乙肝病毒核酸检测实验操作流程
乙肝病毒核酸定量SOP
1、目的采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒核酸的定量检测，或用于乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。
2、原理本试剂盒采用乙型肝炎病毒(HBV)-核酸释放剂快速裂解、释放血清或血浆样本中的乙型肝炎病毒(HBV)DNA,利用针对乙型肝炎病毒(HBV)核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，配以PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现乙型肝炎病毒(HBV) DNA的定量检测。
整个试验过程无须单独提取样本中的DNA，只需将血清或血浆样本直接加入PCR反应管中与乙型肝炎病毒(HBV) -核酸释放剂充分混合即可作为PCR扩增的模板，避免了常规样本核酸提取过程中的环境污染。
PCR检测体系含有UNG酶+dUTP防污染措施，将可能的产物污染充分降解，避免假阳性结果。
PCR检测体系含有阳性内对照（乙型肝炎病毒（HBV）内标），通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。
PCR检测体系含有内参比荧光ROX，用于校正加样误差和管间差异，便于仪器自动分析报告荧光与内参比荧光ROX的比值，使定量更准确。
3、试剂保存及有效期试剂应避光密闭保存于-20±5℃。
试剂盒有效期为12个月，避免反复冻融。
采用泡沫加冰运输5天不会影响产品效期。
4、样本要求4.1. 适用样本类型:血清或血浆样本。
4.2. 样本采集:4.2.1 血清样本采集:用无菌注射器抽取受检者静脉血2ml, 注入无菌收集管，室温不超过4小时，待样本自行析出血清，或直接室温1600rpm离心5分钟分离出血清，转移到1.5ml灭菌离心管中备用；4.2.2血浆样本采集:用无菌注射器抽取受检者静脉血2ml,注入含有EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的无菌收集管，立即轻轻颠倒混匀，室温不超过4小时，待样本自行析出血浆，或直接1600pm离心5分钟分离出血浆，转移到1.5ml灭菌离心管中备用。
HBVDNA核酸扩增及产物分析标准操作程序
HBV-DNA核酸扩增及产物分析标准操作程序一、目的：规范实验室操作，正确使用ABI-5700荧光定量PCR仪进行HBV-DNA扩增分析，以保证实验结果的准确性。
二、适用范围：乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒、ABI-5700荧光定量PCR仪。
三、职责：由临床基因扩增检验实验室专业技术人员制定程序文件，实验室负责人审核，科室主任批准实施。
四、程序：1、PCR扩增1）打开稳压器电源，再打开计算机电源。
2）打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。
3）将循环条件设定为4）检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。
5）将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中设定好反应孔位置。
6）关闭扩增仪盖，按仪器操作规程开始循环。
7）扩增结束后先保存结果，再关闭扩增仪电源，取出PCR 反应管，密封放入垃圾桶。
2、产物分析1）基线的确定：取3～8个循环的荧光信号。
2）阈值的设定：原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。
3）对照标准：阳性对照参控品的Ct值应小于28，标准曲线的拟和度应大于等于0.990，否则视为定量结果无效；阴性、空白对照的扩增曲线应平坦，Ct值等于30或0，否则结果无效。
4）结果判断：检测样本中核酸阳性时，按实际结果报告；对可疑结果应复查，需要时与临床联系。
5）填写检验记录，关闭计算机。
此标准操作变更程序：如果本操作程序使用者在实际工作中发现其存在问题，则应向科室负责人提出，科室负责人则召集所有与本程序有关的人员讨论，以决定是否需要变更本程序。
乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书
乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书-模板1.目的采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒核酸的定量检测，或用于乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。
2.范围适用于乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）定量检测（PCR-荧光探针法）。
3.职责3.1操作人员：负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。
3.2专业组组长：负责本组耗材的请购，监督本组标本检测、仪器操作、报告发送、质控管理等各方面工作。
3.3实验室主任：负责监督和指导实验室各方面工作。
4.原理采用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，在样品核酸纯化之后，通过荧光定量PCR对HBV DNA进行扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值（CT）实现对未知样品的检测。
另外，本试剂盒带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。
5.样品要求5.1适用样品类型：血清或血浆。
5.2样品采集：5.2.1血清用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2:^，注入无菌的真空采血管中（未加抗凝剂），室温（22-25℃）放置30-60min血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。
5.2.2血浆用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA （乙二胺四乙酸二钠）抗凝剂的真空采血管，立即轻轻颠倒混匀5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后分离血浆于无菌的1.5ml 灭菌离心管。
5.3样品保存和运送使用专用样品0c冰壶送检，温度约维持在4℃左右。
分离后的血清或血浆可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。
5.4拒收样品：拒绝重度溶血样品、肝素抗凝的血浆。
6.仪器和试剂6.1仪器AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。
乙肝核心抗原核酸检测原理
乙肝核心抗原核酸检测原理
乙肝核心抗原（HBcAg）是乙型肝炎病毒（HBV）感染时产
生的一种特定抗原。
乙肝核心抗原核酸检测可以用于检测乙肝病毒感染的早期阶段以及病毒血症的监测。
乙肝核心抗原核酸检测原理基于核酸扩增技术。
具体步骤如下：
1. 样本处理：从血液或组织样本中提取乙肝病毒核酸。
2. 逆转录：将病毒RNA转录成对应的DNA，即病毒RNA的
逆转录过程。
3. 嵌合酶链反应（LAMP）或聚合酶链反应（PCR）：使用特
异性引物和酶，在合适的温度下，对乙肝病毒核酸进行多轮扩增，从而产生大量的目标DNA分子。
4. 检测：通过荧光探针或其他荧光染料，对扩增的目标DNA
进行检测。
如果乙肝核心抗原核酸存在，检测结果将显示阳性荧光信号。
该检测方法具有高度的特异性和灵敏性，能够快速准确地检测出乙肝核心抗原核酸的存在，对乙肝病毒感染的早期诊断和监测具有重要意义。
HBV-DNA PCR检测规程
1 目的规范LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）的检验工作，指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量的检测，保证检验结果的质量。
2 范围本规程适用于LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）3 试剂中山大学达安基因公司乙肝病毒(HBV)核酸扩增荧光检测试剂盒4 仪器Roche LightCycler荧光PCR检测仪高速台式冷冻离心机微量加样器（覆盖1-1000μl）5 样品处理样品处理按《PCR实验室标本处理规程》进行收集和处理，具体操作见本规程附录1和附录2。
6 测定6.1 PCR扩增6.1.1 打开稳压器电源，再打开计算机电源。
6.1.2 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。
6.1.3 将循环条件设定为：6.1.4 检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。
6.1.5 将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中定好反应孔位置。
6.1.6 关闭扩增仪盖，按仪器操作规程开始循环。
6.1.7 扩增结束后关闭扩增仪电源，取出PCR反应管，密封放入垃圾桶。
6.2 产物分析6.2.1 条件设置：反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光数值为F1/F2。
点击Quantification读取结果。
6.2.2 基线的确定：取3～8个循环的荧光信号。
6.2.3 噪声容限（阈值）：调节在阴性质控品以上，要求在Step3：Analysis下相关性r值＜-0.97，接近-1.0。
6.2.4 对照标准：保证阴性质控品的Ct值不出现任何数值（默认为40）。
6.2.5 最后记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（M），关闭计算机。
7结果判断7.1 如果Ct值＝40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＜1×103。
7.2 如果Ct值＜40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＝ M7.3 检测样本中核酸阳性时，按实际结果报告；对可疑结果应复查，需要时与临床联系。
乙肝病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程
乙肝病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程一、引言乙肝病毒核酸检测是一种重要的手段，用于乙肝病毒感染的早期诊断和监测治疗效果。
本文档旨在描述乙肝病毒核酸检测的标本采集、送检和处理流程，以确保流程规范和结果准确性。
二、标本采集1. 标本选择：乙肝病毒核酸检测的标本可使用血清、血浆或乙肝病毒DNA提取物。
根据实验室提供的要求和使用的方法，正确选择合适的标本进行采集。
2. 采集器具：使用无菌器具进行标本采集，如无菌收集管、无菌采血针等。
3. 采集流程：- 患者应事先了解采集流程与注意事项，并保持合作配合。
- 消毒部位：消毒患者采血部位，通常选择肘弯处的静脉。
- 采血：按照相应的方法采集合适数量的血液样本。
注意血液采集的整洁和标本不得受到污染。
4. 采集注意事项：- 采血前需要对采血设备进行消毒处理。
- 采血时要避免对血液标本造成不必要的污染，防止样本交叉感染。
- 采血后进行适当的处理，确保采血点不出现血肿或其他并发症。
三、标本送检1. 样本存放：采集的标本应放入防漏、密封良好的中。
若需要长期保存，应在-80℃低温条件下保存，以防止DNA的降解。
2. 标本信息：在标本上标注清楚患者信息，如姓名、年龄、性别等。
确保标本信息准确，以避免混淆和误诊。
3. 快递选择：选择快递公司进行标本运输，确保安全、快捷的送达实验室。
在包装标记时，应注明标本的特殊性质，以提醒运输人员注意。
四、标本处理1. 样本分装：实验室收到标本后，根据实验要求进行样本分装。
如分装到提取试剂盒、酶解管中，标注清楚样本编号，确保实验过程的可追溯性。
2. 提取和纯化：根据实验方法进行标本的提取和纯化操作。
确保提取和纯化过程的洁净，避免外源性核酸污染。
3. PCR扩增：将提取纯化后的样本进行PCR扩增反应。
注意PCR操作条件的准确性，避免扩增过程中的交叉污染。
4. 结果分析：根据PCR扩增结果，通过相关分析方法，如凝胶电泳、定量PCR等，对乙肝病毒核酸进行检测和分析。
乙肝五项检测操作规程
乙肝五项检测(乳胶法)(一)检测目的乙型肝炎病毒标志物(HBsAgHBsAh、HBeAg、HBeAb、HbcAb)检测。
(二)测定原理HBsAg、HBsAh、HBeAg均采用双抗体(原)夹心法原理。
用抗HBsAg多克隆抗体包被硝酸纤维素膜，配以红色乳胶标记的抗HBs鲰单克隆抗体HBsAh，应用双抗体夹心法原理，定性检测血清／血浆中HBsAg；用HBsAg重组抗原和链霉亲和素一BSA包被硝酸纤维素膜，配以红色乳胶标记的HBs如重组抗原和生物素一BSA及其他试剂，应用双抗体夹心法原理，定性检测血清／血浆标本中HBsAb；用抗HBeAg单克隆抗体(Ehl)包被硝酸纤维素膜，配以红色乳胶标记的抗HBeAg单克隆抗体(Eh2)。
应用双抗体夹心法原理，用于定性检测血清或血浆中HBeAg。
HBsAg、HBsAb、HBeAg测试时，将血清／血浆标本滴人试剂板加样处．标本在毛吸效应下向E层析，如标本中含有相应的待测物质，在测试区(T)内会出现一条红色条带，则是阳性结果。
如标本中不含有相应的待测物质，则测试区(T)将没有红色条带，是阴性结果。
无论待测物质是否存在于标本中，一条红色条带都会出现在质控区内(c)。
质控区内(c)所显现的红色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。
HBeAh、HBcAh采用竞争法原理。
用HBeAg重组抗原包被硝酸纤维素膜，配以乳胶标记的鼠抗HBeAg单克隆抗体。
应用竞争抑制法原理，定性检测血清／血浆巾HBeAI，；用HBcAg重组抗原包被硝酸纤维素膜，配以乳胶标记的HBcAb单克隆抗体，应用竞争抑制法原理，定性检测血清／血浆中HB。
Ah。
测试HB。
Ah、HBcAb时，将血清／血浆标本滴入试剂板加样处，随之标本在毛吸效应下向上层析。
如标本中含有相应的抗体．则同膜上测试区(T)的单克隆抗体竞争与预包被在乳胶颗粒上的相应抗原反应。
如标本中没有相应的抗体，预包被在乳胶颗粒上的相应抗原则同膜上测试区(T)的单克隆抗体全部结合。
乙肝病毒e抗体诊断操作规程
乙肝病毒e抗体诊断操作规程
一、操作步骤：
1、将试剂盒从冰箱中取出至室温中平衡30分钟后使用。
2、将标本对应微孔按顺序编号。
3、每孔加入待测标本50微升，设阴、阳性对照
各两孔，每孔加入阴性对照（或阳性对照）各1滴，并设空白对照1孔。
4、每孔加入酶结合物1滴，（空白对照孔除外）
充分混匀，封板，置37度孵育30分钟。
5、手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，
静置5秒，甩干，重复5次后拍干。
洗板机洗板：选择洗涤5次程序后拍干。
6、每孔加显色剂A、B液各1滴，充分混匀，
封板，置37度孵育15分钟。
7、每孔加终止液1滴，混匀。
8、用酶标仪读数，取波长450nm（建议使用双
波长的酶标仪比色，参考波长630nm），先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。
二、结果判断：
Cutoff Value计算：
COV=阴性对照平均OD值+阳性对照平均OD值/2标本OD值大于等于COV为阴性，标本OD值小于COV为阳性。
三、注意事项：
1、使用前试剂应摇匀，并弃去1～2滴后垂直滴加。
2、封片不能重复使用。
3、结果判断须在反映终止后10分钟内完成。
4、不同批号的试剂不可混用。
5、待测标本不可用NaN3防腐，如需稀释标本，请用小牛血清稀释。
6、试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程处理。
[医学]乙肝病毒核酸检测实验操作流程
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主要内容
HBV-DNA的检测原理
HBV-DNA操作流程
标本采集 DNA 提取
PCR 扩增
HBV-DNA检测结果分析
临床意义
检测原理
HBV ：
用一对乙型肝炎病毒特性引物（Primer）和一 条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反 应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧 核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩 增法定量检测乙型肝炎病毒DNA
结果分析
1.
2.结果读取
3.结果报告
结果的报告必须简单清楚
定量测定则必须报告量的多少 1、结果高于测定方法线性范围上限，可报告>多少； 也可对样本稀释后再测，结果乘以稀释倍数 2、结果低于方法的测定范围下限，则报告多少即可， 不能报告“0”或阴性
临床意义
1、诊断早期乙型肝炎，提高HBV检测阳性率。 2、判断HBV的传染性及病毒复制情况，综合血清学指
三.PCR 扩增步骤
取上清液2ul点样 ↓↓ 8000rpm离心数秒 ↓↓ 按顺序放进扩增仪微孔中
↓↓
编辑软件，设置循环条件
↓↓
保存文件，运行
注意：吸取上清液中上层2ul进行加样， 不要吸取到沉淀。
循环条件
循环次数、温度 93℃ 2分钟 93℃ 45秒→55℃ 60秒→10个循环 93℃ 30秒→55℃ 45秒→30个循环
注意事项
3.浓缩离心后若出现有“絮状悬浮物”，去上清时应一 并把“絮状悬浮物”吸除，不影响实验结果。如不 吸取絮状悬浮物会导致实验结果偏低。
4.加入20ul的DNA提取液（DNA提取液用前充分融解 混匀),并用震荡器剧烈震荡混匀20秒后,瞬时离心。
乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测标准操作规程
乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测标准操作规程（PCR-荧光探针法）1.目的: 规范乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测操作流程，保证检测结果的准确性。
2.应用范围: HBV DNA 荧光定量检测。
3.职责:3.1 文件编写：实验室技术员。
3.2 文件审核：实验室主管。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4. 参考文献：4.1 中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书。
4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书。
5. 内容：5.1 检测方法：PCR-荧光探针法。
5.2 实验原理：用一对乙型肝炎病毒特异性引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR体外扩增法，即高温变性、低温退火、适温延伸进行DNA扩增，并对PCR全过程进行实时监测，从而定量检测乙型肝炎病毒DNA。
5.3 性能参数：5.3.1 精密度：检测下限为5.0x102IU/ml。
5.3.2 线性范围：1.0x103～1.0x108IU/ml。
5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集5.4.1 标本类型：血清。
5.4.2 标本采集：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温（22～25℃）放置30～60 min，全血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500 rpm离心5min；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。
5.4.3 标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月，应避免反复冻融。
5.4.4 运送条件：标本运送采用0℃冰壶。
5.4.5 标本拒收标准：污染、严重溶血、脂血类或肝素抗凝剂标本。
5.5 设备和试剂：5.5.1 设备： DA7600荧光定量PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。
《乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(1 2型)核酸检测试剂盒(PCR-荧光法)操作规程》.
乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）操作规程1.目的规范核酸检测试验操作，确保检测结果的准确性。
2.原理2.1 汇集：吸取8份（或以下）样品到指定的汇集管。
2.2提取：病毒核酸提取的方法为磁珠法。
试剂盒提供之内对照(IC)为不具感染性的假病毒，在进行样品核酸提取前加入样品中，监控提取、扩增和分析的全过程。
标本经裂解液处理后会将病毒外鞘膜破坏，蛋白质变形，使病毒裂解释放出病毒基因组核酸。
加入表面包被有二氧化硅的磁珠颗粒，在高盐环境下带负电荷的核酸吸附到带正电荷的的磁珠颗粒表面。
洗液可以洗去未结合的物质，如变性的蛋白、细胞碎片、PCR抑制物等并降低盐浓度。
纯化的病毒在特定的环境下从磁珠颗粒表面洗脱下来成为扩增的模板。
2.3扩增：采用PCR扩增TaqMan荧光探针标定技术同时对HBV（DNA）、HCV（RNA）、HIV（RNA）进行检测。
在反转录酶的作用下HCVRNA、HIVRNA反转录成cDNA，再与HBVDNA一同通过TaqDNA聚合酶的作用扩增病毒核酸的保守区域，TaqDNA聚合酶5`—3`外切酶活性切割反应系统中带荧光标记的TaqMan探针，随着PCR的进行，荧光信号不断积累。
通过PCR仪的检测血液标本达到和超过荧光阈值的信号给出样品的阴阳性结果。
选择性PCR扩增：采用UNG-dUTP抗污染系统。
在PCR扩增系统中采用UTP代替TTP，产生大量U-DNA片段。
UNG酶特异识别U-DNA片段中含UTP的位点并进行切割，U-DNA被降解后不能作为再次扩增的模板，系统选择性的扩增天然的核酸分子，从而防止了PCR扩增产物的污染。
2.4 质量控制原理为监控实验进行，保证实验结果的准确，在每次检测过程依靠阳性、阴性质控品以及内标进行监测。
2.4.1阴性质控品监控系统性假阳性，如果阴性质控品检测结果为阳性，说明实验存在假阳性的风险，因此实验中的阳性结果需复查。
HBV-DNA检测标准操作程序
2.3 吸取已编号的待测血清或血浆样本、试剂盒中的阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照及定量标准品（1→）各200μl,分别加入到1.5ml离心管中，在离心管上编好号，振荡混匀。
2.4 56℃温浴15-2Omin,期间颠倒混匀数次。
2.5 加入200Ul无水乙醇，充分混匀，将全部液体转入装有2ml收集管的硅胶柱中，IoOoorPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。
2.6 在硅胶柱中加入500Ul溶液Wl（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），1000OrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。
2.7 在硅胶柱中加入500Ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），1000OrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。
2.8 在硅胶柱中加入500Ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇）,IoOOOrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液。
2.9 将硅胶柱放入收集管中，1200OrPm空管离心3min,丢弃收集管。
2.10 将硅胶柱放入新的1.5ml离心管中，开盖静置L2min,往硅胶柱中心加入80Ul 的TE洗脱液，静置2-5min,1200OrPm离心2min,丢弃硅胶柱，盖好离心管盖，做好相对应的编号。
（注意：TE洗脱液的体积应不少于50ul,体积过小影响回收率。
为增加基因组DNA的回收率，可将TE洗脱液稍微加热。
获得的DNA应保存在-20°C,以防DNA降解。
）3 .加样（在样本处理区进行）3.1 向设定的n个PCR反应管中分别加入步骤1处理好的样品DNA、强阳性对照、临界阳性对照、阴性对照以及定量标准品（4个）各20μ∣,盖紧管盖，稍做离心。
3.2 将PCR反应管转移到检测区，放入相应的荧光PCR检测仪内，记录样品摆放顺序。
4 .PCR扩增（检测区）4.1 循环条件设置使用ABI7500和Line-Gene9660荧光PCR检测仪时循环程序设置如下：1150℃2min无2195℃9min无34595℃15sec无58℃50sec单次采集荧光4138℃10sec无■阴性对照无定量值出现，且内标Ct值W40；■强阳性对照检测值范围(3.16X105-3.16X106),临界阳性对照检测值范围(3.16×101-3.16×102),且内标Ct值W40。
乙肝病毒(HBV)PCR检测
试剂盒组成
DNA提取液：裂解病毒蛋白外壳，使病毒DNA游离
PCR反应管：含有扩增HBV特异DNA片段的引物、 dNTPs、Taq酶、PCR缓冲液、Mg2＋等，只需加入 模板即可进行扩增反应。
阳性模板：纯化的HBV －DNA，无病毒外壳，无 感染性，直接加入PCR反应管扩增后用作阳性对照。
加好样的PCR反应管放入PCR扩增仪的反应板上， 扩增程序：
（1）93ºC 3分钟 预变性 （2）三步循环：
93ºC 45秒（变性） 55ºC 45秒（复性） 共35个循环 72ºC 1分钟（延伸）
（3）72ºC 保温5分钟 （防止延伸不完整）
3. 电泳检测： 直接取PCR反应产物加入2％琼脂糖凝胶上电泳 20分钟，EB染色后在紫外灯下观察，若在314bp 处（与阳性对照处于同一位置）出现条带，则怀 疑为HBV阳性。
1. 标本处理： 每六人一组，取血清40ul加入0.5离心管，再加入 40ulDNA提取液，沸水浴10分钟，10000rpm离心 5分钟，上清用于扩增反应。
2. PCR反应： 每两人一组 其中一人取一PCR反应管，取1步骤离心后的上清2ul， 加入PCR反应管底层溶液中，6000rpm离心数秒。 另一人取一PCR反应管，取阳性模板2ul加入加入 PCR反应管底层溶液中，6000rpm离心数秒。
扩增人ß – actin特异片段
每两人一组ห้องสมุดไป่ตู้在一0.5离心管中加入以下组分：
模板
4ul
引物
2ul
dNTPs
1ul
Taq酶
0.5ul
10×PCR缓冲液 2.5ul
ddH2O
15ul
（反应体系为25ul）
（所发0.5ml离心管已加好除模板以外的所有组分，请 加入4ul昨日所提取的基因组DNA溶液即可进行扩增）
核酸检测实验的操作规范和流程
核酸检测实验的操作规范和流程本文档旨在规范核酸检测实验的操作步骤，确保实验进行的准确、可靠和安全。
请根据以下流程进行操作。
实验前准备1. 确保工作台面干净整洁，并备齐所需的实验器材。
2. 检查实验器材的完整性和消毒情况。
3. 将试剂室保持洁净，并检查试剂的标签和有效期。
4. 穿戴实验室服装和个人防护装备，包括实验手套、防护眼镜和口罩。
核酸提取1. 取样前，将样本标识清晰地写在试管上，并确保与记录一致。
2. 使用无菌技术，使用专用取样器具采集样本，并放入已标识的试管中。
3. 使用适当的提取试剂盒，按照说明书的要求进行样本提取。
注意遵守实验室的安全操作规程。
核酸扩增1. 将样本提取后的核酸溶液，按照扩增试剂盒说明书的要求，加入扩增试剂反应体系。
2. 启动扩增仪器，设置好反应条件，如温度、时间等。
3. 按照试剂盒要求，制备必要的阴性对照和阳性对照。
4. 将样品、对照和负控物分别加入扩增试剂反应体系中，注意控制反应体系的杂交和污染风险。
PCR产物分析1. 终止扩增反应后，将PCR产物置于4°C冰上保存。
2. 使用凝胶电泳或其他适当的分析方法，对PCR产物进行分析验证。
确保正确的扩增结果，并评估目标基因的存在与否。
结果解读1. 根据PCR产物分析结果，判断目标基因的存在与否。
2. 结果解读应结合实验目的，结合相关样本信息，进行科学合理的判断和分析。
实验后清理1. 将使用过的试剂瓶、试管和其他实验器材分类清理，并正确处理。
2. 清洗工作台面，保持实验环境整洁。
3. 按照实验室废物管理规定，进行废物处理。
以上是核酸检测实验的操作规范和流程，请按照要求严格执行，确保实验结果的准确性和可靠性。
乙肝dna检测的操作规程
乙肝dna检测的操作规程
乙肝DNA检测的操作规程主要包括以下步骤：
1. 采集血液样本：通过抽取受检者的静脉血液来获取样本。
建议在空腹状态下进行抽血，以提高检测的准确性。
2. 提取DNA片段：利用特定的设备和技术，如EV卸电泳、PCR等，从血液样本中提取出乙肝病毒的DNA片段。
这一步骤是检测的关键环节，需要使用精密的仪器和专业的操作。
3. 比对和分析：将提取出的DNA片段与标准样本进行比对，通过特定的检测方法，如荧光定量PCR、基因测序等，分析DNA片段的特性和序列，以确定乙肝病毒的种类和复制程度。
4. 得出检测结果：根据比对和分析的结果，得出乙肝病毒DNA的定量或定性检测结果。
通常情况下，检测结果会以数字或阴阳性方式呈现。
5. 报告与解读：将检测结果整理成书面报告，并提供给医生或受检者。
医生根据检测结果判断受检者是否感染乙肝病毒，以及病毒的复制程度和传染性。
受检者应遵循医生的建议进行相应的治疗或监测。
需要注意的是，乙肝DNA检测是一项高技术含量的实验，需要由经过专业培训的医务人员进行操作。
同时，乙肝病毒的检测结果解读需要结合其他相关检查结果和临床表现进行综合分析，因此最好在医生的指导下进行。
HBV、HCV检测规程
乙型肝炎病毒核酸定量检测1原理本试剂盒用一对乙型肝炎病毒特异性引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（TAQ酶）、核苷酸单体（DNTPS）等成分，用PCR体外扩增法定量检测乙型肝炎病毒DNA。
2 标本种类及收集要求2.1 标本采集2.1.1标本种类：血清或血浆。
2.1.2标本要求：血清——用一次性无菌采血针抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的干燥生化管，使用水平离心机，3000rpm离心10min;吸取上层血清，转移至1.5ML进口灭菌管。
血浆——用一次性无菌采血针抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA（乙二胺四乙酸二钠）抗凝剂管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5~10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，3000rpm离心10min;吸取上层血浆，转移至1.5ML 进口灭菌管2.2 标本储存：标本可立即用于测试，也可以保存与—20℃待测，保存期为6个月。
2.3标本运输：密封，室温运输。
2.4标本拒收标准：污染、标本量不足、严重溶血或脂血标本不宜作此项检测。
3试剂3.1 试剂名称：乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）3.2 试剂生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司。
3.3 包装规格：20人份/盒3.4 试剂盒组成DNA浓缩液，DNA提取液，PCR反应管，HBV临界阳性质控品，HBV强阳性质控品，阴性质控品，HBV阳性定量参考品（1.0×104IU/ml、1.0×105 IU/ml、3.5试剂储存条件及有效期：-20℃避光保存，有效期6个月。
4 仪器设备4.1 仪器名称：生物安全柜(Ⅱ级)、高速冷冻离心机、荧光定量PCR仪、恒温金属浴。
4.2 仪器厂家：上海培清、美国NUAIR公司、美国eppendorf、美国ABI生物技术公司、广州达安基因有限公司。
4.3 仪器型号：ABI7300、DA7600。
5 操作步骤5.1 DNA提取：5.1.1 标本处理（血清和血浆标本处理相同）-取100ul血清加入等量DNA浓缩液，振荡器振荡混匀5sec；12，000rpm离心10min；去上清，沉淀中加入30ul DNA 提取液，振荡器剧烈振荡混匀5-10sec，瞬时离心数秒，100℃恒温处理10±1min；12，000rpm离心5min，备用。
全员乙肝病毒核酸检测筛查采样工作方案
全员乙肝病毒核酸检测筛查采样工作方案1. 背景乙肝病毒是一种严重的传染病，受到全球范围内的关注。
为了及早发现和控制乙肝病毒感染，减少疫情传播风险，本文档旨在制定全员乙肝病毒核酸检测筛查采样工作方案。
2. 流程2.1 人员安排- 负责人：指定一名负责人，负责协调和监督全员乙肝病毒核酸检测筛查工作。
- 采样团队：组建一支采样团队，包括医生、护士和实验室技术人员等。
- 全员参与：所有人员需积极配合，履行个人信息采集和签署知情同意书。
2.2 采样准备- 采购物资：准备足够的乙肝病毒核酸检测盒、采样管、试剂和标签等物资。
- 健康须知：提前向全员传达关于乙肝病毒核酸检测的健康须知，包括采样前禁食禁饮事项、采集方式等。
2.3 采样过程- 采样时间：根据人员安排，确定适合的采样时间段。
- 采样地点：指定采样地点，提供足够的采样区域和防护设备。
- 样本采集：由采样团队负责采集乙肝病毒核酸检测样本，采用标准规范的采集方法，确保采样质量。
- 样本处理：将采集到的样本及时送至实验室，进行适当的处理和储存，确保样本的稳定性和准确性。
2.4 检测结果和后续措施- 检测时间：实验室进行乙肝病毒核酸检测，并在约定时间内将结果反馈给相关人员。
- 结果通知：将检测结果及时通知相关人员，并分类处理：阴性结果根据要求备案，阳性结果及时转诊至专业机构进行进一步诊断与治疗。
- 隐私保护：严格保护检测结果的私密性，避免泄露个人隐私信息。
3. 周期与频次- 乙肝病毒核酸检测筛查应定期进行，具体周期和频次可根据疫情和相关政策规定进行调整。
- 高风险人群和特定职业人员可根据需要增加检测频次。
4. 宣传和培训- 通过宣传渠道向全员传达乙肝病毒的相关知识，提升防控意识和参与意愿。
- 对采样团队进行规范的培训，掌握乙肝病毒核酸检测技术和工作流程。
5. 风险与挑战- 个人信息保护：在采样和结果通知过程中，要严格遵守相关法律法规，确保个人信息的保护和隐私。
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原理图
每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个荧光信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
操作流程
一、标本采集
一次性无菌注射器抽取 受检者静脉血2毫升，注 入无菌的干燥玻璃管 用一次性无菌注射器抽取 受检者静脉血2毫升，注 入含EDTA或枸橼酸钠抗凝 剂的试管
血 清 的 采 集
93℃ 30秒→55℃ 45秒→30个循环
结果分析
1.
2.结果读取
3.结果报告
结果的报告必须简单清楚 定量测定则必须报告量的多少 1、结果高于测定方法线性范围上限，可报告>多少； 也可对样本稀释后再测，结果乘以稀释倍数 2、结果低于方法的测定范围下限，则报告多少即可， 不能报告“0”或阴性
乙肝病毒核酸检测 实验操作流程
广西临床检验中心 唐 娟
主要内容
HBV-DNA的检测原理
标本采集
HBV-DNA操作流程
DNA 提取 PCR 扩增
HBV-DNA检测结果分析
临床意义
检测原理
HBV ： 用一对乙型肝炎病毒特性引物（Primer）和一
条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反
应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧 核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩 增法定量检测乙型肝炎病毒DNA
室温（22～25ºC）放置 30～60 分钟血标本使用 水平离心机，4000转/分 离心5分钟
血 浆 的 采 集
立即轻轻颠倒玻璃管混合 5～10次，使抗凝剂与静 脉血充分混匀
吸取上层血清，转移至 1.5ml灭菌离心管
5～10分钟后即可分离出 血浆，转移至1.5ml灭菌 离心管
注意事项
血清 血清
尽量吸取血清的上层液，有纤维蛋白的标本应离心去除 脂类浑浊标本拒收 （离心4000rpm，5min）
淀不明显可以保留少量液体，建议将移液器量程调至 190ul一次性吸取。
注意事项
3.浓缩离心后若出现有“絮状悬浮物”，去上清时应一 并把“絮状悬浮物”吸除，不影响实验结果。如不 吸取絮状悬浮物会导致实验结果偏低。 4.加入20ul的DNA提取液（DNA提取液用前充分融解
混匀),并用震荡器剧烈震荡混匀20秒后,瞬时离心。
（阴、阳性质控品处理方法：各取50ul，分别加入DNA提取液各50ul）
↓↓ 100℃恒温干浴10min ↓↓ 12000rpm离心5min
注意事项
1.加入等体积的浓缩液后请用震荡器剧烈震荡混匀。不 能用移液器混匀 2.标本12000rpm离心时一定要统一离心管摆放方向。 离心后应沿着沉淀存在的对侧缓缓吸去上清，枪头贴 管壁顺着液面下移，防止带走不可见的沉淀物。如沉
临床意义
1、诊断早期乙型肝炎，提高HBV检测阳性率。
2、判断HBV的传染性及病毒复制情况，综合血清学指
标，为临床提供准确的实验依据。 3、追踪病程，动态观察抗病毒药物治疗效果。 4、研究HBV感染的动态机理及探讨与癌症发生关系。 5、研究HBV分子流行病学。
血浆 不能使用肝素抗凝 因为对PCR扩增有抑制作用，且很难在核酸提取过程中完全去除
二.HBV-DNA的提取
打开HBV-DNA试剂盒 ↓↓ 取出DNA浓缩液、 DNA提取液（置室温融解，充分混匀） ↓↓ 取已灭菌的1.5ml离心管并按样本唯一编号 ↓↓ 加入DNA浓缩液和待测样本各100ul（振荡混匀） ↓↓ 12000rpm，离心10min ↓↓ 去上清，沉淀中加入20ulDNA提取液 （振荡混匀）
5.裂解温度要确保有100℃±1，裂解时间10min±1
三.PCR 扩增步骤
取上清液2ul点样 ↓↓ 8000rpm离心数秒 ↓↓ 按顺序放进扩增仪微孔中
↓↓
编辑软件，设置循环条件源自↓↓保存文件，运行注意：吸取上清液中上层2ul进行加样， 不要吸取到沉淀。
循环条件
循环次数、温度
93℃ 2分钟
93℃ 45秒→55℃ 60秒→10个循环