单克隆抗体的制备ppt课件
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单克隆抗体PPT课件
单克隆抗体的应用领域
01
02
03
04
基础研究
用于研究生物分子结构和功能 ，探索生命现象的本质。
诊断
用于检测生物样本中的抗原、 抗体、激素等生物分子，用于
疾病的诊断和监测。
治疗
用于治疗肿瘤、自身免疫性疾 病、感染性疾病等，通过与靶 分子结合，发挥治疗作用。
免疫学检测
用于检测食品、环境、生物武 器等中的有害物质和病原微生
高特异性
总结词
单克隆抗体具有极高的特异性，能够精确地识别和结合特定的抗原，几乎不会 与其它物质发生交叉反应。
详细描述
单克隆抗体的特异性表现在它能够精确地识别和结合细胞、蛋白质、病毒等抗 原的特定表位，这种结合具有高度的选择性，避免了与其他物质的交叉反应， 提高了检测和治疗的准确性。
高灵敏度
总结词
单克隆抗体可以用于鉴别血型、 检测血红蛋白病和白细胞表面抗 原，有助于血液疾病的诊断和治 疗。
生物标记与示踪研究
1 2
细胞分型
利用单克隆抗体标记不同细胞表面抗原，对细胞 进行分型和鉴定，有助于研究细胞发育、分化及 功能。
示踪研究
将单克隆抗体与荧光、放射性同位素等标记物结 合，追踪生物体内的物质分布、代谢和排泄过程。
良好的重复性
总结词
单克隆抗体的生产和制备具有高度的一致性和重复性，保证了产品质量和实验结果的可靠性。
详细描述
通过采用适当的细胞培养技术，可以在实验室条件下实现单克隆抗体的规模化生产和制备。由于单克 隆抗体的克隆来源单一，其生产和制备过程具有高度的一致性和重复性，这使得单克隆抗体的质量稳 定可靠，实验结果的可重复性强。
提高单克隆抗体的生产效率与质量
优化细胞培养条件
《单克隆抗体技术》课件
单克隆抗体的制备与纯化
单克隆抗体是通过杂交瘤细胞在体外培养或注射到动物体内进行体内培养产生的，经过一系列的分离 和纯化过程，最终获得高纯度、高特异性的单克隆抗体。
制备过程中通常采用各种层析技术、沉淀技术等对抗体进行分离和纯化，以确保获得高质量的单克隆 抗体。
单克隆抗体的鉴定与质量控制
鉴定是通过对单克隆抗体的免疫学特 性、生物学活性和分子结构等方面进 行检测和评估，以确定其特异性和质 量。
总结实验过程和结果，分析存在的问题和改 进方向，为后续实验提供参考和依据。
感谢您的观看
THANKS
生物标记物
用于研究细胞生物学、分子生物学 等领域。
03
02
生物药物
用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病等 。
免疫分析
用于检测生物样品中的抗原、抗体 等。
04
02 单克隆抗体技术的原理
杂交瘤细胞系的建立
杂交瘤细胞系的建立是单克隆抗体技 术的核心步骤之一，通过将免疫脾细 胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细 胞。
通过抗原-抗体反应检测杂交瘤细胞产生的 抗体特异性。
克隆筛选
通过选择性培养基筛选出能够产生所需抗体 的杂交瘤细胞克隆。
细胞培养与抗体纯化
将筛选出的杂交瘤细胞进行培养，并采用蛋 白质纯化技术获得单克隆抗体。
实验结果分析与总结
结果分析
对实验结果进行统计分析，评估杂交瘤细胞 的抗体产生能力和特异性。
总结
这些杂交瘤细胞既具有脾细胞无限增 殖的能力，又具有产生特异性抗体的 能力，从而为单克隆抗体的制备提供 了稳定的细胞源。
杂交瘤细胞的筛选与克隆化
在筛选过程中，通过抗原-抗体反应检 测杂交瘤细胞产生的抗体，筛选出能 够产生所需特异性抗体的杂交瘤细胞 。
《单克隆抗体》课件
05
单克隆抗体的未来发展
新型单克隆抗体的研发
总结词
随着生物技术的不断发展，新型单克 隆抗体的研发将更加活跃，以满足更 多治疗需求。
详细描述
新型单克隆抗体将通过基因工程技术 、蛋白质工程技术等手段进行设计和 优化，以改善其疗效、降低副作用和 降低生产成本。
单克隆抗体与其他技术的结合应用
总结词
单克隆抗体将与其他治疗手段和技术相结合，以实现更有效的疾病治疗和诊断 。
03
类型
IgG、IgM、IgA等。
单克隆抗体的发现和发展历程
1901年
Ehrlich提出“侧链学说”，认为抗体是 由细胞产生的化学物质。
1986年
FDA批准第一个单克隆抗体药物上市， 用于治疗非霍奇金淋巴瘤。
1975年
Kohler和Milstein首次成功制备出单克隆 抗体。
2014年
FDA批准第一个全人源单克隆抗体药物 上市，用于治疗类风湿性关节炎。
生物治疗
总结词
单克隆抗体在生物治疗中具有显著疗效 ，可用于治疗癌症、自身免疫病等多种 疾病。
VS
详细描述
通过靶向肿瘤细胞表面抗原或免疫系统中 的特定分子，单克隆抗体能够发挥抗癌作 用。例如，针对某些癌症的单克隆抗体药 物能够抑制肿瘤生长、扩散和转移，提高 患者生存率和生活质量。此外，在自身免 疫病治疗中，单克隆抗体也具有良好疗效 ，能够调节免疫系统，缓解单克隆抗体的概述 • 单克隆抗体的制备 • 单克隆抗体的特性 • 单克隆抗体的应用实例 • 单克隆抗体的未来发展
01
单克隆抗体的概述
单克隆抗体的定义
01
单克隆抗体
由单一B细胞克隆产生的具有 高度特异性识别抗原表位的抗
(培训课件)单克隆抗体PPT幻灯片
• 种类：氢氧化铝佐剂、短小棒状杆菌、脂多 糖、细胞因子、明矾等，其中弗氏不完全佐 剂（羊毛脂：石蜡油=1:5）和弗氏完全佐剂 （弗氏不完全佐剂＋灭活的分枝结核杆菌） 是目前动物实验中最常用佐剂。
4
• 抗体：机体免疫细胞被激活后，由分化成熟的 B淋巴细胞-浆细胞合成、分泌的免疫球蛋白。
5
6
脾脏与B淋巴细胞(B lymphocytes)
淀）。
18
（2）HAT培养基的筛选
融合后细胞混合液
HAT培养基
2 weeks later
HT培养基
1 week later
正常培养基
19
HAT培养基筛选
H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶
(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)
骨髓瘤细胞 (myeloma cells)的选择原则
①克隆效应高，能在体外连续生长，倍增期短于24小时； ②缺乏HGPRT酶和TK酶； ③本身不合成Ig，且不抑制杂交瘤细胞中的Ig合成基因。 ④与小鼠淋巴细胞融合率相当高；
脾细胞的选择
由于目前常用的骨髓瘤细胞普遍来自Bal b/c小鼠，因此应尽 量选择同源的Bal b/c健康小鼠（8-12周）作为免疫动物。
死亡
20
3、阳性杂交瘤细胞的筛选（抗体的检测）
• 检测时间：杂交瘤细胞布满孔底1／10时开 始检测特异性抗体，进行筛选。
• 检测方法：最常用酶联免疫吸附法(ELISA) 间接免疫荧光法(IFA) 放射免疫法(RIA) 双相扩散法
3）离心，弃上清，加15mL HAT培养基，混匀，转入96孔 板（预先有HAT培养基培养的饲养细胞），每孔100 ul。
4
• 抗体：机体免疫细胞被激活后，由分化成熟的 B淋巴细胞-浆细胞合成、分泌的免疫球蛋白。
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脾脏与B淋巴细胞(B lymphocytes)
淀）。
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（2）HAT培养基的筛选
融合后细胞混合液
HAT培养基
2 weeks later
HT培养基
1 week later
正常培养基
19
HAT培养基筛选
H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶
(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)
骨髓瘤细胞 (myeloma cells)的选择原则
①克隆效应高，能在体外连续生长，倍增期短于24小时； ②缺乏HGPRT酶和TK酶； ③本身不合成Ig，且不抑制杂交瘤细胞中的Ig合成基因。 ④与小鼠淋巴细胞融合率相当高；
脾细胞的选择
由于目前常用的骨髓瘤细胞普遍来自Bal b/c小鼠，因此应尽 量选择同源的Bal b/c健康小鼠（8-12周）作为免疫动物。
死亡
20
3、阳性杂交瘤细胞的筛选（抗体的检测）
• 检测时间：杂交瘤细胞布满孔底1／10时开 始检测特异性抗体，进行筛选。
• 检测方法：最常用酶联免疫吸附法(ELISA) 间接免疫荧光法(IFA) 放射免疫法(RIA) 双相扩散法
3）离心，弃上清，加15mL HAT培养基，混匀，转入96孔 板（预先有HAT培养基培养的饲养细胞），每孔100 ul。
高二生物选修三《单克隆抗体的制备》课件
单 点
击
击 此
处
添 添
加 副
加 标
题
标 题
植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较项目
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞膜的流动性 细胞的全能性
细胞膜的流动性
细胞融合的步骤
去除细胞壁后诱导 原生质体融合
使细胞分散后诱导 细胞融合
诱导方法 用途
物理（离心、振荡、 电刺激）
化学（聚乙二醇）
获得杂种植株
物理、化学方法 （同左） 灭活的病毒
主要用于制备 单克隆抗体
○
三
二一
．
○
．．
浆来 。结的抗概 抗
二 、
B
细 胞 （
源 ：
淋 巴 细 胞 ）
合 的 具
、 并 能
体 是 机
念 ：
体
有与体
单 克
免该受 疫抗抗
隆
功原原 能发刺
抗
的生激 球特后
体
蛋异产
白性生
传统血清抗体的制备
特异性差、纯度低； 产量低、反应不够灵敏
2.单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的 原因是 每__一__种__B_淋__巴__细__胞__只__能__分__泌__一__种__特__异__性__抗体
3.产生抗体的细胞是_效__应__B_细__胞__（__浆__细_ 胞） 产生单克隆抗体的细胞是杂__交__瘤__细__胞__
抗原 刺激 动物体 抗原不纯
浆细胞 抗体
抗体不纯
每个浆细胞（Ｂ淋巴细胞）只能分泌一种抗体，由一 个Ｂ淋巴细胞增殖产生的细胞群分泌的抗体化学成份是单 一的。
如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？
体外培养单个Ｂ淋巴细胞，提取分泌的抗体
击
击 此
处
添 添
加 副
加 标
题
标 题
植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较项目
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞膜的流动性 细胞的全能性
细胞膜的流动性
细胞融合的步骤
去除细胞壁后诱导 原生质体融合
使细胞分散后诱导 细胞融合
诱导方法 用途
物理（离心、振荡、 电刺激）
化学（聚乙二醇）
获得杂种植株
物理、化学方法 （同左） 灭活的病毒
主要用于制备 单克隆抗体
○
三
二一
．
○
．．
浆来 。结的抗概 抗
二 、
B
细 胞 （
源 ：
淋 巴 细 胞 ）
合 的 具
、 并 能
体 是 机
念 ：
体
有与体
单 克
免该受 疫抗抗
隆
功原原 能发刺
抗
的生激 球特后
体
蛋异产
白性生
传统血清抗体的制备
特异性差、纯度低； 产量低、反应不够灵敏
2.单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的 原因是 每__一__种__B_淋__巴__细__胞__只__能__分__泌__一__种__特__异__性__抗体
3.产生抗体的细胞是_效__应__B_细__胞__（__浆__细_ 胞） 产生单克隆抗体的细胞是杂__交__瘤__细__胞__
抗原 刺激 动物体 抗原不纯
浆细胞 抗体
抗体不纯
每个浆细胞（Ｂ淋巴细胞）只能分泌一种抗体，由一 个Ｂ淋巴细胞增殖产生的细胞群分泌的抗体化学成份是单 一的。
如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？
体外培养单个Ｂ淋巴细胞，提取分泌的抗体
单克隆抗体制备 ppt课件
实验研究的目的性 — 功能、形态、数量 实验设计的科学性 — 全面、动态、鲜明、对应、对照 实验方法的合理性 — 确切、先进 实验原理的内涵性 — 意义、要点 实验操作的规范性 — 准备、严格、准确、重复
单克隆抗体制备
1
免疫血清和单克隆抗体的制备
单克隆抗体制备
2
一、免疫血清的制备
1. 原理： 机体具有多种B细胞克隆，将适当的抗原物质注入人
单克隆抗体制备
4
4. 抗原的处理
1）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐 剂，直接免疫。菌体数1×1010个/ml 为宜。
2）可溶性蛋白质抗原（如人IgG）、病毒抗原、细菌 可溶性抗原组分等，可以直接与弗氏完全佐剂
（1：1 V/V）混合、乳化。 3）半抗原（多糖、多肽、激素、化学药品）需与载
2. 种类
1）卡介苗（BCG）、短小棒状杆菌（CP）、脂
多糖（LPS）、细胞因子；
2）氢氧化铝、明矾；
3）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）和双
链多聚腺苷酸：鸟苷酸（poly A：U）；
4）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物
（ISCOMs）、CPG单克寡隆抗核体制备苷酸。
6
3. 弗氏完全佐剂
1）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。 2）配方：羊毛脂：液体石蜡 为1：2，也可1：1。
体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（BSA）、钥 孔嘁血蓝素(KLH)、鸡血清蛋白（OA）；偶联剂 有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。KLH是最 常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联
剂。
单克隆抗体制备
5
佐剂
1. 概念
佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或
预先注入机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应 答的类型。
单克隆抗体制备
1
免疫血清和单克隆抗体的制备
单克隆抗体制备
2
一、免疫血清的制备
1. 原理： 机体具有多种B细胞克隆，将适当的抗原物质注入人
单克隆抗体制备
4
4. 抗原的处理
1）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐 剂，直接免疫。菌体数1×1010个/ml 为宜。
2）可溶性蛋白质抗原（如人IgG）、病毒抗原、细菌 可溶性抗原组分等，可以直接与弗氏完全佐剂
（1：1 V/V）混合、乳化。 3）半抗原（多糖、多肽、激素、化学药品）需与载
2. 种类
1）卡介苗（BCG）、短小棒状杆菌（CP）、脂
多糖（LPS）、细胞因子；
2）氢氧化铝、明矾；
3）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）和双
链多聚腺苷酸：鸟苷酸（poly A：U）；
4）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物
（ISCOMs）、CPG单克寡隆抗核体制备苷酸。
6
3. 弗氏完全佐剂
1）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。 2）配方：羊毛脂：液体石蜡 为1：2，也可1：1。
体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（BSA）、钥 孔嘁血蓝素(KLH)、鸡血清蛋白（OA）；偶联剂 有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。KLH是最 常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联
剂。
单克隆抗体制备
5
佐剂
1. 概念
佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或
预先注入机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应 答的类型。
人教版高中生物选修三《单克隆抗体的制备及应用》教学课件
阳性细胞
二、单克隆抗体的应用
（1）作为诊断试剂——最广泛应用
准确、高效、简易、快速
（如利用同位素标记的 单克隆抗体，可定位诊 断肿瘤、心血管畸形等）
二、单克隆抗体的应用
（2）运载药物
ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成。
ADC的抗体和药物各具有什么作用？ 抗体主要发挥靶向运输作用；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
一个极富创造力的方案： B淋巴细胞 骨髓瘤细胞
（能产生抗体）（能大量增殖）
融合细胞
（既能产生抗体，又能大量增殖）
米尔斯坦
科勒
一、单克隆抗体的制备
探究一
小组合作利用太空泥模拟细胞融合的过程（只考虑两个细胞融合）
随机融合后培养基中细胞的类 型有哪些？
一、单克隆抗体的制备
探究二
已知细胞分裂过程中，合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋 呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖，其本 身也不能在体外长期存活。 鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但 可以在体外无限增殖，如果它的D途径被阻断的话，它会因为不能合成 DNA而死亡。
二、单克隆抗体的应用
（3）直接用于治疗疾病
实例：利妥昔单抗(美罗华)是一种针对 CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，是第 一个被FDA批准用于临床治疗的单抗。进 入人体后能通过介导抗体依赖的细胞毒性 作用、补体依赖的细胞毒性作用和抗体与 CD20分子结合引起的直接效应，抑制细胞 生长，改变细胞周期以及凋亡等方式杀死 淋巴瘤细胞。
一、单克隆抗体的制备
1.传统抗体制备方法及缺陷 （1）方法： 向动物体内反复注射某种抗原
从动物血清中分离所需抗体 （2）缺点： 产量低、纯度低、特异性差
单克隆抗体技术讲解PPT课件
8
局限性 ： （1）固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范 围 （2）反应强度不如多克隆抗体 （3）制备技术复杂、费时费工、价格较高
9
三、单克隆抗体技术的应用
1.检验医学诊断
（1）病原微生物抗原抗体的检测：乙肝表面抗原试纸
（2）肿瘤抗原的检测
（3）免疫细胞及其亚群的检测 （4）激素测定：早孕检测试纸、女性排卵检测试纸 （5）细胞因子的测定 （6）其他：吗啡类毒品检测试纸等
抗体工程制药
单克隆抗体的制备
1
掌握：单克隆抗体的概念和特点、制备原理， 制备方法及基本过程 熟悉：单克隆抗体技术的应用 了解：单克隆抗体的发展
2
主要内容
1.单克隆抗体的发展 2.单克隆抗体的概念和特点 3.单克隆抗体技术的应用
4.单克隆抗体的制备过程
3
没有单克隆抗体前人类所遇见的问题
银屑病
手口足病
陷细胞可以在此培养基中生存。是常用的骨髓杂交瘤细胞选择性培
养对筛选方法的要求： 多——大量样品一次检测； 快——迅速取得检测结果； 准——检测结果可靠性高； 灵——检测方法灵敏度高。 常用筛选方法： ELISA、IFA等
15
6. 克隆化过程
方法：有限稀释法 克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔 饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞
2.蛋白质的提纯
3.肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术
10
四、单克隆抗体制备过程
致敏淋巴细胞的准备
骨髓瘤细胞的准备
细胞融合 选择性培养 抗体分泌细胞的筛选 克隆化过程
单克隆抗体的制取
11
1.致敏淋巴细胞的准备
动物选择：品系、年龄、性别、健康状态 抗原接种：方式—体内、体外 剂量—0.5-100g 次数—视抗原而定 间隔—视抗原而定 佐剂—视抗原而定 收集时间：末次接种后72 h
单克隆抗体的制备.ppt
单克隆抗体制备
总结
单克隆抗体是由单一B淋巴细胞克隆所产生 的、只作用于一个特定抗原表位的均一抗体。
动物免疫 细胞融合 HAT选择性培养
阳性杂交瘤细胞的筛选
克隆化培养
建系与冻存
单克隆抗体的大量制备
谢 谢！
Balb/c 6-8周龄
3天
免疫脾细胞
单克隆抗体制备
制备流程 细胞融合
免疫脾细胞
+
PEG
SP2/0
骨髓瘤细胞（HGPRT-/TK-）
几种细胞类型？ ？
单克隆抗体制备
制备流程 选择性培养：HAT培养基
HGPRT－/ TK－ 不能生长
死亡
HGPRT+, TK+ 能够长期生长
生长繁殖
单克隆抗体制备
制备流程
单克隆抗体制备
单克隆抗体
(monoclonal antibody, McAb)
由单一B淋巴细胞克隆所产生的、只作 用于一个特定抗原表位的均一抗体。
三个“一”
单克隆抗体制备
制备原理
致敏的B淋巴细胞 骨髓瘤细胞
杂交瘤
杂交瘤技术
单克隆抗体制备
制备流程
动物免疫
1 23
采用与骨髓瘤细胞系来源相同的品系动物。
单克隆抗体制备
制备流程 杂交瘤细胞的建系与冻存
1、连续两次克隆化阳性率达100%； 2、体外连续传代三个月以上仍能稳定分泌抗体。
单克隆抗体制备
制备流程 单克隆抗体的大量制备
体外培养法（产量10-100μg/ml）
单克隆抗体制备
制备流程
单克隆抗体的大量制备 动物体内诱生法 （产量3-10mg/ml）
临床免疫学检验技术
抗体制备过程PPT课件
背部皮下，每处注射0.2 ml, 共2～4点。待肿瘤到达一定大小后(一般10～20天
)那么可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可到达1-10mg／ml。但采血量有
限。
+
② 腹水的制备 常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊于
BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可
+ 1. 有限稀释法的程序
+
① 制备饲养细胞悬液(同融合前准备)
+
② 阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml
+
③ 取130个细胞放入含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl
／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下细胞悬液补加含饲养细胞的完全培
养液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下
备的，与其它抗原无交叉反响性。与其它常规免疫 血清相比，单抗的特异性高、效价高、质地均一， 便于精制浓缩，应用单抗可以提高检测方法的敏感 性和特异性。同时，他又可作为提纯抗原、制备疫 苗、生产生物制剂和用于根底研究的重要手段。
+ 3 .生产简单，易于标准化 + 一旦选育成功一株高效价的杂交瘤细胞株，经鉴定
料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。
+
(4) 弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
+
(5) 轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。
+
(6) 在室温下融合可先以预热40℃:
+
① 30秒内参加预热的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，边加
单克隆抗体制备(共44张PPT)
单克隆抗体制备流程图
亲本细胞的选择与制备
骨髓瘤细胞 (NS-1)
骨髓瘤细胞需定期用
细胞株稳定，易传代培养；
细胞株本身不产生Ig
是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖 转换酶 缺陷株
(hypoxanthine-guanine phos phoribosyl transferase ,HGPRT)
最常用的骨髓瘤细胞是NS-1 和SP2/0细胞株
PEG可导致细胞膜上 脂类物质的物理结构 重排，使细胞膜容易 打开而有助于细胞融 合。
常见的几种融合形式
细胞DNA合成途经
HAT选择培养基
三种关键成分：
次黄嘌呤（hypoxanthine,H）
氨基蝶呤（aminopterin,A）
胸腺嘧啶（thymidine ，T）
◆是根据细胞内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的 生物合成途径设计的用于筛选杂交瘤细胞
因此在传统抗血清中，都含有许多种不同的抗体，分别针对这些不同的eptope。
每 mL 含有100 个 但除非抗原来源困难或有其它目的，我们仍采用传统方法，因免疫反应的启动机制非常复杂，生物整体的免疫反应是最可靠的。
单克隆抗体的制备流程和应用
细胞，若只要取一个 试采血 确定有抗体产生后，即可取出 脾脏以收集脾脏细胞(大多为B 细胞) 与骨髓瘤细胞进行 细胞融合。
2)体外增量培养法： 把杂交瘤细胞在大型培养槽 中培养，收集培养液上清即得抗体，但每 mL 只得 约数 mg，浓度较腹水稀约一千倍。最近有一种细 胞培养瓶，可产生如腹水般浓度的上清，但价格极 为昂贵 (IBS Integra Bioscience: Integra Celline)。
单克隆抗体的性质鉴定
种抗体；因此在传统抗血清中， 都含有许多种不同的抗体，分
单克隆抗体制备课件
细胞培养：选择合适的细胞 系进行培养
克隆化：将杂交瘤细胞进行 克隆化培养
抗体纯化：通过亲和层析法 纯化抗体
抗体鉴定：通过ELISA法鉴 定抗体的特异性和亲和力
PART FOUR
单克隆抗体在诊断试剂中的应用 单克隆抗体在免疫诊断中的应用 单克隆抗体在肿瘤诊断中的应用 单克隆抗体在传染病诊断中的应用
PPT,a click to unlimited possibilities
汇报人：PPT
CONTENTS
PART ONE
PART TWO
单克隆抗体：由 单一B细胞克隆产 生的抗体
特性：特异性强， 只识别一种抗原
制备方法：杂交 瘤技术、基因工 程等
应用：疾病诊断、 治疗、科学研究 等
制备过程：通过细胞融合技术， 将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融 合，形成杂交瘤细胞
产生来源：单克隆抗体是由 B淋巴细胞产生的
筛选：通过筛选，得到能够产 生特异性抗体的杂交瘤细胞
培养：将杂交瘤细胞进行培养， 使其大量增殖，产生大量的单 克隆抗体
PART THREE
确定抗原：选择合 适的抗原，如蛋白 质、多肽等
纯化抗原：通过离 心、层析等方法纯 化抗原
抗原处理：对纯化 后的抗原进行化学 修饰，如偶联、标 记等
PART FIVE
特异性强：能够识别并结合特异性 抗原
稳定性好：不易受环境因素影响
添加标题
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灵敏度高：能够检测低浓度的抗原
应用广泛：可用于疾病诊断、治疗 和预防
制备过程复杂，需要较高 的技术水平
成本较高，需要大量的资 金投入
制备周期较长，需要较长 的时间才能得到结果
存在一定的风险，如免疫 反应、过敏反应等
克隆化：将杂交瘤细胞进行 克隆化培养
抗体纯化：通过亲和层析法 纯化抗体
抗体鉴定：通过ELISA法鉴 定抗体的特异性和亲和力
PART FOUR
单克隆抗体在诊断试剂中的应用 单克隆抗体在免疫诊断中的应用 单克隆抗体在肿瘤诊断中的应用 单克隆抗体在传染病诊断中的应用
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汇报人：PPT
CONTENTS
PART ONE
PART TWO
单克隆抗体：由 单一B细胞克隆产 生的抗体
特性：特异性强， 只识别一种抗原
制备方法：杂交 瘤技术、基因工 程等
应用：疾病诊断、 治疗、科学研究 等
制备过程：通过细胞融合技术， 将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融 合，形成杂交瘤细胞
产生来源：单克隆抗体是由 B淋巴细胞产生的
筛选：通过筛选，得到能够产 生特异性抗体的杂交瘤细胞
培养：将杂交瘤细胞进行培养， 使其大量增殖，产生大量的单 克隆抗体
PART THREE
确定抗原：选择合 适的抗原，如蛋白 质、多肽等
纯化抗原：通过离 心、层析等方法纯 化抗原
抗原处理：对纯化 后的抗原进行化学 修饰，如偶联、标 记等
PART FIVE
特异性强：能够识别并结合特异性 抗原
稳定性好：不易受环境因素影响
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灵敏度高：能够检测低浓度的抗原
应用广泛：可用于疾病诊断、治疗 和预防
制备过程复杂，需要较高 的技术水平
成本较高，需要大量的资 金投入
制备周期较长，需要较长 的时间才能得到结果
存在一定的风险，如免疫 反应、过敏反应等
《单克隆抗体应用》课件
单克隆抗体的特性
总结词
单克隆抗体具有高度特异性、一致性和稳定性。
详细描述
由于单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的，因此它具有高度特异性，能够与特 定的抗原结合。此外，由于单克隆抗体的生产过程是高度控制的，因此其质量和 性能具有一致性和稳定性。
02
单克隆抗体的应用领域
生物医学研究
抗体标记技术
利用单克隆抗体与特定抗原的结 合特性，对生物样本中的抗原进 行标记，用于检测、定位和追踪 抗原的表达和分布。
利用单克隆抗体标记的免疫细胞对肿瘤进行攻击，提高肿瘤治疗的疗效和患者的生存率。
03
单克隆抗体的研究进展
新药研发
肿瘤免疫治疗
利用单克隆抗体作为肿瘤免疫治 疗的靶点，通过激活免疫系统来 攻击肿瘤细胞。
自身免疫性疾病治
疗
针对自身免疫性疾病，如类风湿 性关节炎、红斑狼疮等，单克隆 抗体可以抑制免疫反应，缓解症 状。
《单克隆抗体应用》ppt课件
CONTENTS
• 单克隆抗体的基础知识 • 单克隆抗体的应用领域 • 单克隆抗体的研究进展 • 单克隆抗体的挑战与前景 • 单克隆抗体的未来展望
01
单克隆抗体的基础知识
单克隆抗体的定义
总结词
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的具有高度特异性的免疫球蛋白。
详细描述
单克隆抗体是由杂交瘤细胞产生的，这种细胞是由免疫的B细胞和骨髓瘤细胞融 合而成。这种杂交瘤细胞能够大量繁殖，并且只产生一种类型的抗体。
免疫疗法
单克隆抗体可以与免疫疗法结合，通过调节免疫 反应来增强抗肿瘤效果。
基因治疗
通过将基因导入单克隆抗体，可以实现更精确的 靶向治ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ，提高治疗效果并降低副作用。
单克隆抗体的制备和应用PPT课件
McAb的纯化
➢盐析沉淀 ➢亲和层析 ➢离子交换层析
McAb的鉴定
➢Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法 ➢特异性测定：抗原类似物的交叉反应 ➢效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示 ➢表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞 争抑 制法，相加指数法及微机集群分析 ➢亲和性测定：测定亲和常数K ➢杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色 体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条 ➢McAb靶抗原分子量：常用western blot
流程
培养液
➢RPM1640培养液 ➢DMEMPEG是最常用的细胞融合 剂 ➢ 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使 细胞膜易打开而有助于细胞融合 ➢ 作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子 量的PEG，其纯度与毒性有所不同
HGPRT酶与TK酶
细胞冷冻的意义
➢防止污染 ➢避免染色体丢失 ➢防止非分泌细胞的过度生长 ➢防止细胞密度过高而死亡
第二节 单克隆抗体制备
培养骨髓瘤细胞
➢选择对数生长期的细胞进行传代培养 ➢细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐 ➢避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞 ➢注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-80℃ 或液氮及干冰中
➢动物接种 每次用BALB/c或F1代小鼠，5-10 ╳105/只
免疫小鼠
➢ 细胞性抗原：1-2 × 107/只，不加佐剂，2-3周重复一次
➢ 可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3-6周 ➢ 100-200微克抗原，融合前3天，加强免疫
腹腔注射法
高滴度腹水
➢前5天进行,预先腹腔注射pristane ➢1~5×106细胞 ➢1~3w形成腹水
。
单克隆抗体和基因工程抗体的制备 ppt课件
课件
11
(二) 杂交瘤细胞的选择性培养
杂交瘤细胞的筛选： 两种亲本细胞经PEG或其他方法处理后， 可融合 成不同类型的融合体， 正常的脾细胞在培养基中存活 仅5~7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易 死去。而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。 要从中筛选出真正的杂交瘤细胞， 必须进行选择 性培养。目前，常用HAT培养基。 HAT培养基：
课件 13
细胞DNA生物合成途径示意图
糖+氨基酸
正常途径
氨基喋呤(A)
次黄嘌呤(H) HMP
HGPRT
核苷酸Βιβλιοθήκη 核苷酸前体DNA应急途径
TK
胸腺嘧啶(T) 课件
TMP
14
用来融合的瘤细胞是经毒性培养基选择 出来的缺乏 HGPRT 的细胞株，所以在 HAT选择培养基中不能生长。只有杂交 瘤细胞具有亲代双方的遗传特性，即既 有骨髓瘤细胞在体外无限繁殖的生命力 又有 B细胞经辅助途径合成 DNA 的能力， 故可在HAT培养基中长期存活并繁殖。
课件
7
2．小鼠骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞为B细胞系恶性肿瘤，能在体外 长期增殖并容易与B细胞融合。
课件
8
用于杂交瘤技术的骨髓瘤细胞 应符合的条件
①本身不分泌免疫球蛋白； ②为次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转化酶 （hypoxanthine-guanine- phospheribosyl-transfer ase ， HGPRT ） 或 胸 腺 嘧 啶 激 酶 （ thymidinekinase，TK）缺陷的细胞株； ③瘤细胞能与B细胞杂交形成稳定的杂交瘤细胞； ④与B细胞融合率高。
课件
3
第一节 杂交瘤技术的基本原理
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单克隆抗体的制备步骤 四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选
ELISA方法筛选阳性孔
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单克隆抗体的制备步骤
四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选
阳性孔 间接ELISA方法筛选阳性孔 用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。 抗原抗体杂交法检测——呈阳性反应
15
单克隆抗体的制备步骤 六：亚克隆 是为了获得稳定的阳性菌株 对检测有阳性且敏感性好的细胞要尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细
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单克隆抗体的制备步骤
三.细胞融合 步骤
培养骨髓瘤细胞
饲养细胞的制备
• 1：选择对数生长期 的细胞进行传代培 养。
• 2：胞形态：浑圆、 透亮、均一、排列 整齐
• 3：避免细胞返祖： 定期用8-AG处理细 胞
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● ·1：饲养细胞为小鼠的 腹腔巨噬细胞。
• 2：固定小鼠，切开皮 肤，夹起腹膜。
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单克隆抗体的制备步骤
一：免疫原的制备 ：
1：完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于 5000Da生物物质
2：半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000 Da 物质 3：半抗原需与BSA、OVA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产
生可应用的高效价的抗体
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Page 8
单克隆抗体的制备步骤 抗原接种
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单克隆抗体的制备步骤
三：细胞融合
细胞融合的基本原理是免疫原刺激小鼠产生特异性的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞,在PEG 融合剂或是电刺激或是激光刺激来促使细胞融合形成杂交瘤细胞。蹄选得到的杂交瘤 细胞继承了 B淋巴细胞产生特异性抗体以及骨髓瘤细胞无限传代的特性,并以此进行 大规模的细胞培养,生产出大量的特异性良好的单克隆抗体,为快速诊断试剂的研制 奠定了坚实的基础。
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单克隆抗体的制备步骤
七：杂交瘤细胞的冻存与复苏
细胞冷冻的意义
1，：来在不建及防立染非对止杂色分所污体泌交有染丢细瘤的失胞细、杂、的胞交防过避的止度瘤免过细程胞中作，进有一时步一的次工融作合，产需生要很把多其“中阳一性部”分孔细 胞冻存生起长来、；防另止一细方胞面密，为了防止实验室可能发生的意外事故。
• 3：往小鼠腹腔注射适 量不完全培养液:，吹 打几次。
• 4：抽出腹腔培养液， 加入一定量的不完全 培养液，加入血清， 使血清浓度为20%。
• 5：分装至96孔板，
脾细胞的制备
• 1：取已免疫小鼠， 眼球采血，分离血 清作对照血清。
• 2：拉颈处死，泡 于75%酒精中。
• 3：开腹取脾 • 4：在不完全DM液
中碾磨脾脏至粘稠 • 5：收集脾细胞，
离心。
单克隆抗体的制备步骤 三.细胞融合
1： 将脾细胞和骨髓瘤细胞5:1混合，加DM液，混匀 2： 离心，弃上清，磨成糊状 3：将离心管置于37°温水，摇动；边滴加PEG1450 4：加入DM液 5：离心，弃上清 6：HAT 重悬后加入96孔板，放入CO2培养箱 7：五天后，15%血清的HAT补液 8：八天后，彻底换15%血清DM液
单克隆抗体的制备步骤
二.动物免疫
免疫动物的选取：6-8周龄的雌性，纯系的Bal B/C。 免疫原：细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次
可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周 100~200微克抗原，融合前3天，加强免佐剂的选择。
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体外培养法： a、悬浮培养法 b、微载体培养法
Microcarrier c、中空纤维细胞培养系统 d、微囊化细胞培养系统
胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗 体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的会使产单抗的细胞丢失
16
单克隆抗体的制备步骤
六：亚克隆
筛选阳性细胞孔 HAT重悬阳性孔内的细胞 取10ul做倍比稀释 目标孔：80-100个细胞 将目标孔细胞全部移至适量的HAT溶液中，铺板 每次亚克隆十天后，用ELISA法做抗体检测，确定阳性孔 按上述方法进行第二，第三次亚克隆 第三次亚克隆结束后，将确定为阳性孔的细胞进行扩大培养
2:配制方案度：过D高M而EM死亡:血清：DMSO=7：2：1 “慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮 保存数年至数十年.
“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复 苏.
Page 18
单克隆抗体的制备步骤 八：如何得到大量的单克隆抗体？
动物体内诱生法：使用的 动物当然首选BALB/c小 鼠 ,将杂交瘤细胞接种于 小鼠腹腔内，在小鼠腹腔 内生长杂交瘤，并产生腹 水，因而可得到大量的腹 水单抗且抗体浓度很高。
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所
需
试
剂
：
培养液：RPM1640培养液，DMEM培养液，HAT培养液，HT培养液
细胞融合剂：PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而 有助于细胞融合
作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度 与毒性有所不同
单克隆抗体的制备
Monocolonal antibody
丁乔棋 2015年8月9号
1
什么是单克隆抗体？
1、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）： 由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细
胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体 称为单 克隆抗体。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量 供应。
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单克隆抗体制备原理
Page 3
--- -
单克隆抗体杂交瘤技术基本流程
Page 4
在培养基中加入氨基嘌呤，收集增殖细胞！ 3种杂交细胞：①B-B融合细胞、②杂交瘤细胞
③瘤-瘤融合细胞 未融合的细胞：④单个的B细胞、⑤单个的骨髓瘤细胞
这五种细胞中， ① ④没有分裂能力，逐渐衰老死亡； ③ ⑤的DNA复制只有D途径， 加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，也逐渐衰老死亡， 但②的DNA复制有D、S两条途径，虽然D途径被氨基嘌呤阻断，但 是还Pag可e 5以通过 S 途径进行DNA的复制，使细胞有分裂能力。
单克隆抗体的制备步骤 四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选
ELISA方法筛选阳性孔
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单克隆抗体的制备步骤
四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选
阳性孔 间接ELISA方法筛选阳性孔 用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。 抗原抗体杂交法检测——呈阳性反应
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单克隆抗体的制备步骤 六：亚克隆 是为了获得稳定的阳性菌株 对检测有阳性且敏感性好的细胞要尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细
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单克隆抗体的制备步骤
三.细胞融合 步骤
培养骨髓瘤细胞
饲养细胞的制备
• 1：选择对数生长期 的细胞进行传代培 养。
• 2：胞形态：浑圆、 透亮、均一、排列 整齐
• 3：避免细胞返祖： 定期用8-AG处理细 胞
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● ·1：饲养细胞为小鼠的 腹腔巨噬细胞。
• 2：固定小鼠，切开皮 肤，夹起腹膜。
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单克隆抗体的制备步骤
一：免疫原的制备 ：
1：完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于 5000Da生物物质
2：半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000 Da 物质 3：半抗原需与BSA、OVA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产
生可应用的高效价的抗体
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单克隆抗体的制备步骤 抗原接种
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单克隆抗体的制备步骤
三：细胞融合
细胞融合的基本原理是免疫原刺激小鼠产生特异性的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞,在PEG 融合剂或是电刺激或是激光刺激来促使细胞融合形成杂交瘤细胞。蹄选得到的杂交瘤 细胞继承了 B淋巴细胞产生特异性抗体以及骨髓瘤细胞无限传代的特性,并以此进行 大规模的细胞培养,生产出大量的特异性良好的单克隆抗体,为快速诊断试剂的研制 奠定了坚实的基础。
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单克隆抗体的制备步骤
七：杂交瘤细胞的冻存与复苏
细胞冷冻的意义
1，：来在不建及防立染非对止杂色分所污体泌交有染丢细瘤的失胞细、杂、的胞交防过避的止度瘤免过细程胞中作，进有一时步一的次工融作合，产需生要很把多其“中阳一性部”分孔细 胞冻存生起长来、；防另止一细方胞面密，为了防止实验室可能发生的意外事故。
• 3：往小鼠腹腔注射适 量不完全培养液:，吹 打几次。
• 4：抽出腹腔培养液， 加入一定量的不完全 培养液，加入血清， 使血清浓度为20%。
• 5：分装至96孔板，
脾细胞的制备
• 1：取已免疫小鼠， 眼球采血，分离血 清作对照血清。
• 2：拉颈处死，泡 于75%酒精中。
• 3：开腹取脾 • 4：在不完全DM液
中碾磨脾脏至粘稠 • 5：收集脾细胞，
离心。
单克隆抗体的制备步骤 三.细胞融合
1： 将脾细胞和骨髓瘤细胞5:1混合，加DM液，混匀 2： 离心，弃上清，磨成糊状 3：将离心管置于37°温水，摇动；边滴加PEG1450 4：加入DM液 5：离心，弃上清 6：HAT 重悬后加入96孔板，放入CO2培养箱 7：五天后，15%血清的HAT补液 8：八天后，彻底换15%血清DM液
单克隆抗体的制备步骤
二.动物免疫
免疫动物的选取：6-8周龄的雌性，纯系的Bal B/C。 免疫原：细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次
可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周 100~200微克抗原，融合前3天，加强免佐剂的选择。
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体外培养法： a、悬浮培养法 b、微载体培养法
Microcarrier c、中空纤维细胞培养系统 d、微囊化细胞培养系统
胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗 体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的会使产单抗的细胞丢失
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单克隆抗体的制备步骤
六：亚克隆
筛选阳性细胞孔 HAT重悬阳性孔内的细胞 取10ul做倍比稀释 目标孔：80-100个细胞 将目标孔细胞全部移至适量的HAT溶液中，铺板 每次亚克隆十天后，用ELISA法做抗体检测，确定阳性孔 按上述方法进行第二，第三次亚克隆 第三次亚克隆结束后，将确定为阳性孔的细胞进行扩大培养
2:配制方案度：过D高M而EM死亡:血清：DMSO=7：2：1 “慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮 保存数年至数十年.
“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复 苏.
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单克隆抗体的制备步骤 八：如何得到大量的单克隆抗体？
动物体内诱生法：使用的 动物当然首选BALB/c小 鼠 ,将杂交瘤细胞接种于 小鼠腹腔内，在小鼠腹腔 内生长杂交瘤，并产生腹 水，因而可得到大量的腹 水单抗且抗体浓度很高。
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所
需
试
剂
：
培养液：RPM1640培养液，DMEM培养液，HAT培养液，HT培养液
细胞融合剂：PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而 有助于细胞融合
作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度 与毒性有所不同
单克隆抗体的制备
Monocolonal antibody
丁乔棋 2015年8月9号
1
什么是单克隆抗体？
1、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）： 由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细
胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体 称为单 克隆抗体。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量 供应。
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单克隆抗体制备原理
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单克隆抗体杂交瘤技术基本流程
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在培养基中加入氨基嘌呤，收集增殖细胞！ 3种杂交细胞：①B-B融合细胞、②杂交瘤细胞
③瘤-瘤融合细胞 未融合的细胞：④单个的B细胞、⑤单个的骨髓瘤细胞
这五种细胞中， ① ④没有分裂能力，逐渐衰老死亡； ③ ⑤的DNA复制只有D途径， 加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，也逐渐衰老死亡， 但②的DNA复制有D、S两条途径，虽然D途径被氨基嘌呤阻断，但 是还Pag可e 5以通过 S 途径进行DNA的复制，使细胞有分裂能力。