单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程1.鼠标免疫：选择合适的抗原，并将其注射到小鼠或其他啮齿动物的体内。
这样可以激发小鼠体内的免疫系统产生特异性的抗原抗体。
2.细胞融合：在小鼠免疫周期结束后，收集其脾细胞，并将其与癌细胞（如骨髓瘤细胞）进行融合。
这一步骤将产生一组称为杂交瘤细胞的细胞群体，具有免疫系统的特异性。
3.筛选和扩增：将融合细胞在含有抗生素的培养基中进行筛选，以去除非融合细胞和未融合的B细胞。
然后，将融合细胞转移到含有较低抗生素浓度的培养基中，以扩增单克隆细胞株。
4.克隆：通过稀释稀释法或限稀稀释法，将单个细胞分离成单个细胞，并将其分别培养在微孔板中。
培养一段时间后，进行测序和酶联免疫吸附试验（ELISA）等测试，以筛选出产生特异性抗体的克隆。
5.生产和纯化：确定产生特异性抗体的克隆后，可以进行大规模的生产和纯化。
将克隆细胞移植到大容量培养器中，进行大规模培养。
然后，通过收集和离心等步骤收集细胞上清液，获取抗体。
6.特性和稳定性测试：对生产的抗体进行特性和稳定性测试，以确定其特异性、亲和力、稳定性和纯度等参数。
这些测试通常包括ELISA、Western blot、免疫组织化学（IHC）等。
7.应用：将制备好的单克隆抗体用于特定的应用，如免疫组化、免疫印迹、流式细胞术等。
根据需要，可能需要对抗体进行标记，如荧光标记或酶标记，以便在特定实验中进行检测。
总之，单克隆抗体制备流程是一个复杂而耗时的过程，需要经过多个步骤来获得特异性和高亲和力的抗体。
这些抗体可以用于研究、诊断和治疗等领域，对于科学研究和临床应用有着重要的意义。
单克隆抗体的制作流程
单克隆抗体的制作流程一、前期准备工作1. 确定目标抗体：根据研究需求确定需要制备的单克隆抗体。
2. 筛选免疫原：选择适合的免疫原，如蛋白质、多肽、细胞等。
3. 动物选择：选择适合的动物，如小鼠、大鼠、兔子等。
4. 免疫计划设计：设计出合理的免疫计划，包括免疫剂量、次数、间隔时间等。
二、免疫过程1. 免疫原制备：将所选的免疫原纯化或合成后进行检测和确认。
2. 免疫动物注射：将免疫原与佐剂混合后注射到动物体内，按预定计划进行多次注射。
3. 血清采集：在最后一次注射后采集动物血清，检测抗体滴度是否达到预期水平。
三、杂交细胞制备1. 细胞系选择：选择适合的细胞系如SP2/0或NS0等。
2. 细胞培养：将细胞系培养至稳定生长状态，并进行筛选和确认。
3. 细胞融合：将免疫小鼠脾细胞与SP2/0或NS0细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤筛选：利用HAT培养基对杂交瘤进行筛选，筛选出产生单克隆抗体的杂交瘤。
四、单克隆抗体制备1. 单克隆细胞培养：将单个杂交瘤细胞进行单克隆分离和培养。
2. 单抗酶标法检测：利用ELISA等技术检测单克隆抗体的特异性和亲和力。
3. 大规模培养：将筛选出的单克隆细胞进行大规模培养，得到足够多的单克隆抗体。
4. 纯化和鉴定：通过亲和层析、离子交换层析等技术对单克隆抗体进行纯化，并进行质量鉴定。
五、应用1. 体外实验应用：如ELISA、Western blotting等技术中作为检测试剂使用。
2. 体内实验应用：如流式细胞术、组织切片染色等技术中作为荧光标记或特异性结合试剂使用。
3. 临床应用：如治疗肿瘤、自身免疫性疾病等方面的治疗药物。
六、总结单克隆抗体的制备流程包括前期准备工作、免疫过程、杂交细胞制备、单克隆抗体制备和应用等环节。
其中，前期准备工作和免疫过程是制备成功的关键，而单克隆抗体制备需要经过多次筛选和鉴定才能得到高质量的单克隆抗体。
单克隆抗体在医学和生命科学领域有着广泛的应用前景，对于推动科学发展具有重要意义。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程单克隆抗体是通过从一个单一的B细胞克隆中获得的抗体，具有高度特异性和亲和力。
单克隆抗体制备流程主要包括以下几个步骤：免疫原选择、免疫动物注射、细胞融合、筛选和鉴定、扩大培养和纯化。
1. 免疫原选择选择一个适当的免疫原对于获得高质量的单克隆抗体非常重要。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类或其他小分子。
在选择免疫原时，需要考虑其特异性、稳定性以及是否能够激发机体产生免疫应答。
2. 免疫动物注射选择适当的实验动物（如小鼠）作为宿主，将免疫原与佐剂混合后注射到动物体内，激发机体产生特异性抗体。
通常情况下，需要进行多次注射以增强机体对免疫原的应答。
3. 细胞融合在动物免疫后，需要从其体内获得抗体产生的B细胞。
一种常用的方法是选择脾细胞作为B细胞的来源。
将脾脏取出并制备成单细胞悬液，然后与骨髓瘤细胞（如SP2/0或NS0）进行细胞融合。
这一步骤通过加入聚乙二醇（PEG）等化合物来促进细胞融合。
4. 筛选和鉴定在细胞融合后，需要对混合细胞进行筛选和鉴定，以筛选出产生特异性抗体的杂交瘤细胞。
常用的筛选方法包括限稀稀释法、ELISA法和免疫组化等。
将混合细胞进行适当稀释，使每个孔中只包含一个杂交瘤细胞，并培养在含有高浓度免疫原的培养基中。
然后使用特异性检测方法检测孔中是否存在特异性抗体。
5. 扩大培养一旦筛选出产生特异性抗体的杂交瘤细胞，需要将其扩大培养。
培养条件需要提供适当的营养物质和生长因子，以确保细胞的生长和抗体的产生。
扩大培养一般采用无血清培养基，如Hybridoma-SFM，并在合适的温度和CO2浓度下进行。
6. 纯化在获得足够量的单克隆抗体后，需要对其进行纯化以去除杂质。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等。
通过这些方法可以将单克隆抗体从细胞培养基中纯化出来，并得到高纯度的抗体样品。
7. 鉴定和验证需要对制备的单克隆抗体进行鉴定和验证。
鉴定主要包括检测抗体的特异性、亲和力和稳定性。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程1.免疫原的制备和动物的免疫：在开始制备单克隆抗体之前，首先需要制备免疫原。
免疫原可以是蛋白质、多肽、多糖、细胞表面抗原等。
制备免疫原的常用方法包括化学合成、原核表达系统、真核表达系统等。
制备好免疫原后，将其与适当的佐剂混合，然后通过注射等方式将免疫原引入到实验动物体内。
通常使用小鼠、大鼠或兔子作为免疫动物。
2.脾细胞的获取和混合瘤细胞的建立：在免疫过程中，免疫原会刺激机体产生大量的抗体。
当机体免疫反应达到一定水平时，需要从免疫动物体内获取脾脏，获得含有抗体产生细胞的脾细胞悬液。
将脾细胞与能激活脾细胞的细胞（如骨髓瘤细胞）进行融合，形成混合瘤细胞。
3.杂交瘤细胞的筛选和鉴定：将混合瘤细胞进行稀释，分装到96孔板中，使每个孔中只包含一个细胞。
这样每个孔中的细胞都是一个潜在的单克隆细胞。
随后，每个孔中的细胞在培养基中进行培养，以使细胞形成单个克隆。
根据杂交瘤细胞产生的特定抗体，可以使用ELISA等方法进行筛选和鉴定，以确定具有所需抗体的杂交瘤细胞。
4.单克隆抗体的生产和纯化：将筛选出来的单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养，并定期收集培养上清液以获取单克隆抗体。
为了提高单克隆抗体的纯度和浓度，通常需要对培养上清液进行多次纯化。
典型的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
综上所述，单克隆抗体的制备流程包括免疫原的制备和动物的免疫、脾细胞的获取和混合瘤细胞的建立、杂交瘤细胞的筛选和鉴定，以及单克隆抗体的生产和纯化等几个主要步骤。
每个步骤都需要精确操作和耐心等待，但最终可以获得高纯度和高特异性的单克隆抗体，这在生物医学研究和临床诊断中具有重要的应用价值。
多克隆抗体单克隆抗体的制备流程
多克隆抗体单克隆抗体的制备流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb）是指由单一B细胞克隆分离得到的抗体，其具有高特异性和高亲和力。
制备单克隆抗体的方法主要有杂交瘤技术和重组DNA技术。
以下是单克隆抗体制备的步骤及注意事项。
步骤一：抗原免疫1.选择合适的抗原：根据需要检测的分子或细胞表面标志物，选择合适的抗原。
2.免疫动物：常用的动物有小鼠、兔子等。
选择适合的动物后，根据抗原的种类和免疫动物对该抗原的敏感性，设计免疫方案。
3.免疫计划：免疫计划包括免疫剂量、免疫途径和免疫次数等。
通常先进行原位免疫，然后再以单体或混合抗原进行体内免疫。
步骤二：细胞融合1.收集脾细胞：在最佳时期，解剖免疫动物，取出脾脏。
2.细胞培养：将收集的脾细胞在无菌条件下分散成单个细胞，并在培养基中培养，以供细胞融合使用。
3.准备骨髓瘤细胞：选择合适的骨髓瘤细胞，例如NS0或SP2/0等。
将其培养至对数生长期。
4.细胞融合：在抗原刺激下，将脾细胞与骨髓瘤细胞以一定比例混合，用聚乙烯醇或其他化合物促进细胞融合。
步骤三：细胞筛选与扩展1. HT增重培养：用含有hprt缺陷的培养基筛选融合细胞，以选择杂交瘤细胞。
2. Limited Dilution扩展：以一细胞一孔的方式将杂交瘤细胞进行有限稀释，使其实现单克隆化。
3.细胞培养：将单克隆细胞株移植到培养瓶中，进行培养和扩增。
步骤四：单克隆抗体鉴定1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：用ELISA方法筛选单克隆细胞株，检测其抗原特异性。
2.免疫组织化学检测：将单克隆抗体应用于细胞和组织切片，检测其在特定细胞或组织中的反应。
3.流式细胞术：通过流式细胞仪检测单克隆抗体与特定细胞表面标志物的结合情况。
步骤五：单克隆抗体生产与纯化1.细胞培养：将单克隆细胞株培养扩增至一定程度。
2.抗体收集：将培养上清液进行抗体收集。
3.纯化与浓缩：利用亲和层析、离子交换、凝胶过滤等技术，对抗体进行纯化和浓缩。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程单克隆抗体是一种来源于单一B细胞克隆的抗体，具有高度的特异性和亲和力，被广泛应用于生物医药领域。
其制备流程主要包括免疫原制备、动物免疫、细胞融合、筛选和鉴定等步骤。
下面将详细介绍单克隆抗体制备的流程。
1. 免疫原制备。
首先需要准备纯化的抗原蛋白，可以是蛋白质、多肽、细胞膜蛋白等。
抗原蛋白的纯度和活性对单克隆抗体的制备至关重要，因此需要进行严格的纯化和活性检测。
通常采用亲和层析、离心、电泳等方法进行抗原蛋白的提取和纯化。
2. 动物免疫。
将纯化的抗原蛋白注射到小鼠或兔子等动物的体内，诱导其产生特异性抗体。
在免疫过程中，需要注意控制免疫程序，监测抗体滴度，以及合理调整免疫方案，以提高单克隆抗体的产量和质量。
3. 细胞融合。
从免疫动物中获取脾细胞或骨髓细胞，与骨髓瘤细胞（如SP2/0、NS-1等）进行融合，得到杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有较高的产抗体能力，能够长期稳定地分泌单克隆抗体。
4. 筛选和鉴定。
通过ELISA、免疫印迹、细胞免疫荧光等方法对杂交瘤细胞培养上清液进行筛选和鉴定。
筛选出特异性较强的单克隆抗体阳性杂交瘤细胞，并进行亚克隆的鉴定，最终获得单克隆抗体细胞株。
5. 扩大培养和纯化。
将筛选出的单克隆抗体细胞株进行扩大培养，获得大量的单克隆抗体上清液。
然后采用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等方法对单克隆抗体进行纯化，获得高纯度的单克隆抗体制剂。
总结。
单克隆抗体制备流程是一个复杂而又精细的过程，需要在每个环节都严格控制条件，确保单克隆抗体的产量和质量。
通过上述步骤的实施，可以获得高效、高纯度的单克隆抗体，为生物医药领域的研究和应用提供有力支持。
单克隆抗体制备流程
单抗制备流程1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备(一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／ ip (腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／ ip↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／ ip或iv(静脉内注射)↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。
要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般～1ml ／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程
一、抗体cDNA克隆
2、结合分离：抗体和抗原之间采用免疫学方法，进行亲和结合分离，在病理学中，可以采用细胞亲和免疫电泳或者细胞色素紧缩技术来进行识
别性结合分离抗体。
3、mRNA提取：使用RNAsy Plus Kit根据操作说明提取亲和结合分
离后的抗体的mRNA，用于cDNA合成。
4、cDNA合成：使用双链cDNA合成试剂盒，根据说明书操作，将mRNA合成双链cDNA。
5、克隆：将双链cDNA进行克隆，经过构建的一系列步骤，最终将cDNA克隆到载体上，构建出抗体cDNA克隆库。
二、抗体cDNA克隆抗体制备
1、选择克隆体：选择抗体cDNA克隆库中的抗体表达克隆，采用PCR
技术进行选择，并检测克隆体具有良好的免疫特性，可以快速确定最佳克
隆体。
2、表达载体构建：将最佳克隆体插入到表达载体中，构建出属于克
隆体的表达载体，以此保证克隆体的正确表达。
3、表达系统筛选：利用多种表达系统，筛选出最佳的表达系统，以
此来达到最佳的表达效果。
4、表达调控：对于最佳的表达系统，根据cDNA克隆体的特性，进行
最佳的表达调控，以此达到最佳的抗体表达效果。
单克隆抗体制备的原理和基本流程
单克隆抗体制备的原理和基本流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程一、免疫准备1）试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂2）常用免疫原：纯化蛋白、融合蛋白、多肽。
3）耗材：1ml、2ml注射器，橡胶管，1.5ml EP管，刀片（或毛细玻璃管），酒精棉球。
4）免疫动物：小鼠（BALB/c,雌性6-8周）5）乳化器（或者手动推）二、免疫过程1）免疫前取血取血方式：酒精棉擦拭尾部后（酒精多了伤口挤压出来的血液易分散），用锋利的刀片在小鼠尾部靠近静脉处划开小口，如下图箭头所示方向从上往下挤压血管，血从伤口处流出后用枪吸取放入EP管中（30ul血够用）离心取上清放冰箱备用。
此方法取血最为简单易行，避免眼球取血毛细管扎瞎老鼠眼睛。
注意点：①避免切断老鼠尾巴②切口劲量靠近尾末端，方便挤压血管③伤口消毒酒精不要太多，不利于伤口血液凝固。
2）免疫原制备：一支2ml注射器吸抗原，另一支注射器吸等量体积佐剂，橡胶管连接两支注射器来回推几下混匀，然后放乳化器上乳化（为防止蛋白变性，乳化器上可放置冰袋），大约来回推1500次左右可乳化完全（滴一小滴到静水中若不扩散说明乳化完全）。
换上1ml注射器针头免疫小鼠（2ml注射器免疫不好控制，可将乳化液转移到1ml注射器中免疫，但这样会损失部分抗原）。
注：①每只老鼠免疫蛋白量10-100ug,初次免疫参考量50ug蛋白/只，加强免疫及融合前冲击免疫25ug蛋白/只。
初次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂，融合前冲击免疫不使用佐剂可用缓冲液如PBS等稀释抗原（如果需要）。
②免疫量100ul-300ul/每只小鼠。
③多点免疫，一针不要打太多。
3）免疫方式和免疫时间根据免疫原决定免疫方式，皮下免疫和腹腔注射较为常见(纯化蛋白、融合蛋白多肽)。
皮下注射免疫，免疫时间间隔为2周，第三次免疫一周后（8-10d）采血测效价，决定是继续加强免疫还是冲击免疫后做融合。
较好的效价应该在10W以上，附表1 免疫接种时间表天数操作佐剂免疫方式0 初次免疫CFA 皮下14 第二次免疫IFA 皮下28 第三次免疫IFA 皮下36-38 收集血清测效价＿＿42 第四次免疫（如果需要）IFA 皮下50 收集血清测效价＿＿52 融合前冲击免疫＿腹腔55 收获脾细胞和融合＿＿注：如果第四面免疫血清效价仍然达不到要求可以继续加强免疫，如果免疫超过6次仍然达不到要求免疫基本失败。
单克隆抗体的制备过程及原理
单克隆抗体的制备过程及原理单克隆抗体（monoclonal antibody，简称mAb）是指使用浓度较高的、单种类且结构恒定的抗体，它是具有特定抗原性和可重复使用的特殊免疫球蛋白分子。
单克隆抗体由于特异性、可重复使用、界限清晰等具有重要的理论意义和重要的经济意义，在生物分子的研究、疾病的检测和治疗中已经发挥出重要作用。
单克隆抗体制备的方法有奥托尔·米勒法、佩泰法和融合细胞法等。
其制备过程通常包括以下7个步骤：生物反应物的提取、细胞培养，抗体浓度的上升、表达工艺的改进、纯化工艺的筛选、反应物的表达和功能检测。
（1）生物反应物的提取。
抗体制备过程的第一步是提取有用的生物反应物，例如鼠、猴、牛等动物的血液或淋巴液中的B细胞，或者细菌中的免疫球蛋白定量因子（immunoglobulin，Ig）分子等。
（2）细胞培养。
细胞培养就是将这些细胞表现成抗体制备所需的反应物，而培养方法又分为实验室筛选（laboratory selection）和大规模培养（large-scale production）。
（3）抗体浓度的上升。
在细胞培养过程中，抗体浓度也会随着增加，完成这一步后可以得到单克隆抗体。
（4）表达工艺的改进。
表达工艺是抗体分离纯化的关键步骤。
一般来说，可以采用谷氨酸免疫池（Glu-immune pool）、数字筛选技术（digital selection）、高通量测序技术（high-throughput sequencing）和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）等方法来筛选合适的抗体表达体。
（5）纯化工艺的筛选。
纯化工艺的筛选主要是为了分离抗体的原子或分子结构。
一般采用配体结合、离子交换和溶剂萃取等方法来实现这一步骤。
（6）反应物的表达。
在单克隆抗体表达之前，反应物需要进行细胞系建立和表达调控，以确保抗体的品质和产量。
（7）功能检测。
最后，需要进行单克隆抗体表达体的功能检测，以确定抗体是否具有良好的抗原性和稳定性。
单克隆抗体的主要步骤
单克隆抗体的主要步骤
单克隆抗体的制备主要分为以下几个步骤：
首先，选定合适的抗原并进行免疫，采集含有抗原特异性淋巴细胞的动物脾脏。
运用免疫规划原则，通过周期性注射抗原刺激动物的免疫系统生成大量特异性B
淋巴细胞。
其次，通过粘膜炎症急性期反应融合技术，将抗原特异性B淋巴细胞和肿瘤细胞进行融合，得到的细胞即为混源杂交瘤细胞。
然后，对获得的杂交瘤细胞进行筛选，挑选出能稳定分泌目标抗体的杂交瘤克隆。
利用ELISA、FACS等方法，能对杂交瘤筛选进行优化。
接着，研究人员会对所选克隆进行鉴定，了解其分泌的抗体与抗原的亲和力。
结合测序和质粒制备，进一步明确杂交瘤克隆的免疫学特征。
随后，利用无菌操作技术进行体外扩增和冻存，保证抗体质量的稳定。
最后，通过体内成瘤或者体外不系细胞培养的方式进行大量抗体生产，然后提取，纯化单克隆抗体。
密集摇瓶和生物反应器培养技术是临床试验阶段常用的抗体生产策略。
单克隆抗体的研究和生产是一个复杂且需要精细操作的过程，旨在通过这些步骤高效、可靠地生产出具有特异性的单克隆抗体。
对于抗体药物研发、生物技术、诊断试剂等领域，具有不可替代的重要价值。
单克隆抗体制备实验过程
单克隆抗体制备实验过程
抗体制备实验一般分为抗体克隆、筛选、纯化和表征四个步骤，其中
抗体克隆是抗体制备实验的前提步骤，克隆抗体是从雌配子小鼠体内得到
其对抗原的单克隆抗体，是抗体制备的关键步骤。
1. 合成抗原或者从天然资源中获取抗原：合成抗原包括多肽抗原
（如biotin-GSH等）和糖蛋白抗原（如活性细胞皮质激素等）；从天然
资源中获取抗原则包括病毒样本和免疫原，比如结核分枝杆菌的血清浆及
其他微生物。
2.接种抗原：根据抗原的不同，采用不同的接种方法，比如多肽抗原，可以采用皮下或肌肉注射的方法将抗原接种于雌配子小鼠身上，以致于小
鼠体内产生对抗原的抗体。
3.分离抗体：通过血液和胸腺组织中抗体的分离筛选，获取单克隆抗体。
4. 抗体克隆：从抗体分离所获得的抗体，经过细胞学的方法进行抗
体克隆。
克隆过程中，可以利用多肽抗原，利用细胞杂交的方法进行对单
克隆抗体的从cloned。
5.筛选单克隆抗体：利用免疫染色的方法进行抗体筛选和确认，以确
定抗体株。
6.抗体纯化：经过单克隆抗体筛选和确认后，可以利用离子交换柱等
方法进行抗体纯化，从而获得高纯度的抗体制剂。
单克隆抗体的制备流程及基本原理
单克隆抗体的制备流程及基本原理
原理：在体液免疫反应中，一个抗原分子上可能含有许多抗原决定簇（即表位），每个淋巴细胞都会产生针对一个抗原决定簇的特异性抗体，若能把此B细胞由脾脏中挑出来，单独培养成细胞株，则可得单一种类的抗体，只会对一种抗原决定簇反应，其专一性极高。
大量培养此细胞株，即可有质量一定、纯度均一的抗体，此即为单克隆抗体。
基本过程：先免疫动物，分离脾细胞，准备骨髓瘤细胞的准备，细胞融合，筛选与克隆融合细胞，最后大量制备单克隆抗体。
单克隆抗体制备的原理
单克隆抗体制备的原理
单克隆抗体制备的原理
单克隆抗体是指由同一种细胞分泌的具有相同结构和功能的抗体分子。
单克隆抗体制备的过程主要包括以下几个步骤：抗原制备、免疫动物、细胞融合、筛选和克隆。
1. 抗原制备
首先需要准备纯化的抗原，通常采用多肽、蛋白质或其他生物大分子
作为抗原。
这些抗原必须具有足够的纯度和特异性，以便在后续步骤
中能够有效地诱导特异性免疫反应。
2. 免疫动物
将纯化的抗原注射到实验动物体内，例如小鼠、大鼠或兔子等。
这些
实验动物会产生针对该特定抗原的免疫反应，并产生多种不同类型的
抗体。
3. 细胞融合
将产生针对目标抗原特异性的B淋巴细胞与肿瘤细胞进行融合，形成
杂交瘤（hybridoma）。
肿瘤细胞通常来自于小鼠或人类，由于其具
有不受限制的增殖能力，可以保证单克隆抗体的持续生产。
4. 筛选
对杂交瘤进行筛选，以确定产生特定单克隆抗体的杂交瘤。
通常采用ELISA、Western blotting等技术对杂交瘤进行筛选，以检测其是否
产生目标抗原的特异性抗体。
5. 克隆
将产生目标抗原特异性抗体的杂交瘤进行单克隆化处理。
这个过程中
需要将杂交瘤分离，并将其分别培养在不同的培养基上。
最终，每个
单一细胞会形成一个单克隆群落，并产生相同结构和功能的抗体分子。
总之，单克隆抗体制备是一项复杂而精密的过程。
通过以上步骤，可
以从多种不同类型的B淋巴细胞中筛选出具有特定结构和功能的单克
隆抗体，并为医学、科学等领域提供了广阔应用前景。
单克隆抗体制备流程图
单抗制备流程1975年,Kohler与Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元,也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产,要经过几个月的一系列实验步骤,下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备(一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1、颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0、5ml ip (腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0、5ml ip↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／0、5ml ip或iv(静脉内注射)↓取脾融合2、可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂,常用佐剂:福氏完全佐剂,福氏不完全佐剂。
要求抗原与佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状,放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0、8～1ml 0、2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0、5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上,不加佐剂,ip│ (5～7天后采血测其效价,检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫,剂量50～500μg为宜,ip或iv↓3天后取脾融合目前,用于可溶性抗原(特别就是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。
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单抗制备流程1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备(一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果.下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0。
5ml ip (腹腔内注射)↓2~3周后第二次免疫1×10７／0。
5ml ip↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv（静脉内注射)↓取脾融合2。
可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂，常用佐剂:福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。
要求抗原和佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态.商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│（一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip│（ip剂量不宜超过0。
5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2~3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜,ip或iv↓3天后取脾融合目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。
②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。
③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。
(二) 饲养细胞在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞,如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。
常用的饲养细胞有:小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用）、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。
小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄↓拉颈处死浸泡于75%酒精，消毒3～5分钟↓用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜↓用无菌注射器注入6～8ml培养液↓反复冲洗，吸出冲洗液↓放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟↓用20%小牛血清（NCS)或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数1×10５／ml↓加入96孔板，100μl／孔↓放入37℃CO2孵箱培养一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞,若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时,细胞浓度为5×106／ml,小鼠脾细胞为1×106／ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105／ml，均为100μl／孔。
(三) 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等.骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10~20%，细胞的最大密度不得超10６／ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长,只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT 的敏感性，每3～6月应用8~AG（8氮杂鸟嘌呤)筛选一次,以防止细胞的突变。
保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％，也是决定细胞融合的关键.(四) 免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。
一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次,置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。
一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。
二、细胞融合，选择杂交瘤（一）细胞融合流程（1) 取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数,取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。
（2) 同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次.(3）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml 塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。
（4）弃上清,用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
（5) 轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略加松动.(6）在室温下融合：①30秒内加入预热的1ml45％PEG（Merek，分子量4000)含5%DMSO，边加边搅拌。
②作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟.③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml，2ml,3ml，4ml，5ml和10ml.(7) 离心，800rpm，6分钟。
(8) 弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。
(9）根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。
（10) 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5%CO2孵箱培养.一般一块96孔板含有1×107脾细胞。
(二）HAT选择杂交瘤应用HAT 选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。
一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。
HT和HAT均有商品化试剂50×贮存,用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中。
因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl／孔。
所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。
我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2／3进行选择，可得到满意的筛选结果。
50×HATH：5×10-3MA: 2×10—5MT: 8×10—4M一般选择HAT选择培养液维持培养两周后,改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。
三、抗体的检测筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中,仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。
一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时,即可开始检测特异性抗体,筛选出所需要的杂交瘤细胞系。
检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则.常用的方法有:1。
ELISA用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测。
2。
RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。
3。
FACS（荧光激活细胞分类仪）用于检查细胞表面抗原的McAb检测。
4。
IFA用于细胞和病毒McAb的检测。
上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。
可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机.四、杂交瘤的克隆化和冻存克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。
犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。
在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。
要想将这些细胞彼此分开,就需要克隆化。
克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。
即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。
(一）克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。
1. 有限稀释法的程序①制备饲养细胞悬液(同融合前准备）②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml③取130个细胞放入6。
5ml含饲养细胞完全培养液,即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。
余下2。
9ml细胞悬液补加2.9ml 含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排,为每孔1个细胞。
余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。
④培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl／孔。
⑤第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。
注：初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT.2. 软琼脂法①软琼脂的配制含20％FCS（小牛血清）的2倍浓缩的RPMI16401％琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。
0.5％琼脂:由1份1％琼脂加1份含20％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成.置42℃保温。
②用上述0.5％琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用.③按100／ml,500／ml或5000／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液.④1ml 0。
5％琼脂液（42℃预热）在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。
⑤混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固,孵育于37℃，5%CO2孵箱中。
⑥4~5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养.⑦检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。
(二) 杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的.因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候,细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。
如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。
杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上,但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变,在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。