天然药物活性筛选考卷

2012级硕士研究生期末考题

(1)请列举5种转基因动物可用于老年痴呆药物研究，并简要说明它们的特征和应用范围（5分）

i APP转基因小鼠：

病理特征：APP水平是正常鼠的6倍，Ab增高10-14倍，出现淀粉样血管病变，脂质氧化损伤，超氧化物歧化酶增加。行为学特征：9-10月龄小数空间辨识能力受损。

应用范围：APP 转基因鼠可用于抗老年痴呆中药的药效评价、活性筛选以及作用机制的研究。

ii APOE小鼠

特征：该模型的转基因小鼠动脉壁损伤严重,内皮细胞出现受损、变质、脱落,细胞内连接不紧密。内皮下间隙增宽,内弹力膜破坏和消失；中膜平滑肌结构破坏,合成型平滑肌较多。

应用范围：可用于模拟小鼠老化过程中动脉粥样硬化进程，以及药物等因素对动脉粥样硬化进程的影响。

iii 神经组织特异表达CTF1转基因小鼠

特征：转入的CTF1基因在脑组织的表达水平均高于同龄对照小鼠，CTF1转基因小鼠大小脑组织基本结构形态与正常小鼠对照没有异常。

应用范围：用于研究CTF1生物学功能与老年痴呆等疾病发病机制的关系。

iv 快速老化SAM-P小鼠

特征：老化迅速，且其海马甲醛含量随老龄化进程而增加。

应用范围：研究内源性甲醛异常蓄积与记忆衰退关系，研究大鼠老化机制等。

PS1-GFP小鼠

特征：高表达早老蛋白PS1

应用范围：研究早老蛋白的结构和功能，了解其导致老年化的机制。

(2)请比较细胞活性检测的几种方法的异同，包括MTT法、Hoechst 染色法、细胞排染实验、细胞克隆形成实验，包括实验目的、原理、方法、优缺点等（10分）

①MTT法

实验目的：在肿瘤增值实验中，根据活细胞功能强弱，推测出活细胞相对数目

或相对活力。

原理：活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的MTT，生成蓝紫色不溶于水的甲臜（Formazan）。甲臜的多少可以用酶标仪在570nm 处进行测定。甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。

方法：细胞培养，传代，计数后接种，加药处理72小时后，加入MTT溶液(5mg/ml)，孵育2-4小时，弃去培养液，加入DMSO溶解生成的甲臜，用酶标仪测试OD值。

优点：操作简单。

缺点：只能测得活细胞相对数目或相对活力，不能测定细胞绝对数。

②Hoechst 染色法

实验目的：通过活细胞及死亡细胞hoechst染色后颜色分布不同，对活细胞和死亡细胞分别计数，计算细胞存活率。

实验原理：Hoeschst333258与DNA特异性结合发出蓝色荧光。活细胞成均匀的淡荧光，调亡细胞核或细胞质内则为强荧光的颗粒状物质。

实验方法：肿瘤细胞用Hoeschst333258染色后，在荧光显微镜下观察，记录死亡和活细胞数目。

优点：不用加入染色剂，hoeschst与DNA结合后，在紫外激发下可自发光。缺点：计数过程复杂且耗时耗力。

③细胞排染实验

实验目的：根据死亡和活细胞染色颜色不同，计数死亡和正常细胞的数目，计算细胞存活率。

原理：细胞损伤或死亡后细胞膜完整性被破坏，正常细胞排染，而死亡细胞染成蓝色。

方法：细胞悬液加入酞酚蓝染色液混匀，用细胞计数板，分别计数活细胞（未染色）和死细胞（蓝色）数目。

优点：测得活细胞的准确数目，

缺点：数目多且一般要同一个人完成，计数过程复杂且耗时耗力。

④细胞克隆形成实验

实验目的：根据细胞是否具有克隆能力，进行活细胞计数

实验原理：具有克隆能力的细胞为活细胞，通过计数克隆团的数目，测定活细胞数目。

试验方法：将药物处理后的细胞培养至克隆团出现时，终止培养，加药固定细胞，显微镜计数克隆团数目。

优缺点：克隆测定则确切地反映了具有克隆能力的活存细胞数，并且适用于所有生长形式的细胞。

缺点：操作繁琐，且培养时间较长。

(3)请举例说明蛋白组学在心血管系统药物研究中的应用，标注参考文献。（5分）

应用二向电泳、图像分析、质谱鉴定等蛋白质组学技术测定药物作用于心血管细胞后引起表达量有显著变化的蛋白质，找到药物的作用蛋白，进一步探讨药物发挥作用的分子机制，为寻找心血管疾病的潜在靶标奠定基础。

吕俊萍,王树人,马增春等.运用蛋白质组学技术研究TNF-α对血管内皮细胞的作用机制[J].中国病理生理杂志.2004(07)

(4)请说明时间分辨荧光（TRF）和均相时间分辨荧光（HTRF）的技术原理和各自的优势。（5分）

时间分辨荧光：以镧系元素(稀土离子：铕、钐、镝、铽）为复合物的荧光试剂，发射光衰减时间长，可以关闭激发光后再检测。因此杜绝了激发光的干扰，信号灵敏度和准确度比普通荧光试剂更高。

优点：快速（短时间特异性结合）高通量；高灵敏（nmol或pmol水平)；功能性筛选（激动或拮抗）；药效团分析（分子筛选）广泛应用于高通量筛选模型。

均相时间分辨荧光HTRF®技术结合了荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF''Time Resolved Fluorescence)）两种技术。利用了具有穴状结构的Eu元素的螯和标记物和XL665作为一个供体（Donor），是基于Eu穴状化合物的供体与受体（第二荧光标记物）之间的荧光共振能量转移（FRET）。在荧光共振能量转移中，受体发射荧光的寿命等同与供体的发射荧光的寿命。

优点：结合了荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF''Time Resolved Fluorescence)）两种技术，且