抗体产生情况，一般以稀释1000倍仍为阳性 判为免疫成功。
杂交瘤细胞株的建立
杂交瘤技术的基本原理
HAT培养基的选择原理： A：氨基蝶呤 (A)是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常 途径合成DNA，细胞在含有氨基蝶呤的培养基中不 能通过正常途径合成DNA。 B ：瘤细胞是 HGPRT 酶阴性细胞，自身不能通过替代 途径合成DNA而繁殖。 C：B细胞虽含有HGPRT，但不能在体外培养存活（只 存活5~7d，且功能下降)。 D：融合细胞含有B细胞和瘤细胞，其中瘤细胞核利用 B细胞的HGPRT酶进行旁路合成DNA而存活。
免疫脾细胞的制备
加强免疫3-5天后小鼠眼球采血（作为阳性对照， 尽量多的采血，否则脾中红细胞较多，影响融 合），然后拉颈处死，浸泡在75%酒精内，5min。 用无菌剪刀剪开皮肤，无菌镊子撕开皮肤，暴露 腹膜；再用无菌剪刀剪开腹膜，暴露脾脏；无菌 取脾脏，无血清1640洗一次，去除结缔组织；无 菌注射器吸取1640培养液，将脾细胞吹出； 1000rpm离心5min，细胞用1640培养液洗1次，细 胞计数，取5×107-1×108脾细胞悬液备用。
融合后各种细胞的情况
培养天数 0 1-2 3-4 5-7 7-14 脾细胞 骨髓瘤细胞 饲养细胞 良好 良好 良好 变形 变形 杂交瘤细胞 可见融合细胞 成2-3个亮细胞 成簇3-5，10个细胞 100个左右细胞呈小岛 1/3-1/5孔底面积
良好 良好 开始死亡 锐减 大部死亡 几乎完全死亡 死亡 死亡 死亡 死亡
前3 d加强免疫，腹腔注射0.5 mL含50-100 µ g纯化的蛋白。 3-5
天后用于融合。
免疫程序
免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原，要依抗原性的
强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗
原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为100g，
第二次为50g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞
亚克隆过程中注意事项
亚克隆之前可以制备饲养层细胞，促进杂交瘤细胞 生长；如果细胞状态好，也可以不用饲养层细胞。 在细胞计数前应该将杂交瘤细胞做适当的稀释，稀 释倍数根据细胞量而定，10-100倍不等。细胞计数 时将细胞控制在2-10×104/mL，这样计数时即快又 准。 第一次亚克隆时，为了确保成功，可以取200个细 胞进行亚克隆。 如果细胞生长不良，可以中途换液，把细胞吹散。
换液：融合之后5d换液，吸出150μL，加入200 μL HT营 养液。
融合过程中注意事项
SP2/0细胞与免疫脾细胞数比例适当。 两种细胞要处于较好的状态，吹吸细胞时要 轻柔。 PEG融合之后，加营养液中和时要缓慢，以 免将破坏融合细胞。
阳性杂交瘤的筛选
杂交瘤细胞长到孔底1/5-1/10时可以进行检测，一般情况 下10d即可；还可以当营养液发黄时检测。 取样：无菌取杂交瘤培养上清，然后在原孔中加入HT培 养液。 应用已经建立起的检测方法筛选阳性孔，以制备PCV2Cap单抗为例： 用重组PCV2-Cap蛋白和野生型杆状病毒包被ELISA板 进行平行检测，每孔加入50μL杂交瘤细胞培养上清液 （如果同时检测项目繁多，可以统一稀释2-5倍进行检 测）。重组PCV2-Cap蛋白检测为阳性而野生型杆状病毒 为阴性的的杂交瘤细胞转入24孔板进行扩大培养（HT培 养液）， 长至80%单层时再检测一次，如果仍然为阳性 则立即进行进行亚克隆。
融
合
将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10-1：5的比例混合在一起，在15mL离 心管中用无血清1640洗1次，离心，1000rpm,5min;弃上清，用吸管吸 净残留液体，以免影响PEG浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀 略松动。 60s内加入37℃预温的1mL 50%PEG溶液，边加边轻微摇动。37℃水 浴静置作用90s。 加37℃预温的1640培养液以终止PEG作用，首先，1 min加入1 mL， 然后在5 min内缓慢加入10mL，终止后置于37℃作用5min。 离心，800rpm, 5min。 弃上清，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动，用40mL含HAT选 择培养液轻轻重悬。 将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μL。一般 一个免疫脾脏可接种4-6块96孔板。 将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。
McA来自百度文库的Ig类与亚类的鉴定
采用商品化的亚类鉴定试剂盒进行。
Western-blot分析
以抗PCV2 的单抗为例：取纯化的PCV2病毒 进行SDS-PAGE分析，然后将其转印到硝酸 纤维素膜（NC）上，与筛选到的5株单抗进 行Western-blot，以SP2/0培养上清作为对照， HRP-Goat Anti-Mouse IgG(H+L)为二抗，用3， 3′-二氨基联苯胺（DAB）底物溶液显色、拍 照。
单克隆抗体的鉴定
抗体特异性的鉴定 McAb的Ig类与亚类的鉴定 Western-blot分析 McAb中和活性的鉴定 McAb识别抗原表位的鉴定 McAb亲和力的鉴定
抗体特异性的鉴定
除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外， 还应用与其抗原成分相关的其它抗原 进行交叉试验，方法可用ELISA、 IFA、IPMA等法。
阳性杂交瘤的筛选过程中注意事项
检测杂交瘤细胞的时机很重要，早了抗体产 生量少，不易检出；晚了细胞死亡较多，不 利于后续培养及亚克隆。 从96孔板中取样品之后应立即补上HT培养 液，利于细胞保持较好的状态。 取样时做好标记，以免造成错误。
杂交瘤细胞的亚克隆原则
对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克 隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌 的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长 速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞 争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克 隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆， 以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从 而丧失产生抗体的能力。
单克隆抗体制备技术
2008年11月6日
杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术的基本原理
1：HAT选择培养基： 次黄嘌呤(hypoxanthine,H) 氨基蝶呤(aminopterin,A) 胸腺嘧啶核苷(thymidine,T). 2：细胞的DNA合成一般有两条途径： A：由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为 重要的辅酶参与反应。 B：在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在下，经次黄嘌呤磷酸 核糖转化酶(HGPRT)或胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化下合 成DNA。
免疫程序与检测方法的建立
免疫程序 建立检测方法 检测免疫效果
免疫程序
取6-8周龄Balb／C雌鼠，首免，每只鼠用0.5 mL含50 µ g的 重组蛋白与10 % 体积的ISA15A VG 佐剂混匀，颈背部皮下多点 注射；间隔3 w进行二免，免疫原、剂量和方法同上；再间隔2
w进行三免，免疫原不含佐剂，腹腔注射，剂量同上。细胞融合
McAb中和活性的鉴定
以抗PCV2单抗为例，用固定病毒稀释抗体的方法 进行病毒中和试验用于检测单抗的中和活性。将杂 交瘤细胞培养上清液和腹水按 1: 2系列稀释，分别 与含有 200 个TCID50 的 PCV2/LG 株等体积混合， 置37 ℃感作3 h；同设 PCV2 阳性血清、SP2/0 细胞 培养上清作为阳性和阴性对照。病毒接种细胞培养 至72 h，固定细胞，用 PCV2 阳性血清进行IPMA检 测各孔病毒抗原反应，将能够抑制50 %病毒增殖的 抗体最高稀释倍数定为抗体中和效价。
单克隆抗体的制备
培养上清法 将阳性杂交瘤扩大培养，直到细胞全部死 亡，收集培养液冻存备用，该法单抗含量少。 腹水的制备 常规是先腹腔注射0.5mL Pristane (降植烷) 或液体石腊于BaLb／c鼠，1周后腹腔注射1×106个杂交 瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动 物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频 于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一 般一只小鼠可获1～10mL腹水。也可用注射器抽取腹水， 可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达520mg/ml， 这是目前最常用的方法，还可将腹水中细 胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。