五年制免疫实验课 小鼠脾脏单个核细胞分离-新

二、B细胞增殖试验
B细胞 增殖试 验 原 液 养 Td结 ， 中R束 不 对 加 掺溶 入 入前 T细性 不 法胞2溶 检2S小无P性 测A时刺是S加 B激P人 细A入作胞B，细用的3H混胞。增-匀 T的在殖d培高R淋程，养效巴度采促3天细。用分，胞裂培 3H悬-
镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用 1000µl加样器隔着纱布将细胞悬液吸出，放入1.5ml EP管中， 做好标记。 3 、加样：吸取2ml细胞悬液沿试管壁缓慢加至分层液顶部(距
1cm处) NOTE：不要打破细胞悬液与分层液的界面；
4、1800 转，室温离心 30 分钟； 5、用毛细管插入液面下，尽量吸取白色毛玻璃层，放入EP管中；
流式细胞仪工作原理
免疫磁珠分离术
1. 直接法：
抗细胞表面分子抗体+磁性微球
免疫磁珠+细胞悬液 强磁场
与免疫磁珠结合的细胞
2. 间接法：
第二抗体+磁性微粒 第一抗体+细胞
磁场 特定细胞
淋巴细胞分离及检测技术
淋巴细胞的分离 淋巴细胞的功能测定技术
淋巴细胞的功能测定技术
一、体外法 1. 淋巴细胞增殖试验 2. 酶联免疫斑点法 3. 细胞毒试验
本次课分离小鼠脾脏单个核细胞
Ficoll密度梯度离心法
脾细胞 悬液
培养液
Ficoll
实验材料
分组：两人一组， 每组一只小鼠
器材
数量 试剂及动物
数量
滴管 EP管 计数板 1ml加样器(tip) 20ul加样器(tip) 滴管
1支/2人 3个/2人 1块/2人 1把/4人 1把/4人 1支/2人
分层液
NOTE：尽量少吸分层液；
6、每管加 PBS 到1ml，重悬细胞，3000转离心5分钟。
7、计数：吸弃上清，用100ml PBS重悬细胞，取出20ml加入新 的EP管中，再加入20ml细胞计数液，混匀后取出10ml，加到 计数板内，显微镜下计数。
细胞计数方法
4
查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的平均细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y×104×稀释倍数
根据实验目的不同，采用不同方法，主要需考 虑(1)细胞纯度；(2)细胞获得量；(3)细胞活力；
Ficoll密度梯度离心法
常用来分离单个核细胞的分层液：比重是 1.077左右的聚 蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)分层液。
红细胞、粒细胞比重大(1.092)，离心后沉于管底；淋巴 细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重(1.070)， 离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞， 就可从外周血/组织液中分离到单个核细胞。
淋巴细胞分离及检测技术
Biblioteka Baidu
红细胞
巨噬细胞
淋巴细胞
DC细胞
淋巴细胞分离及检测技术
淋巴细胞的分离 淋巴细胞的功能测定技术
淋巴细胞分离
一、外周血单个核细胞的分离 淋巴细胞分离液密度梯度离心法
二、淋巴细胞亚群的分离及鉴定 1. E花环分离法 2. 尼龙纤维分离法 3. 流式细胞术 4. 磁珠分离术
1ml/2人
PBS
1瓶/4人
计数液
1瓶/室
RPMI1640（无血清）100ml/室
RPMI1640(5%NCS) 100ml/室
平皿（含纱布块 ）1套/4人
剪刀、镊子
1套/4人
显微镜
1台/4人
实验步骤
1、处死小鼠，取 4 ml 无血清RMPI 1640 培养液放入平皿中。 2、取出脾脏放到平皿中，将3-4层纱布覆盖到组织上，用直头
一 、 T细 胞 增 殖 试 验
1. 形态学检查
T细胞增殖试验 原毒的行正理刺分常素激裂：）人后的T、转细能淋非化胞转巴率特体化为母异（外为细7性形0受体％胞有态特积左，丝学异较右以分示性大。此裂意抗、测原原图代定（物）谢T如质细旺P（胞盛HA的如、、功细且C能菌能on类进。A） 4P8H~A72刺小激时
FCM将免疫荧光技术应用于流式细 胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受 体）进行快速、精确的分析和自动检测， 并将不同类型的细胞分选收集。FCM还 可 对 同 一 细 胞 的 多 种 参 数 （ 如 DNA 、 RNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息 分析，是当代生命科学研究领域中广泛 使用的一项新技术。
2013级五年制本科生 免疫学实验课
基础医学院免疫学系
小鼠脾脏单个核细胞的 分离
实验内容
小鼠脾脏单个核细胞的分离（实验） 淋巴细胞分离及检测技术（讲解）
实验目的
掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离及淋转的 原理和方法
熟悉淋巴细胞的检测技术
细胞分离纯化的目的
测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或 组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细 胞、粒细胞等。
3. MTT法
四 甲基（偶MT氮T 唑 ） 盐法 转 M分 于 胞T细 增 化 解T胞 殖 淋 ， ， MT内 程 巴在 活T或 度 细细 产细成细 胞生 胞胞胞 正被蓝 线培周 相有色 粒关养围丝甲 体。终，分臜 内形止（裂的成前F原琥o甲数r等珀m臜小激的 酸az时 a活量 脱n 加)沉发与 氢入积生细 酶
二、体内法
淋巴细胞增殖试验
淋 巴细胞增 殖试验 原 增 胞 能 tran的 。加 ，sf作淋o， 称 此r巴m用 同 淋 实a下 验细t时 巴io，胞细 细 可n细在胞 胞 测te胞有s定t形 转)内丝. 态 化 淋核分转 试 巴酸裂化 验 细和原为 胞蛋或(l原 的y白特mp质异始 应h合性母 答o c成抗细 功yte
E花环分离法
（纯化T细胞）
T细胞表面的CD2分子－绵羊红细胞受体（E受体）
尼龙纤维分离法
B细胞和单核细 胞具有易粘附特性， 将淋巴细胞悬液加 到尼龙纤维上， 37℃作用1－2小时 后，洗脱的为非粘 附性T细胞。
PBMC
B细胞 单核细胞
尼龙纤维 毛柱
T细胞
流式细胞术
（Flow Cytometry，FCM）
2.
3 H-TdR掺 入 法 T细胞增殖试验 原激胞养腺DD淋素NN活巴经进理液嘧AAβ后入细：中中啶的，胞-S淋加，液核原期进对巴入根体苷，料入刺细据闪3H细(被（细激T胞同烁标胞d摄胞物3位仪被RH记合入)周的素检-有，的T成期应细掺测d丝则DDR进答入胞。N分N掺3H行水A细A，裂入合-明有平胞T原掺法成d显丝。的RC入）原分掺增量o新n作料加裂入则A合为或脱，的，可成合P当同在氧推H细位的培成测胸A