甘油管冷冻保藏方法收集-2

§菌种管由传统的玻璃菌种管改为0.5ml带盖塑料离心管。

方法：①将塑料离心管置耐高压塑料离心管盒内并用双层报纸包好，高压蒸汽15磅15min消毒，放烤箱80℃烤干。

②在净化工作台内将脱脂牛奶洗下的浓厚菌悬液用长毛细玻璃滴管加到塑料离心管的底部，每只0.2ml左右，切记不要将牛奶污染离心管口。

③将加好菌液的离心管盒置-20℃冰箱预冻，预冻好后把离心管盒放置到冷冻干燥机干燥箱内冻干。

④冻干后在净化工作台内压好离心管盖，不抽真空。

贴标签，用封口膜封离心管口。

放-20℃冰箱保存。

§该改良法优点有：⑴操作过程大大简化，菌种管口不需溶封，不抽真空。

⑵菌种管抗破损性极佳；⑶菌种管体积超小。

⑷成本低廉，易于商品化生产、推广。

笔者使用该改良法近七年，本省发放菌种上万只没有破损情况出现；数次发放嗜血杆菌、链球菌、奈瑟氏菌等苛养菌，生长情况良好。

近几年我们还向华东地区部分兄弟省分提供了室间质评菌种四万余只，效果满意。

实验——微生物菌种常规保藏方法录入时间:2011-4-13 9:30:37 来源：天津农学院精品课程菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。

菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。

1 目的1.1 了解菌种保藏的基本原理1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。

2 原理菌种保藏的方法很多。

其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。

使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。

依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。

一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。

3 材料3.1菌株待保藏的适龄菌株斜面3.2培养基肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。

3.3 试剂10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。

3.4 器具用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。

4 流程斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏5 步骤5.1斜面保藏5.1.1流程标记试管→接种→培养→保藏5.1.2步骤5.1.2.1贴标签取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。

在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。

在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。

5.1.2.2斜面接种将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。

5.1.2.3培养置37恒温箱中培养48小时。

5.1.2.4保藏斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。

这种方法一船可保藏三个月至半年。

5.2半固体穿刺保藏5.2.1流程标记试管→穿刺接种→培养→保藏5.2.2 步骤5.2.2.1贴标签取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。

5.2.2.2穿刺接种用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。

5.2.2.3培养置37恒温箱中培养48小时。

5.2.4保藏半固体直立柱长好以后，放入4℃的冰箱中保藏。

这种方法一般可保藏半年至一年。

5.3石蜡油封存5.3.1流程标记试管→接种→培养→加石蜡油→保藏5.3.2 步骤5.3.1标记同5.1.2.15.3.2接种同5.1.2.25.3.3培养同5.1.2.35.3.4加石蜡油无菌操作下将5毫升石蜡油到培养好的菌种上面，加入的量以超过斜面或直立柱1厘米高为宜。

5.3.5保藏：石蜡油封存以后，同样放入4℃冰箱中保存。

也可直接放在低温干燥处保藏。

这种方法保藏期一般为一至二年。

5.4砂土管保藏5.4.1 流程制沙土管→灭菌→制菌液→加样→干燥→保藏5.4.2 步骤5.4.2.1制作沙土管选取过40目筛的黄砂，酸洗，再水洗至中性，烘干备用；过120目筛子的黄土备用；按1份土加4份砂的比例均匀混合后，装入小试管，装量1厘米左右。

5.4.2.2灭菌加压蒸汽灭菌，直至检测无菌为止。

5.4.2.3制备菌液取3毫升无菌水至待保藏的菌种斜面中，用接种环轻轻刮下菌苔。

震荡制成菌悬液。

5.4.2.4加样用1毫升吸管吸取上述悬液0.1毫升至砂土管，再用接种环拌匀。

5.4.2.5干燥把装好菌液的砂土管放入干燥器或同时用真空泵连续抽气，使之干燥。

5.4.2.6保藏干燥后的砂土管可直接放入冰箱中保藏；也可以用石蜡封住棉花塞后放冰箱中保藏。

（二）冷冻干燥保藏法1目的1.1理解冷冻干燥保藏菌种的原理1.2掌握冷冻干燥保藏菌种的方法。

2原理冷冻干燥保藏菌种法可克服简单保藏方法的不足。

利用有利于菌种保藏的—切因素，使微生物始终处于低温、干燥、缺氧的条件下，因而它是迄今为止最有效的菌种保藏法之一。

3材料3.1菌株待保藏的各种菌种。

3.2试剂2% HCl；牛奶。

3.3器具安瓿管、标签、长滴管、脱脂棉、干冰、离心机、冷冻真空装置、高频电火花器。

4 流程备安瓿管→备脱脂乳→制菌悬液→分装→预冻→真空干燥→保藏→活化5步骤5.1准备安瓿管安瓿管先用2%HCl浸泡，再水洗多次，烘干。

将标签放入安培管内，管口塞上棉花，灭菌备用。

5.2制备脱脂乳用鲜奶经处理或使用脱脂奶粉配兑脱脂牛奶，灭菌，并做无菌试验后备用。

5.3制菌悬液将无菌牛奶直接加到待保藏的菌种斜面内，用接种环将菌种刮下，轻轻搅乱使其均匀地悬浮在牛奶内成悬浮液。

5.4分装用无菌长滴管将悬浮液分装入安瓿管底部，每支安培管的装量约为0.9毫升。

(一般装入量为安瓿管球部体积的1／3)5.5预冻将分装好的安瓿管在-25至-40之间的干冰酒精中进行预冻1小时；或在冰箱冷冻室进行预东。

5.6真空干燥预冻以后，将安瓿管放入真空器中，开动真空泵进行干燥。

5.7封管封管前将安瓿管装入歧管；真空度抽至0.01毫米汞拄后，再用火焰熔封，封好后，要用高频火花器检查各安瓿管的真空情况。

如果管内呈现灰蓝色光，证明保持着真空。

检查时高频电火花器应射向安瓿管的上半部。

5.8保藏做好的安瓿管应放置在低温避光处保藏。

5.9活化如果要从中取出菌种恢复培养，可先用75%酒精将管的外壁消毒，然后将安瓿管上部在火焰上烧热，再滴几滴无菌水，使管子破裂。

在用接种针直接挑取松散的干燥样品，在斜面接种。

6结果6.1简述真空冷冻干燥保藏菌种的原理。

6.2 记录大肠杆菌斜面作液体石蜡封藏和枯草杆菌作沙土管保藏的要点。

7思考7.1菌种保藏中，石蜡油的作用是什么？7.2经常使用的细菌菌株，使用那种保藏方法比较好？7.3沙土管法适合保藏那一类微生物？上一篇：实验——Ames法检测诱变剂和致癌剂下一篇：实验——菌种冷冻干燥保藏法甘油冷冻保藏法本方法适合于中、长期菌种保藏，保藏时间一般为2-4年左右。

（1）用火焰灭菌的接种环取斜面菌种在平皿上划线分离单菌落。

（2）平皿倒置于30℃或37℃恒温培养箱，培养24-48小时，至单菌落的大小为3mm左右。

（3）挑取一个单菌落，接种于一个装50mL（LB）的300mL三角瓶中30℃或37℃振荡培养10-15小时，至菌密度OD600为1.0-1.5。

（4）用火焰灭菌的接种环取少量种子液，涂片后，作革兰氏染色，在显微镜下观察菌体的形态，及是否有杂菌。

（5）按30%甘油：种子液为1：1（V/V）的量加入无菌甘油，混合后分装至事先灭菌的菌种保存管（1-2mL/管），-70℃或液氮保存。

专家解答甘油管冷冻保藏法1．试验方法介绍本法也是利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。

其方法是，将80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。

将培养好的斜面菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液(108～1010/ml)。

取1ml灭菌甘油放入与甘油充分混匀，使甘油浓度约为10%-30%，于-70℃下冻存。

-20℃保存时间较短。

或采用体积比为8：2的甘油－生理盐水，加入新鲜培养的菌体肉汤，混合均匀后至-20℃冰箱保存。

2．效果该法适用于一般细菌的保存，同时也适用于链球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种，适用范围广，操作简便，效果好，无变异现象发生。

甘油－生理盐水保存液保存菌种优于甘油原液，其原因可能是加入生理盐水适当降低了甘油的高渗作用，且有肉汤培养物适量增加保存液的营养成分，从而更好地保护了待保存的菌株。

求助各位大侠我想斜面-80度长期保存醋酸菌听说需要加防冻剂甘油我想请教一下：甘油怎么加？是加在培养基里还是等细菌长好以后再把甘油加在表面？具体加多少甘油？甘油的浓度是多少？另外甘油怎么灭菌？一，甘油要灭菌。

二，细菌在斜面甚至对数期是再加。

三，甘油浓度50％。

四，加入至斜面全部埋入甘油。

五，斜面不要太长。

六，加完甘油后斜面试管要立起来，甘油不要粘到塞上。

七，2－8摄氏度保存，定期传代。