单克隆抗体的制备ppt课件
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
单克隆抗体的制备
Monocolonal antibody
丁乔棋 2015年8月9号
1
什么是单克隆抗体？
1、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）： 由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细
胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体 称为单 克隆抗体。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量 供应。
Page 8
单克隆抗体的制备步骤 抗原接种
Page 9
单克隆抗体的制备步骤
三：细胞融合
细胞融合的基本原理是免疫原刺激小鼠产生特异性的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞,在PEG 融合剂或是电刺激或是激光刺激来促使细胞融合形成杂交瘤细胞。蹄选得到的杂交瘤 细胞继承了 B淋巴细胞产生特异性抗体以及骨髓瘤细胞无限传代的特性,并以此进行 大规模的细胞培养,生产出大量的特异性良好的单克隆抗体,为快速诊断试剂的研制 奠定了坚实的基础。
胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗 体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的会使产单抗的细胞丢失
16
单克隆抗体的制备步骤
六：亚克隆
筛选阳性细胞孔 HAT重悬阳性孔内的细胞 取10ul做倍比稀释 目标孔：80-100个细胞 将目标孔细胞全部移至适量的HAT溶液中，铺板 每次亚克隆十天后，用ELISA法做抗体检测，确定阳性孔 按上述方法进行第二，第三次亚克隆 第三次亚克隆结束后，将确定为阳性孔的细胞进行扩大培养
Page 10
所
需
试
剂
：
培养液：RPM1640培养液，DMEM培养液，HAT培养液，HT培养液
细胞融合剂：PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱Biblioteka Baidu细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而 有助于细胞融合
作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度 与毒性有所不同
• 3：往小鼠腹腔注射适 量不完全培养液:，吹 打几次。
• 4：抽出腹腔培养液， 加入一定量的不完全 培养液，加入血清， 使血清浓度为20%。
• 5：分装至96孔板，
脾细胞的制备
• 1：取已免疫小鼠， 眼球采血，分离血 清作对照血清。
• 2：拉颈处死，泡 于75%酒精中。
• 3：开腹取脾 • 4：在不完全DM液
Page 13
单克隆抗体的制备步骤 四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选
ELISA方法筛选阳性孔
Page 14
单克隆抗体的制备步骤
四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选
阳性孔 间接ELISA方法筛选阳性孔 用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。 抗原抗体杂交法检测——呈阳性反应
15
单克隆抗体的制备步骤 六：亚克隆 是为了获得稳定的阳性菌株 对检测有阳性且敏感性好的细胞要尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细
2:配制方案度：过D高M而EM死亡:血清：DMSO=7：2：1 “慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮 保存数年至数十年.
“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复 苏.
Page 18
单克隆抗体的制备步骤 八：如何得到大量的单克隆抗体？
动物体内诱生法：使用的 动物当然首选BALB/c小 鼠 ,将杂交瘤细胞接种于 小鼠腹腔内，在小鼠腹腔 内生长杂交瘤，并产生腹 水，因而可得到大量的腹 水单抗且抗体浓度很高。
Page 11
单克隆抗体的制备步骤
三.细胞融合 步骤
培养骨髓瘤细胞
饲养细胞的制备
• 1：选择对数生长期 的细胞进行传代培 养。
• 2：胞形态：浑圆、 透亮、均一、排列 整齐
• 3：避免细胞返祖： 定期用8-AG处理细 胞
Page 12
● ·1：饲养细胞为小鼠的 腹腔巨噬细胞。
• 2：固定小鼠，切开皮 肤，夹起腹膜。
单克隆抗体的制备步骤
二.动物免疫
免疫动物的选取：6-8周龄的雌性，纯系的Bal B/C。 免疫原：细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次
可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周 100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫。
免疫程序： 免疫剂量、免疫途径、免疫次数、 间隔时间、佐剂的选择。
Page 17
单克隆抗体的制备步骤
七：杂交瘤细胞的冻存与复苏
细胞冷冻的意义
1，：来在不建及防立染非对止杂色分所污体泌交有染丢细瘤的失胞细、杂、的胞交防过避的止度瘤免过细程胞中作，进有一时步一的次工融作合，产需生要很把多其“中阳一性部”分孔细 胞冻存生起长来、；防另止一细方胞面密，为了防止实验室可能发生的意外事故。
Page 2
单克隆抗体制备原理
Page 3
--- -
单克隆抗体杂交瘤技术基本流程
Page 4
在培养基中加入氨基嘌呤，收集增殖细胞！ 3种杂交细胞：①B-B融合细胞、②杂交瘤细胞
③瘤-瘤融合细胞 未融合的细胞：④单个的B细胞、⑤单个的骨髓瘤细胞
这五种细胞中， ① ④没有分裂能力，逐渐衰老死亡； ③ ⑤的DNA复制只有D途径， 加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，也逐渐衰老死亡， 但②的DNA复制有D、S两条途径，虽然D途径被氨基嘌呤阻断，但 是还Pag可e 5以通过 S 途径进行DNA的复制，使细胞有分裂能力。
中碾磨脾脏至粘稠 • 5：收集脾细胞，
离心。
单克隆抗体的制备步骤 三.细胞融合
1： 将脾细胞和骨髓瘤细胞5:1混合，加DM液，混匀 2： 离心，弃上清，磨成糊状 3：将离心管置于37°温水，摇动；边滴加PEG1450 4：加入DM液 5：离心，弃上清 6：HAT 重悬后加入96孔板，放入CO2培养箱 7：五天后，15%血清的HAT补液 8：八天后，彻底换15%血清DM液
Page 19
体外培养法： a、悬浮培养法 b、微载体培养法
Microcarrier c、中空纤维细胞培养系统 d、微囊化细胞培养系统
Page 6
单克隆抗体的制备步骤
一：免疫原的制备 ：
1：完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于 5000Da生物物质
2：半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000 Da 物质 3：半抗原需与BSA、OVA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产
生可应用的高效价的抗体
Page 7
Monocolonal antibody
丁乔棋 2015年8月9号
1
什么是单克隆抗体？
1、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）： 由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细
胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体 称为单 克隆抗体。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量 供应。
Page 8
单克隆抗体的制备步骤 抗原接种
Page 9
单克隆抗体的制备步骤
三：细胞融合
细胞融合的基本原理是免疫原刺激小鼠产生特异性的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞,在PEG 融合剂或是电刺激或是激光刺激来促使细胞融合形成杂交瘤细胞。蹄选得到的杂交瘤 细胞继承了 B淋巴细胞产生特异性抗体以及骨髓瘤细胞无限传代的特性,并以此进行 大规模的细胞培养,生产出大量的特异性良好的单克隆抗体,为快速诊断试剂的研制 奠定了坚实的基础。
胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗 体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的会使产单抗的细胞丢失
16
单克隆抗体的制备步骤
六：亚克隆
筛选阳性细胞孔 HAT重悬阳性孔内的细胞 取10ul做倍比稀释 目标孔：80-100个细胞 将目标孔细胞全部移至适量的HAT溶液中，铺板 每次亚克隆十天后，用ELISA法做抗体检测，确定阳性孔 按上述方法进行第二，第三次亚克隆 第三次亚克隆结束后，将确定为阳性孔的细胞进行扩大培养
Page 10
所
需
试
剂
：
培养液：RPM1640培养液，DMEM培养液，HAT培养液，HT培养液
细胞融合剂：PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱Biblioteka Baidu细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而 有助于细胞融合
作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度 与毒性有所不同
• 3：往小鼠腹腔注射适 量不完全培养液:，吹 打几次。
• 4：抽出腹腔培养液， 加入一定量的不完全 培养液，加入血清， 使血清浓度为20%。
• 5：分装至96孔板，
脾细胞的制备
• 1：取已免疫小鼠， 眼球采血，分离血 清作对照血清。
• 2：拉颈处死，泡 于75%酒精中。
• 3：开腹取脾 • 4：在不完全DM液
Page 13
单克隆抗体的制备步骤 四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选
ELISA方法筛选阳性孔
Page 14
单克隆抗体的制备步骤
四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选
阳性孔 间接ELISA方法筛选阳性孔 用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。 抗原抗体杂交法检测——呈阳性反应
15
单克隆抗体的制备步骤 六：亚克隆 是为了获得稳定的阳性菌株 对检测有阳性且敏感性好的细胞要尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细
2:配制方案度：过D高M而EM死亡:血清：DMSO=7：2：1 “慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮 保存数年至数十年.
“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复 苏.
Page 18
单克隆抗体的制备步骤 八：如何得到大量的单克隆抗体？
动物体内诱生法：使用的 动物当然首选BALB/c小 鼠 ,将杂交瘤细胞接种于 小鼠腹腔内，在小鼠腹腔 内生长杂交瘤，并产生腹 水，因而可得到大量的腹 水单抗且抗体浓度很高。
Page 11
单克隆抗体的制备步骤
三.细胞融合 步骤
培养骨髓瘤细胞
饲养细胞的制备
• 1：选择对数生长期 的细胞进行传代培 养。
• 2：胞形态：浑圆、 透亮、均一、排列 整齐
• 3：避免细胞返祖： 定期用8-AG处理细 胞
Page 12
● ·1：饲养细胞为小鼠的 腹腔巨噬细胞。
• 2：固定小鼠，切开皮 肤，夹起腹膜。
单克隆抗体的制备步骤
二.动物免疫
免疫动物的选取：6-8周龄的雌性，纯系的Bal B/C。 免疫原：细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次
可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周 100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫。
免疫程序： 免疫剂量、免疫途径、免疫次数、 间隔时间、佐剂的选择。
Page 17
单克隆抗体的制备步骤
七：杂交瘤细胞的冻存与复苏
细胞冷冻的意义
1，：来在不建及防立染非对止杂色分所污体泌交有染丢细瘤的失胞细、杂、的胞交防过避的止度瘤免过细程胞中作，进有一时步一的次工融作合，产需生要很把多其“中阳一性部”分孔细 胞冻存生起长来、；防另止一细方胞面密，为了防止实验室可能发生的意外事故。
Page 2
单克隆抗体制备原理
Page 3
--- -
单克隆抗体杂交瘤技术基本流程
Page 4
在培养基中加入氨基嘌呤，收集增殖细胞！ 3种杂交细胞：①B-B融合细胞、②杂交瘤细胞
③瘤-瘤融合细胞 未融合的细胞：④单个的B细胞、⑤单个的骨髓瘤细胞
这五种细胞中， ① ④没有分裂能力，逐渐衰老死亡； ③ ⑤的DNA复制只有D途径， 加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，也逐渐衰老死亡， 但②的DNA复制有D、S两条途径，虽然D途径被氨基嘌呤阻断，但 是还Pag可e 5以通过 S 途径进行DNA的复制，使细胞有分裂能力。
中碾磨脾脏至粘稠 • 5：收集脾细胞，
离心。
单克隆抗体的制备步骤 三.细胞融合
1： 将脾细胞和骨髓瘤细胞5:1混合，加DM液，混匀 2： 离心，弃上清，磨成糊状 3：将离心管置于37°温水，摇动；边滴加PEG1450 4：加入DM液 5：离心，弃上清 6：HAT 重悬后加入96孔板，放入CO2培养箱 7：五天后，15%血清的HAT补液 8：八天后，彻底换15%血清DM液
Page 19
体外培养法： a、悬浮培养法 b、微载体培养法
Microcarrier c、中空纤维细胞培养系统 d、微囊化细胞培养系统
Page 6
单克隆抗体的制备步骤
一：免疫原的制备 ：
1：完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于 5000Da生物物质
2：半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000 Da 物质 3：半抗原需与BSA、OVA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产
生可应用的高效价的抗体
Page 7