神经细胞体外培养方法及应用

甲苯胺蓝 硫瑾等组化染色
镀银染色
NADPH-d特异性神经组织化学法
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神经细胞培养的应用
应用领域
研究各种因素对神经的影响
1. 化学物质，物理因素，生物因素，环境中化学因子， 自由基，外伤、高温等因素，病毒感染。
2. 药物，细胞因子，对神经细胞的作用，各种药物，如 中药，脑活素，神经生长因子，成纤维细胞生长因子 （bFGF），神经营养因子
成熟后则相反，且神经元会受到大的普遍损伤。
部位：灰质、PNS神经节，神经元集中，密度大
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神经元的体外培养液
天然合成成分 血清 血浆 胚胎撮液 人工培养基 无血清培养基 化学限定性培养基 常用的：DMEM + 添加剂
F12
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①葡萄糖 为神经元能量代谢主要来源 33mm
②CO2 NaHCO3缓冲系统重要 HEPESO2耗量更 高
当8000-12000个/96孔 或 2.8万-4万个/cm2 存 活率最大。
3天后不到接种的一半，故研究某一生长因子 前3天加药最好
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神经元的体外存活时间
短1-2W 长 4个月
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体外分化标志
破伤风毒素 NSE NF200,NF160
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神经细胞的特殊染色鉴定方法
尼氏体染色 焦油紫
3. 膜片钳技术，细胞表面通道和离子流动，电变化。
神经细胞体外培养 方法及应用
汕大医学院病理教研室
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神经细胞体外培养的历史
神经组织的体外培养方法是由Harrison，于1907年首 创的。
由于该方法具有简化细胞生化环境、明确生长条件、 便于施加实验因素及容易获得活体直接观测结果等优 点，因而已成为研究神经系统结构和功能的有效手段。
九十余年来，这项技术已从组织块（或植块）培养 （ explant culture） 发 展 到 分 离 细 胞 培 养 (dissociated cell culture)，并逐渐与多种现代技 术结合起来，在神经科学各领域发挥了重大作用。
与CMF-Hanks 液一起移至离心管
舍弃CMF-Hanks液，再加入5ml 0.25%胰蛋白酶和5滴0.2%Dnase液
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370C，30min
舍弃胰蛋白酶，加入5ml培养液和10滴Dnase液
用巴斯德吸管吹打20次，再用套有微量加样器头的加样器吹打20次
若有组织残渣，将上清移至新试管再加3ml培养液反复吹打
将细胞悬液收集于离心管，离心1200r/min ，8min，舍去上清，向沉 淀加培养液，离心1200r/min，8min
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加入培养液调整悬液中的细胞浓度，神经节细胞为1×107
种入涂有poly-D-lysine的盖片上，每片50μl
放入CO2孵箱中过夜
次日加3ml培养液
2天后（培养的第三天）换入有DNA合成阴断剂的培养液
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选择添加剂的基本过程
限定连续细胞系的体外生长条件。
试定该细胞系来源的细胞的培养 液条件。
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Bottenstein实验室经过长期研究发 现如下添加剂比较好
人转铁蛋白、牛胰岛素、硒酸钠、孕酮、腐胺 加入到F12与DMEM 1:1混液中，可以代替血清 添加物，用来培养大鼠CNS的成神经细胞瘤细 胞。删去其中任何一种添加物都可导致成神经 细胞瘤细胞生长状况锐减。该实验室共列出了 三种神经元限定性培养添加物的配方，代号分 别为N1、N2、N3。
③K+ 神经元生理活动的重要离子，K+是神 经元存活所必需的，K+ 24.5mM 能提高 神经元存活，促分化
④非神经元成分的抑制 有 2-3天
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神经元无血清限定培养液
人工合成的培养基虽然具备了细胞生长的基本 营养物质和无机盐类，但仍无法满足不同类型 细胞的特殊需要。大多数神经元在基础培养液 中即使能够存活也为期不长，更难以分裂。因 此可根据神经元的特性，给基础培养中再添加 某些特殊物质。
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来自百度文库
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组织块培养→分离细胞培养→ 甚至单一型细胞培养
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神经组织的植块培养法
悬滴培养方法
单盖玻方法
双盖玻方法 1925
改良双盖玻方法
培养物：
CNS灰质、白质、外周神经节或神经小段
↓
↓
突起
非神经元外伸
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优点
所需培养液量少，可反应组织代谢中 微量生化改变
保留了植块内组织特征
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不足
3. 细胞间相互作用：巨噬细胞，雪旺细胞等。 4. 各种生理病理状态下神经元状态改变
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实验方法
研究手段及测量指标
1. 形态学观察： 光镜，相差显微镜：细胞数目，形态，大体结构，突触 电镜：超微结构。
2. 激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope, LCSM) ：研究细胞内成分变化，离子改变 等，三维重建
终止消化离心洗涤 2000转/分 ，5分钟弃上清。吹打 制成细胞悬液。
台盼兰染色计数后接种于事先涂好鼠尾胶的24孔板中。 370C 5%CO2培养2天后换生长培养液
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大鼠海马神经细胞培养方法
神经元体外生长特征
接种密度与体外存活率
当96孔 每孔2000-3000个 或 7000-10000个 /cm2几乎无神经元存活
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N1的配方为
胰岛素5μg/ml 转铁蛋白5μg/ml 孕酮20 nM 腐胺100Um 硒30nM
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神经体外培养的生长基质
胶元 多聚赖氨酸 LN
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神经细胞培养操作程序表
脊髓后根节 孕18~20天大鼠胚胎
大脑皮质 新生1~3天大鼠
在CMF-Hanks液中取出组织除去脑膜
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神经元的分离培养过程
大鼠大脑皮层神经组织细胞培养
组织来源
新生大鼠1-2日龄，碘 酒 ，洒精消毒。
断头，取出大脑，分离脑 膜 ，夹取两侧大脑皮质放 入接种培养液中，用D-Hank’s冲洗二遍。
剪碎，0.5-1mm3,用D-Hank’s充分洗去残血
加入5-10倍量0.25%胰蛋白酶，移入离心管中放到水 370C浴箱中消化20-25分钟。
培养空间小，O2 CO2供少 培养空间湿度难以控制，水分会蒸发 密封手续繁杂，不利更换培养液，难
以观察单个神经元生长。
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神经元的分离细胞培养方法
1956年，Nakai首创了神经组织的分离培养方法 材料来源：胚胎动物神经组织 神经元增殖发生于胚胎期 形态学分化和化学分化程度低，体外存活强，