乙肝病毒核酸检测实验操作流程.
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乙肝病毒核酸检测 实验操作流程
广西临床检验中心 唐 娟
主要内容
HBV-DNA的检测原理
标本采集
HBV-DNA操作流程
DNA 提取 PCR 扩增
HBV-DNA检测结果分析
临床意义
检测原理
百度文库
HBV ： 用一对乙型肝炎病毒特性引物（Primer）和一
条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反
5.裂解温度要确保有100℃±1，裂解时间10min±1
三.PCR 扩增步骤
取上清液2ul点样 ↓↓ 8000rpm离心数秒 ↓↓ 按顺序放进扩增仪微孔中
↓↓
编辑软件，设置循环条件
↓↓
保存文件，运行
注意：吸取上清液中上层2ul进行加样， 不要吸取到沉淀。
循环条件
循环次数、温度
93℃ 2分钟
93℃ 45秒→55℃ 60秒→10个循环
血清 血清 尽量吸取血清的上层液，有纤维蛋白的标本应离心去除 脂类浑浊标本拒收 （离心4000rpm，5min）
血浆 不能使用肝素抗凝 因为对PCR扩增有抑制作用，且很难在核酸提取 过程中完全去除
二.HBV-DNA的提取
打开HBV-DNA试剂盒 ↓↓ 取出DNA浓缩液、 DNA提取液（置室温融解，充分混匀） ↓↓ 取已灭菌的1.5ml离心管并按样本唯一编号 ↓↓ 加入DNA浓缩液和待测样本各100ul（振荡混匀） ↓↓ 12000rpm，离心10min ↓↓ 去上清，沉淀中加入20ulDNA提取液 （振荡混匀）
淀不明显可以保留少量液体，建议将移液器量程调至 190ul一次性吸取。
注意事项
3.浓缩离心后若出现有“絮状悬浮物”，去上清时应一 并把“絮状悬浮物”吸除，不影响实验结果。如不 吸取絮状悬浮物会导致实验结果偏低。 4.加入20ul的DNA提取液（DNA提取液用前充分融解
混匀),并用震荡器剧烈震荡混匀20秒后,瞬时离心。
（阴、阳性质控品处理方法：各取50ul，分别加入DNA提取液各50ul）
↓↓ 100℃恒温干浴10min ↓↓ 12000rpm离心5min
注意事项
1.加入等体积的浓缩液后请用震荡器剧烈震荡混匀。不 能用移液器混匀 2.标本12000rpm离心时一定要统一离心管摆放方向。 离心后应沿着沉淀存在的对侧缓缓吸去上清，枪头贴 管壁顺着液面下移，防止带走不可见的沉淀物。如沉
临床意义
1、诊断早期乙型肝炎，提高HBV检测阳性率。
2、判断HBV的传染性及病毒复制情况，综合血清学指
标，为临床提供准确的实验依据。 3、追踪病程，动态观察抗病毒药物治疗效果。 4、研究HBV感染的动态机理及探讨与癌症发生关系。 5、研究HBV分子流行病学。
血 清 的 采 集
室温（22～25ºC）放置 30～60 分钟血标本使用 水平离心机，4000转/分 离心5分钟
血 浆 的 采 集
立即轻轻颠倒玻璃管混合 5～10次，使抗凝剂与静 脉血充分混匀
吸取上层血清，转移至 1.5ml灭菌离心管
5～10分钟后即可分离出 血浆，转移至1.5ml灭菌 离心管
注意事项
93℃ 30秒→55℃ 45秒→30个循环
结果分析
1.
2.结果读取
3.结果报告
结果的报告必须简单清楚 定量测定则必须报告量的多少 1、结果高于测定方法线性范围上限，可报告>多少； 也可对样本稀释后再测，结果乘以稀释倍数 2、结果低于方法的测定范围下限，则报告多少即可， 不能报告“0”或阴性
应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧 核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩 增法定量检测乙型肝炎病毒DNA
原理图
每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个荧光信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
操作流程
一、标本采集
一次性无菌注射器抽取 受检者静脉血2毫升，注 入无菌的干燥玻璃管 用一次性无菌注射器抽取 受检者静脉血2毫升，注 入含EDTA或枸橼酸钠抗凝 剂的试管
广西临床检验中心 唐 娟
主要内容
HBV-DNA的检测原理
标本采集
HBV-DNA操作流程
DNA 提取 PCR 扩增
HBV-DNA检测结果分析
临床意义
检测原理
百度文库
HBV ： 用一对乙型肝炎病毒特性引物（Primer）和一
条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反
5.裂解温度要确保有100℃±1，裂解时间10min±1
三.PCR 扩增步骤
取上清液2ul点样 ↓↓ 8000rpm离心数秒 ↓↓ 按顺序放进扩增仪微孔中
↓↓
编辑软件，设置循环条件
↓↓
保存文件，运行
注意：吸取上清液中上层2ul进行加样， 不要吸取到沉淀。
循环条件
循环次数、温度
93℃ 2分钟
93℃ 45秒→55℃ 60秒→10个循环
血清 血清 尽量吸取血清的上层液，有纤维蛋白的标本应离心去除 脂类浑浊标本拒收 （离心4000rpm，5min）
血浆 不能使用肝素抗凝 因为对PCR扩增有抑制作用，且很难在核酸提取 过程中完全去除
二.HBV-DNA的提取
打开HBV-DNA试剂盒 ↓↓ 取出DNA浓缩液、 DNA提取液（置室温融解，充分混匀） ↓↓ 取已灭菌的1.5ml离心管并按样本唯一编号 ↓↓ 加入DNA浓缩液和待测样本各100ul（振荡混匀） ↓↓ 12000rpm，离心10min ↓↓ 去上清，沉淀中加入20ulDNA提取液 （振荡混匀）
淀不明显可以保留少量液体，建议将移液器量程调至 190ul一次性吸取。
注意事项
3.浓缩离心后若出现有“絮状悬浮物”，去上清时应一 并把“絮状悬浮物”吸除，不影响实验结果。如不 吸取絮状悬浮物会导致实验结果偏低。 4.加入20ul的DNA提取液（DNA提取液用前充分融解
混匀),并用震荡器剧烈震荡混匀20秒后,瞬时离心。
（阴、阳性质控品处理方法：各取50ul，分别加入DNA提取液各50ul）
↓↓ 100℃恒温干浴10min ↓↓ 12000rpm离心5min
注意事项
1.加入等体积的浓缩液后请用震荡器剧烈震荡混匀。不 能用移液器混匀 2.标本12000rpm离心时一定要统一离心管摆放方向。 离心后应沿着沉淀存在的对侧缓缓吸去上清，枪头贴 管壁顺着液面下移，防止带走不可见的沉淀物。如沉
临床意义
1、诊断早期乙型肝炎，提高HBV检测阳性率。
2、判断HBV的传染性及病毒复制情况，综合血清学指
标，为临床提供准确的实验依据。 3、追踪病程，动态观察抗病毒药物治疗效果。 4、研究HBV感染的动态机理及探讨与癌症发生关系。 5、研究HBV分子流行病学。
血 清 的 采 集
室温（22～25ºC）放置 30～60 分钟血标本使用 水平离心机，4000转/分 离心5分钟
血 浆 的 采 集
立即轻轻颠倒玻璃管混合 5～10次，使抗凝剂与静 脉血充分混匀
吸取上层血清，转移至 1.5ml灭菌离心管
5～10分钟后即可分离出 血浆，转移至1.5ml灭菌 离心管
注意事项
93℃ 30秒→55℃ 45秒→30个循环
结果分析
1.
2.结果读取
3.结果报告
结果的报告必须简单清楚 定量测定则必须报告量的多少 1、结果高于测定方法线性范围上限，可报告>多少； 也可对样本稀释后再测，结果乘以稀释倍数 2、结果低于方法的测定范围下限，则报告多少即可， 不能报告“0”或阴性
应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧 核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩 增法定量检测乙型肝炎病毒DNA
原理图
每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个荧光信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
操作流程
一、标本采集
一次性无菌注射器抽取 受检者静脉血2毫升，注 入无菌的干燥玻璃管 用一次性无菌注射器抽取 受检者静脉血2毫升，注 入含EDTA或枸橼酸钠抗凝 剂的试管