影响荧光值强度的因素
7.2 荧光强度及影响荧光强度的因素
7.2 荧光强度及影响荧光强度的因素
6.荧光定量公式
荧光强度 If正比于吸收的光强度Ia和荧光量子产率 ：
由朗伯-比耳定律：
If = Ia
Ia = I0(1-10- b c ) If = I0(1-10- bc ) = I0(1-e-2.3 b c ) 浓度很低时（A < 0.05），将括号项近似处理后：
苯
苯酚
苯胺
苯甲酸 硝基苯
相对强度
10
18
20
3
0
重原子效应：荧光强度随取代基相对原子质量的增加而减弱
相对强度
氟苯 10
氯苯 7
溴苯 5
碘苯 0
系间窜跃加强，磷光强度增大
7.2 荧光强度及影响荧光强度的因素
3.影响荧光强度的外部因素
（1）溶剂 溶剂的极性、氢键、配位键的形成，荧光发生变化（注明在何种溶剂中） （2）温度 温度降低，荧光强度增大。如荧光素钠的乙醇溶液，在-80℃量子产率接近1 （3）酸度 苯胺在pH 7~12的溶液中，蓝色荧光 pH<2或 pH>13，无荧光（严格控制酸度）
7.2 荧光强度及影响荧光强度的因素
2.荧光与分子结构的关系
判断某物质荧光强弱
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间窜跃速率常数小，有利于荧 光的产生，
（2）共轭效应：提高共轭程度有利于增加荧光效率并产生红移
苯
萘
蒽
量子产率
0.11
0.29
0.46
发射波长/nm
278
321
400
有机荧光物质多含有键的有共轭结构的芳香族化合物及其金属配合物
环境因素对荧光光谱和荧光强度的影响
ﻫ4.散射光的影响:ﻫ主要是瑞利散射光和拉曼散射光的影响较大。校正办法：先用短的激发光激发，检出溶液的拉曼峰，然后进行荧光光谱校正。因为荧光光谱不随激发光波长的改变而改变,而拉曼光却随之改变。
ﻫ5．高浓度样品的影响：ﻫ1)当激发光照射高浓度样品时，在激发光入口附近产生荧光,但这些荧光并不能进入荧光检测器。ﻫ2)高浓度的分子之间相互作用而发生活性阻碍现象。
3）荧光的再吸收:即荧光光谱的短波长端和激发光谱的长波长端如果相互重叠，则发生荧光再吸收。总之，高浓度样品进行荧光分析时,应进行稀释。
溶液荧光光谱通常有以下几个特征：
(2）温度的影响。温度对于溶液的荧光强度有着显著的影响。通常,随着温度的降低,荧光物质溶液的荧光量子产率和荧光强度将增大。如荧光索钠的乙醇溶液，在0℃以下温度每降低10℃，荧光量子产率约增加3％,冷却至-80℃时，荧光量子产率接近1０0%。
(３）ｐH的影响。假如荧光物质是一种弱酸或弱碱，溶液的pH值改变将对荧光强度产生很大的影响。大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光光谱，对于溶剂的pH和氢键能力是非常敏感的。表3－1中苯酚和苯胺的数据也说明了这种效应。其主要原因是体系的pH值变化影响了荧光基团的电荷状态。当pＨ改变时，配位比也可能改变，从而影响金属离子-有机配位体荧光配合物的荧光发射。因此，在荧光分析中要注意控制溶液的ｐＨ。
A ＋ B → C﹡ ＋ D
C﹡→ Ｃ ＋ hυ
化学发光包括吸收化学能和发光两个过程。为此，它应具备下述条件:
image j 荧光强度
image j 荧光强度摘要：一、引言二、荧光强度的定义与测量三、影响荧光强度的因素1.仪器和实验条件2.样本性质3.染色剂浓度和类型四、荧光强度在生物研究中的应用1.细胞和分子成像2.生物传感器3.生物标记物五、提高荧光强度的方法1.优化实验条件2.选择合适的样本和染色剂3.应用新型成像技术六、荧光强度在临床诊断中的应用1.肿瘤诊断2.感染性疾病检测3.疾病进展监测七、结论正文：一、引言荧光强度是生物科学研究和临床诊断中一个重要的参数。
了解荧光强度的定义、测量方法以及影响因素，有助于深入研究荧光在生物科学和医学领域的应用。
本文将详细介绍荧光强度的相关知识，包括其定义、测量方法，以及影响荧光强度的因素和在生物研究和临床诊断中的应用。
二、荧光强度的定义与测量荧光强度是指单位体积内荧光物质在特定波长下所发射的光子数量。
荧光强度的测量方法有多种，如荧光显微镜法、流式细胞术等。
荧光强度的单位通常为arbitrary units (AU)，表示相对于一个没有荧光的参照物体的荧光强度。
三、影响荧光强度的因素1.仪器和实验条件荧光强度的测量受到仪器性能和实验条件的影响。
例如，荧光显微镜的滤光片选择、光源强度、检测器灵敏度等都会对荧光强度的测量结果产生影响。
2.样本性质样本的性质对荧光强度也有很大影响。
例如，细胞密度、细胞状态、组织结构等因素都会影响荧光强度的测量结果。
3.染色剂浓度和类型染色剂的浓度和类型是影响荧光强度的关键因素。
染色剂浓度过低时，荧光强度会减弱；浓度过高时，可能会导致非特异性荧光信号的产生。
此外，不同类型的染色剂具有不同的荧光光谱特性，选择合适的染色剂对于获得理想的荧光强度至关重要。
四、荧光强度在生物研究中的应用1.细胞和分子成像荧光强度在细胞和分子成像中发挥着重要作用。
通过使用荧光标记的抗体、蛋白质或其他分子，研究人员可以观察到它们在细胞内的分布和动态变化。
2.生物传感器荧光强度在生物传感器领域也具有广泛应用。
溶剂粘度对荧光强度的影响
溶剂粘度对荧光强度的影响全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：溶剂粘度对荧光强度的影响荧光是一种常见的物理现象，它是指当某些物质受到激发后会发出可见光的现象。
在科学研究和工业生产中，荧光具有重要的应用价值。
对于荧光的产生机理和特性研究，可以帮助我们更好地理解物质的性质和行为。
而溶剂粘度作为影响荧光的重要因素之一，对荧光强度的影响备受关注。
溶剂粘度是指液体内部粒子间相互作用造成的阻力大小。
在实际中，溶剂粘度取决于溶质浓度、温度等因素。
而对于荧光物质而言，其分子在溶液中的运动受到了溶剂的阻碍，这就导致了溶剂粘度对荧光强度的影响。
在溶液中，荧光分子的激发态寿命受到溶剂粘度的影响。
一般来说，溶剂粘度较大时，分子的运动速度较慢，激发态寿命较长，从而导致激发态的发射几率也会增加，荧光强度会增加。
相反，溶剂粘度较小时，分子的运动速度较快，激发态寿命较短，荧光强度会减小。
除了对激发态寿命的影响外，溶剂粘度还可以影响荧光分子之间的相互作用。
在高溶剂粘度的情况下，荧光分子之间的相互作用会受到限制，因而荧光分子之间的能量传递较小，荧光强度会增加。
而在低溶剂粘度的情况下，荧光分子之间的相互作用会增加，导致能量传递增加，荧光强度减小。
溶剂粘度对荧光强度的影响是一个复杂的过程，其中涉及了分子运动、相互作用、排列和取向等因素。
了解溶剂粘度对荧光的影响有助于我们更好地理解荧光现象的机理和规律。
在实际应用中，我们可以通过控制溶剂粘度来调节荧光的强度，以满足不同的研究和生产需求。
希望今后能有更多的研究关注溶剂粘度对荧光的影响，为荧光的应用研究提供更多的理论和实验支持。
【2000】第二篇示例：溶剂粘度对荧光强度的影响是一个在化学领域中备受关注的研究课题。
荧光现象是某些物质受到激发能量后发出的一种特殊的辐射现象，这种现象在许多科学领域中有着重要的应用。
而溶剂的粘度则是指在不同条件下溶液的黏度，即溶液的流动性能。
在不同的溶剂中进行荧光实验时，溶剂的粘度会对荧光强度产生影响，这种影响可能是正向的也可能是负向的。
溶剂粘度对荧光强度的影响
溶剂粘度对荧光强度的影响
其次，溶剂的粘度还可能影响分子的构象和微环境。
在高粘度
溶剂中，分子可能会受到更多的约束，导致其构象发生改变。
这种
构象的改变可能会影响分子的荧光性能，包括激发态寿命、荧光量
子产率等，从而影响荧光强度。
另外，溶剂的粘度还会影响分子与溶剂之间的相互作用。
在高
粘度溶剂中，分子与溶剂之间的相互作用可能会增加，这可能会影
响分子的激发态和荧光态的能级结构，进而影响荧光强度。
此外，溶剂的粘度还可能影响荧光分子的旋转速率。
在高粘度
溶剂中，分子的旋转可能会受到阻碍，这可能会影响分子的取向平
均化，从而影响荧光强度。
总的来说，溶剂的粘度对荧光强度的影响是一个综合性的问题，涉及到分子扩散、构象、相互作用和旋转等多个方面。
因此，在研
究溶剂粘度对荧光强度的影响时，需要综合考虑这些因素，以获得
全面的理解。
对荧光强度造成影响的各种因素的分析研究
第37卷第4期2021年2月Vol.37No.4Feb.2021甘肃科技Gansu Science and Technology对荧光强度造成影响的各种因素的分析研究魏晋祥，马宏达△，梁晓烬，杨琨，王举鹏，王福军，郝建国，赵家宁(甘肃省核与辐射安全中心，甘肃兰州730000)摘要：通过控制变量法，逐一研究温度、浓度、时间、有机物(猝灭剂)等因素，在液体铀分析中对荧光强度的影响做研究验证。
液体荧光法。
主要结果(1)样品pH值在3~5和7~9之间荧光强度比较稳定,而随着pH值的增加,荧光强度也不断增加。
(2)溶液温度的变化对荧光强度有明显的影响。
随着温度的升高而络合效率降低，直至完全失效。
受条件所限，样品测量温度在(0~30)摄氏度之间对测量结果的影响不大。
(3)溶液浓度极低时,样品中铀荧光强度和溶液浓度呈线性增加。
由于WGJ-m微量铀分析仪适用范围为(0~20)ng/mL,在测量范围内，仪器的荧光强度随着铀的含量呈线性增加。
对于每台仪器的性能不同，建议测量时选择适合该仪器的测量区间范围,确保准确性。
(4)对于大多数样品，加入荧光增强剂后的荧光强度会随着时间的推移下降，到一定时间后达到平衡。
个别样品的情况与之相反。
(5)乙醇对荧光有熄灭作用,遇到这类样品需进行处理后再进行测量。
(6)光源强度对荧光强度有直接影响。
pH值的变化对溶液的荧光强度有很大的影响。
pH在3~5之间荧光强度比较稳定。
pH在7~9之间荧光强度最高。
荧光增强剂荧光强度随着溶液温度的升高而降低，在(0~30)摄氏度之间对测量结果的影响不大。
样品中铀的含量在仪器测量范围内呈线性增加关系。
样品中荧光强度在一定时间内会随着时间发生变化。
猝灭剂(乙醇)对荧光有猝灭作用。
仪器光源强度对荧光强度有直接影响。
关键词:pH值;荧光强度;时间;溶液浓度;猝灭剂中图分类号：043当前，液体荧光法是测量环境样品中微量铀的主要方法，而wGj-m微量铀分析仪具有操作简便、仪器价格经济实惠、又方便携带等优点。
仪器分析13.1.4 影响荧光强度的因素
内容选择
13.1 分子荧光与磷光分析原理 13.2 分子荧光分析法 13.3 分子磷光分析法
1
结束
第十三章 分子发光分析法
Molecular luminescence analysis
第一节 分子荧光与磷光分析
法的基本原理
Basic principles of molecular fluorescence and phosphorescence
13.1.1 分子荧光与磷
光的产生过程
13.1.2 荧光光谱的基 本特性
，外转换去活的几率增加。
• 3. 溶液pH: 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要
严格控制。
4.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发 射的荧光，如色氨酸中的重铬酸钾。
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸 收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
2019/11/5
13.1.3 荧光的产生与 分子结构关系
13.1.4 影响荧光强度 的因素
2019/11/5
13.1.4 影响荧光强度的因素
影响荧光强度的外部因素
1.溶剂的影响: 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、
配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。
2019/11/5
• 2.温度的影响: 荧光强度对温度变化敏感，温度增加
5.溶液荧光的猝灭
荧光猝灭：荧光分子与溶剂分子或其他分子间相互作用, 使荧光强度减弱的现象。
猝灭剂：能引起荧光强度降低的物质。 原因：碰撞猝灭（动态猝灭，主要原因 ）、静态猝灭（ 荧光分子与猝灭剂生成不产生荧光的配合物） 、转入三重 态猝灭、自吸收猝灭等 氧（O2 ）：最常见的猝灭剂 ，测定时除氧。 高浓度时：荧光分子发生自吸收现象。
origin荧光相对强度
origin荧光相对强度Origin荧光相对强度是指荧光物质在激发后发出的荧光相对于其激发光强度的比值。
在荧光分析中，荧光相对强度是一个重要的指标，可以用来评估荧光物质的荧光效率以及其在样品中的含量。
本文将从荧光分析的原理、应用及影响荧光相对强度的因素等方面进行探讨。
一、荧光分析的原理荧光分析是一种基于荧光现象的分析方法，利用荧光物质在激发后发出的荧光信号来进行定性和定量分析。
在荧光分析中，荧光相对强度是一个重要的参数，它可以反映荧光物质的荧光效率以及样品中的含量。
荧光物质在受到激发光的激发后，其内部电子会跃迁到高能级，然后再从高能级跃迁回到低能级，释放出荧光信号。
荧光信号的强度与荧光物质的浓度成正比，但受到荧光物质的荧光效率和样品基质的影响。
二、荧光分析的应用荧光分析在生物医学、环境检测、食品安全等领域有广泛的应用。
例如，在生物医学领域，荧光分析可以用来检测生物标志物、细胞内分子的分布和相互作用等。
在环境检测中，荧光分析可以用来监测水质、大气污染物等。
在食品安全领域，荧光分析可以用来检测食品中的有害物质和添加剂等。
三、影响荧光相对强度的因素1. 荧光物质的结构：荧光物质的结构会影响其荧光效率和荧光相对强度。
一般来说，芳香环结构和共轭体系的荧光物质具有较高的荧光效率和荧光相对强度。
2. 激发光的波长和强度：激发光的波长和强度会影响荧光物质的激发效率和荧光相对强度。
通常情况下，选择合适的激发光波长和适当的激发光强度可以提高荧光相对强度。
3. 样品基质的影响：样品基质的性质和浓度对荧光相对强度有重要影响。
一些样品基质可能会发生荧光猝灭或增强现象，从而影响荧光相对强度的测量结果。
4. 温度和溶剂的影响：温度和溶剂的选择也会对荧光相对强度产生影响。
一般来说，较低的温度和适当的溶剂可以提高荧光物质的激发效率和荧光相对强度。
四、荧光相对强度的测量方法荧光相对强度可以通过荧光分光光度计或荧光显微镜等仪器进行测量。
原子荧光法测汞荧光强度影响因素及解决办法
原子荧光法测汞荧光强度影响因素及解决办法摘要：随着汞及其化合物的广泛使用，汞的污染也随着现代工农业的发展越来越严重，国家更加重视对生态环境的保护，加强了对大气、水、土壤等汞元素的测试。
汞元素具有易生成原子蒸气的特性，因而氢化物发生-原子荧光光谱法测试得到广泛应用。
在原子荧光法测试汞元素的实践操作过程中，对其存在的影响因素进行分析，并提出合理的改进措施，提高原子荧光光谱仪测试的质量，发挥原子荧光光谱法在检验检测中的应用。
关键词：原子荧光法；汞；测试；影响因素汞及其化合物的应用很广，在化工、农业、电器、冶金、医疗、军工等领域都有很重要的用途，随着汞及其化合物的广泛使用，汞的污染也随着现代工农业的发展越来越严重。
汞是环境中一种生物毒性极强的重金属污染物，它及其化合物毒性都很大，特别是汞的有机化合物（烷基汞）毒性更强，进入生物体内难以排出，严重危害人类健康，测试环境中汞含量具有非常重要的意义。
原子荧光法测汞元素具有操作简单、快速、灵敏度高、基体干扰少、分析结果稳定、相对设备成本低、可实现（半）自动化操作等特点，原子荧光法已成为测定痕量汞的有效方法，而汞含量的测定又易受多种因素的干扰，尤其是低含量的准确度和高含量的记忆效应。
本文通过对原子荧光光谱法测试汞元素的影响因素进行分析，并提出相应的应对措施，以期原子荧光法能在实际检验检测中更好地应用。
1 .原子荧光法测定汞原理经预处理后的试液进入原子荧光光谱仪，在酸性条件的硼氢化钾（或硼氢化钠）还原作用下，生成原子态汞，原子态汞受汞元素灯发射光的激发产生原子荧光，原子荧光强度与试液中待测元素含量在一定范围内呈正比[1]。
1.影响因素影响原子荧光法测定汞元素的因素主要有：仪器条件、实验试剂、容器污染、过程污染、环境影响等。
本文将对这些影响因素逐一分析，并提出相应的措施建议，以能更好的应用于实际测试工作。
2.1仪器条件因素影响原子荧光光谱仪的仪器参数主要有：负高压、灯电流、原子化器高度、载气和屏蔽气流量、读数和延迟时间等。
原子荧光负高压对荧光强度的影响
原子荧光负高压对荧光强度的影响
原子荧光是指当原子受到激发后，发射出特定波长的光。
原子荧光强度受到多种因素的影响，其中包括负高压。
负高压是指在放电管中，阳极与阴极之间的电压为负值。
这种电压可以影响原子荧光的强度，主要有以下几个方面的影响：
1. 激发原子数目，负高压的增加会增加放电管中的电子能量，从而增加激发原子的数目。
当激发原子的数目增加时，发射的荧光光子数目也会增加，从而提高荧光强度。
2. 荧光光谱的分辨率，负高压的增加可能会改变放电管中的电子能量分布，使得原子荧光的发射波长分布发生变化。
这可能会影响荧光光谱的分辨率，从而影响荧光强度的测量结果。
3. 能级跃迁的激发条件，负高压的改变可能会影响原子内部能级的分布，从而改变能级跃迁的激发条件。
这也会对荧光强度产生影响。
总的来说，负高压对原子荧光强度的影响是复杂的，需要综合考虑放电管中的电子能量分布、能级跃迁条件等因素。
在实际应用
中，需要进行系统的实验研究和数据分析，以确定负高压对荧光强度的影响规律。
这样才能更准确地控制和利用原子荧光技术。
荧光效率荧光强度
荧光效率荧光强度荧光效率和荧光强度是描述荧光分子性质的两个重要参数。
荧光效率指的是激发能量转化为荧光能量的比例，而荧光强度则是指单位时间内从样品中发出的荧光光子数。
本文将详细介绍这两个参数的定义、影响因素以及测量方法。
一、荧光效率1. 定义荧光效率是指激发能量转化为荧光能量的比例。
通常用以下公式来表示：φ = (k_f)/(k_f + k_nr)其中，φ表示荧光效率，kf表示辐射跃迁速率（即分子从激发态跃迁到基态时通过辐射方式散失能量的速率），knr表示非辐射跃迁速率（即分子从激发态跃迁到基态时通过非辐射方式散失能量的速率）。
2. 影响因素（1）分子结构：不同结构的分子具有不同的电子云密度和轨道对称性，因此其吸收和发射谱带宽、位置和强度都有所不同，进而影响其荧光效率。
（2）环境因素：溶剂极性、温度、pH值等环境因素都会影响分子的荧光效率。
例如，极性溶剂中分子的荧光效率通常较低，而在非极性溶剂中则较高。
（3）激发光波长：不同分子对不同波长的激发光响应不同，因此其荧光效率也有所差异。
3. 测量方法测量荧光效率通常需要测量两个参数：荧光量子产率和吸收截面。
荧光量子产率是指单位时间内发出的荧光光子数与单位时间内吸收的激发光子数之比，而吸收截面则是指单位时间内被样品吸收的激发光功率与入射激发光功率之比。
二、荧光强度1. 定义荧光强度是指单位时间内从样品中发出的荧光光子数。
通常用以下公式来表示：I = φ × P × ε其中，I表示荧光强度，φ表示荧光效率，P表示入射激发光功率，ε表示摩尔吸收系数（即单位浓度下样品对入射激发光的吸收程度）。
2. 影响因素（1）荧光量子产率：荧光强度与荧光量子产率成正比关系，因此荧光量子产率越高，荧光强度也越大。
（2）吸收截面：吸收截面越大，样品对入射激发光的吸收程度越高，从而激发更多的分子进入激发态，产生更多的荧光。
（3）溶剂效应：溶剂极性、温度、pH值等环境因素都会影响分子的荧光强度。
环境因素对荧光光谱和荧光强度的影响
3．环境因素对荧光光谱和荧光强度的影响（1）溶剂的影响。
一般地讲，许多共轭芳香族化合物的荧光强度随溶剂极性的增加而增强，且发射峰向长波方向移动。
如图3-4所示，8-羟基喹啉在四氯化碳、氯仿、丙酮和乙腈四种不同极性溶剂中的荧光光谱。
这是由于n→π＊跃迁的能量在极性溶剂中增大，而π→π＊跃迁的能量降低，从而导致荧光增强，荧光峰红移。
在含有重原子的溶剂如碘乙烷和四氯化碳中，与将这些成分引入荧光物质中所产生的效应相似，导致荧光减弱，磷光增强。
（2）温度的影响。
温度对于溶液的荧光强度有着显著的影响。
通常，随着温度的降低，荧光物质溶液的荧光量子产率和荧光强度将增大。
如荧光索钠的乙醇溶液，在0℃以下温度每降低10℃，荧光量子产率约增加3%，冷却至-80℃时，荧光量子产率接近100%。
（3）pH的影响。
假如荧光物质是一种弱酸或弱碱，溶液的pH值改变将对荧光强度产生很大的影响。
大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光光谱，对于溶剂的pH和氢键能力是非常敏感的。
表3-1中苯酚和苯胺的数据也说明了这种效应。
其主要原因是体系的pH值变化影响了荧光基团的电荷状态。
当pH改变时，配位比也可能改变，从而影响金属离子-有机配位体荧光配合物的荧光发射。
因此，在荧光分析中要注意控制溶液的pH。
（4）荧光的熄灭。
它是指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象。
这些引起荧光强度降低的物质称为熄灭剂。
五．影响荧光测量的几种因素：1．温度影响：一般说来，荧光随温度升高而强度减弱，温度升高1℃，荧光强度下降1～10%不等。
测定时，温度必须保持恒定。
2．PH值影响：PH 值影响物质的荧光，应选择最佳PH制备样品。
3．光分解对荧光测定的影响：荧光物质吸收紫外可见光后，发生光化学反应，导致荧光强度下降。
因此，荧光分析仪要采用高灵敏度的检测器，而不是用增强光源来提高灵敏度。
测定时，用较窄的激发光部分的狭缝，以减弱激发光。
免疫荧光平均荧光强度
免疫荧光平均荧光强度免疫荧光（Immunofluorescence）是一种常用的细胞和分子生物学技术，用于检测和定性或定量测量特定抗原在细胞或组织样本中的存在和分布。
基于特异的抗原-抗体反应，该技术利用荧光标记的抗体与目标抗原结合形成复合物，并借助荧光显微镜观察样本中的荧光信号。
平均荧光强度是指在免疫荧光实验中，特定荧光标记的抗体与目标抗原结合后所产生的荧光信号的强度平均值。
通过测量荧光强度，可以评估抗体与目标抗原的结合程度，进而推断目标抗原的表达水平、分布模式及相关功能。
在进行免疫荧光实验时，需要注意以下几个重要的因素，这些因素直接关系到荧光信号的稳定性和准确性，从而影响到荧光强度的测量结果：1. 样品处理：对于细胞样本，需要进行固定和渗透化处理，以保持细胞完整性和防止非特异性荧光。
对于组织样本，需要进行适当的固定和脱水处理，以保持组织结构和细胞膜完整性。
2. 抗体选择：选择适当的一抗和二抗对目标抗原进行标记和检测。
一抗通常是具有高度特异性和亲和力的抗体，二抗是带有荧光标记的抗动物抗体。
常见的荧光标记包括荧光素、荧光素同工异构体和有机染料，如荧光素同工异构体488（FITC）、罗丹明123（RHO）和二甲基二硫苯基荧（DMABT）等。
3. 免疫染色和显微镜观察：根据实验要求，可以选择不同的免疫染色方法，如直接法、间接法、多重染色法等。
利用荧光显微镜观察样本，由于荧光信号较弱，需要适当调整显微镜参数，如增益、曝光时间和孔径等，以获得清晰的图像和准确的荧光强度。
4. 图像分析和数据处理：通过图像分析软件对荧光图像进行分析，测量荧光强度。
常见的方法包括选择感兴趣区域（ROI）进行荧光强度测量、背景修正和正常化处理等。
统计学方法可用于比较不同样本或不同实验条件下的荧光强度差异，并进行相关数据的统计学分析。
荧光强度的测量结果可以提供关于抗原的定性和定量信息。
一般来说，荧光强度较高的区域表示抗原表达水平较高，而荧光强度较低的区域则表示抗原表达水平较低。
影响荧光强度的外部因素
F f Io (1 e2.303Ecl) f Io 2.303Ecl 在低浓度时 F Kc
荧光强度与分子结构的关系
荧光强度与分子结构的关系
3 苯环上取代基的影响
芳香环上的有取代基： 给电子基团 (-OH、-OR、-CN、-NH2、-NR2等) 会与
芳香环形成p-共轭，增强了电子共轭程度， 使荧光增强。 吸电子基团 (-COOH、-NO、-CO、卤素等)，会削 弱电子共轭性，荧光会减弱 其它基团(-SO3H、-NH3+、-R)不影响荧光。
度与熄灭剂的含量呈线性，可利用它分析熄灭剂含 量—荧光熄灭法。比直接荧光法更灵敏，选择高。
影响荧光强度的外部因素
散射光的影响
散射光—光子与溶剂分子相 碰撞，使光子改变方向，而向不 同方向散射。
散射光不会影响荧光强度，会 影响荧光测定。
瑞利散射光 拉曼散射光
r o
r o
I0
Ia
Is F 单色器
荧光强度与溶液浓度之间的关系
f
F Ia
F f Ia
Ia Io It Io (1 T )
Io (110Ecl )
Io (1 e2.303Ecl )
Io Ia
F f Ia f Io (1 e2.303Ecl )
荧光强度与溶液浓度之间的关系
x 0 ex 1 x 1ex x
影响荧光强度的外部因素
温度、溶剂、酸度、猝灭剂
温度的影响
温度—分子间碰撞频率—猝灭去活几率 低温有利荧光
影响荧光强度的外部因素
溶剂的影响—极性、粘度
极性增大，将使跃迁的能 量减小，而导致荧光峰红移，荧光增 强。
粘度增大，分子碰撞频率减小， 荧光增强。
荧光光谱
(4)系间跨跃 系间跨跃 系间跨越指的是不同多重度状态间 的一种无辐射跃迁过程．它涉及受激电 子自旋状态的改变．如S1到T 1，使原来 两个自旋配对的电子不再配对．这种跃 迁是禁阻的，但如果两个电子能态的振 动能层有较大的重叠时，如图中激发单 重态S1的最低振动能层与激发三重态T1 的较高振动能层重叠，则可能通过自旋 －轨道耦合等作用使S1态转入 T1态的某 一振动能层．
（2）非共振荧光
当荧光与激发光的波长不相同时，产生非共振荧光； 分为：直跃线荧光、阶跃线荧光、anti-Stokes荧光三种； 直跃线荧光（Stokes荧光） 直跃线荧光（Stokes荧光）：跃回到高于基态的亚稳态时 荧光 所发射的荧光；荧光波长大于激发线波长（荧光能量间隔小 于激发线能量间隔）； a b c d
激发光谱与发射光谱的关系
a.Stokes位移 Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比 激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b.发射光谱的形状与激发波长无关 . 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生 不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃 迁回到基态，产生波长一定的荧光。 c. 镜像规则 . 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一 样）成镜像对称关系。
镜像规则的解释
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似； 基态上的 零振动能级与 第一激发态的 二振动能级之 间的跃迁几率 最大，相反跃 迁也然。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
image j 荧光强度
image j 荧光强度
摘要：
1.荧光强度的定义与重要性
2.荧光强度的测量方法
3.影响荧光强度的因素
4.荧光强度在生物医学领域的应用
正文：
荧光强度是指荧光物质在激发态下所发射的光的强度。
在生物医学领域，荧光强度被广泛应用于生物分子的标记和检测、疾病的诊断和治疗等多个方面。
因此，研究和了解荧光强度具有重要意义。
测量荧光强度的方法有多种，其中最常用的是荧光显微镜法。
荧光显微镜可以对荧光物质的激发和发射进行实时监测，从而获取荧光强度。
此外，荧光强度也可以通过荧光光谱仪进行测量。
荧光光谱仪可以对荧光物质在不同波长下的激发和发射进行扫描，从而得到荧光强度的分布情况。
荧光强度受多种因素影响，包括荧光物质的性质、溶液的物理环境、荧光物质的浓度等。
例如，荧光物质的发射波长和荧光强度成正比，荧光物质的浓度越高，荧光强度也越强。
此外，温度和pH 值也会影响荧光强度。
荧光强度在生物医学领域的应用广泛。
例如，荧光标记的抗体可以用于疾病的诊断，通过检测荧光强度可以判断疾病是否发生。
此外，荧光强度也可以用于药物的输送和释放。
通过改变荧光强度，可以监测药物在体内的分布和代谢情况。
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影响荧光强度的因素
1.荧光的减退
荧光物质经紫外线长时间照射及空气的氧化
作用，会使荧光逐渐减退。
2.荧光强度与溶液浓度的关系
在稀溶液中：F＝Kc F 为荧光强度
K—检测效率（由仪器决定）c 为液体的浓度
高浓度时，荧光物质发生熄灭和自吸收现象，使F与c不呈线性关系
3.温度的影响
温度对荧光强度的影响较敏感。
溶液温度
下降时，介质的粘度增大，荧光物质与分子的
碰撞也随之减少，去活化过程也减少，则荧光
强度增加。
相反，随着温度上升，荧光物质与
分子的碰撞频率增加，使去活化几率增加，则
荧光强度下降。
4. pH的影响
带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化
合物的荧光一般都与溶液PH值有关，例如：在
pH=7~12的溶液中苯胺以分子形式存在，会发出
蓝色荧光；而在pH<2或pH>13的溶液中苯胺以离
子形式存在，都不会发出荧光。
同时所用酸的种
类也影响荧光的强度，例如：奎宁在硫酸溶液中
的荧光比在盐酸中的要强。
5.溶剂
许多有机物及金属的有机络合物，在乙醇
溶液中的荧光比在水溶液中强。
乙醇、甘油、
丙酮、氯仿及苯都是常用的有机溶剂，其中大
多有荧光，应设法避免；一般避免的办法是稀
释，或加入一部分水。
6.荧光强度达到最高点所需要的时间不同，有
的反应加入试剂后荧光强度立即达到最高峰。
有
的反应需要经过15~30分钟才能达到最高峰。
7.有机溶剂中常有产生荧光的杂质，可用蒸馏法提纯。
橡皮塞、软木塞及滤纸中也常有能溶于溶剂的一些带荧光的物质。
注意事项
①在实验中，拿比色杯要拿4个棱角，切勿
拿光滑的透光面，以免影响检测效果
②比色杯用后，应用醇或其它有机溶剂浸
泡。
③氙灯长时间使用（1000h以上）后可能
会发生爆炸，所以保证期（500h）以后，应及
时更换。
④在安装或更换氙灯时，应确认电源开关
为OFF，并切断电源。
核黄素易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。
核黄素在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测核黄素时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。
维生素B2(又叫核黄素，VB2)是橘黄色无臭的针状结晶。
其结构式为：
由于分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此它能够发射荧光。
维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。
维生素B2溶液在430~440nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535nm附近。
维生素B2在pH＝6~7的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素B2溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测维生素B2的含量。
维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质——光黄素，光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光比维生素B2的荧光强得多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。