五年制免疫实验课 小鼠脾脏单个核细胞分离-新
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
T细胞表面标志及其亚群
CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（help T cell,Th）
CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 细胞毒性 （cytotoxic T cell,Tc or CTL）
CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cell,Tr or Treg）
B细胞表面标志
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FACS、 MACS
2. 根据细胞理化性质 ： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
部分 SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分 CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg 分子 为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。
CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞 ， B1 细 胞 为 CD19 和 CD5 双 阳 性 ， 而 B2 细 胞 仅 为 CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。
脾
脾（spleen ）位于腹腔的左上方，是机体内最大的淋 巴器官，呈扁椭圆形，暗红色、质软而脆。
脾脏功能
脾在正常情况下，只产生淋巴细胞及单核细胞，但在病 态及大失血后可产生各种血细胞。脾主要功能是参与免 疫反应，脾内的巨噬细胞能吞噬和清除衰老的红细胞， 细菌和异物，产生淋巴细胞，及单核细胞，贮存血液。 胚胎时期可造血。脾脏在胚胎时期是一个重要的造血器 官，出生后能产生淋巴细胞和单核细胞。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。
脾脏单个核细胞的制备
脾脏单个核细胞的制备脾脏单个核细胞的制备: 将5 只小鼠断颈椎处死, 无菌取出脾脏, 分别剪碎, 置200 目无菌尼龙网上, 分次滴入4~ 5 ml RPMI1640 培养液, 轻轻研磨脾脏, 直到脾脏变白;收集细胞悬液( 由于红细胞所占比例很低且对实验影响不大, 故无需作红细胞裂解处理) , 1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5 min, 弃上清; 加入2 ml pH7. 4 的PBS, 混匀后1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5min, 弃上清; 加入4 ml RPMI1640 培养液, 混匀, 用RPMI1640 培养液稀释200 倍后滴加在细胞计数板上进行细胞计数, 根据计数结果用RPMI1640 将细胞悬液调成2 × 10 / 300 µl 的浓度。
《流式细胞术检测小鼠脾细胞内细胞因子刺激方案的筛选》单细胞悬液的制备：将大鼠颈椎脱位处死后, 置70%乙醇中浸泡5 m in, 无菌取出脾脏和胸腺置于平皿中, 除掉结缔组织, 用生理盐水清洗3次。
加入2 mL RPM I- 1640完全培养液, 用剪刀分别将脾和胸腺剪成1 mm 1 mm 1 mm 碎块后, 用毛玻片轻柔研磨组织碎片, 经8层纱布过滤制成单细胞悬液, 经H anks液离心洗涤后, 将细胞悬浮于含10%小牛血清的RPM I- 1640 培养液。
台盼蓝染色, 计数活细胞在95%以上, 调整细胞数至5×10 cells /L。
《粗江蓠多糖对大鼠淋巴细胞周期的影响》610制备脾细胞悬液脾淋巴细胞的获取:手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等手术器械,300 目尼龙网等须经消毒处理; 以颈椎脱臼法处死小鼠, 用7 5 % 乙醇浸泡小鼠10-15min 。
沿腹腔中线剪开小鼠胸腔, 取出脾脏置于培养皿中, 剪去脂肪和筋膜组织, 用R PMI-1640培养液漂洗。
粗剪成小块, 用注射器芯轻轻挤压, 加人基础培养液, 混悬, 用300目尼龙网过滤到玻璃离心管中, 再加人基础培养液冲洗网上剩余组织细胞。
复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数
小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：实验地点：实验人：1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。
外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。
免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。
红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。
是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。
2实验材料：1)健康小鼠2)手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3)70%乙醇4)PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）5)0.2%台盼蓝6)细胞计数板、计数器7)离心机8)显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏●将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。
●用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。
3.2制备单个核细胞悬液●将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。
●吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min，弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min，以破坏红细胞。
然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。
●弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
3.3计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324×104×10=3.24×107/ml3.4计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16个，计算细胞活力为：324-16/324×100%=95.1%在理论范围之内4实验结果4.1研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。
实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。
复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数
小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：____________ 实验地点：_____________ 实验人：__________________ 1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。
外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。
免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。
红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。
是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。
2实验材料：1）健康小鼠2）手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3）70汇醇4）PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK5）0.2%台盼蓝6）细胞计数板、计数器7）离心机8）显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。
用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。
3.2制备单个核细胞悬液将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。
吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min, 弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min,以破坏红细胞。
然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。
弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
3.3 计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324X 104X 10=3.24 X 107/ml3.4 计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16 个，计算细胞活力为：324- 16/324 X 100%=95.1%在理论范围之内4 实验结果4.1 研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
NK细胞表面标志
人类细胞表面标志主要以 CD16、CD56来 认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴 细胞认定为NK细胞。
流式细胞术(FCM)
流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微 粒（如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光 与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新 技术结合，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。
以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体 即可制成免疫磁性微珠。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。 基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FAC： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
（二）制备单个核细胞悬液：
1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液(10ml)的平皿中，然后再 置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指 套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液置于15ml离心管中，再取5mlPBS冲 洗培养皿后移入15ml离心管。以1500rpm离心5min。弃 去上清，轻轻弹散细胞沉淀,加红细胞裂解液ACK至2-3ml ，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加 PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；
小鼠脾脏单个核细胞分离
-
特异性 敏感性
优点
缺点
细胞生物 低 学方法 免疫学方 高 法
分子生物 高 学方法
高
可确定活 性
易操作， 可大量检 测 既可定量 又可定位
繁琐费时 不能确定是 否有活性
不能反映浓 度和活性
较高
高
小鼠脾单个核细胞的分离—密度梯度离心法
原理 根据物理学中颗粒沉降原理，不同密度的物质颗 粒在其沉降运动中可因其比重的差别而处于不同 的分布位置。利用此原理可设计一定密度的液体 界面，将各种不同密度的细胞通过离心沉降而达 到使其彼此分离的目的。已知小鼠淋巴细胞和单 核细胞的密度大约在1.088之间，而红细胞与粒细 胞 的 密 度 均 大 于 1.088 。 因 此 ， 若 用 密 度 为 1.088±0.001 的分离液则可通过密度梯度离心方 法，在分离液界面上收集单个核细胞。
T:表达CD2(SRBC受体） B:不表达CD2
免疫细胞功能检测
淋巴细胞转化试验
细胞毒试验
细胞因子检测 溶血空斑实验
T
PHA, ConA,PWM
或Ag
形态学观察Lc 与淋巴母细胞 的比值
3H-TdR掺入法测cpm值
细胞因子检测
细胞生物学方法: CK细胞敏感株
密度梯度离心法
聚蔗糖—泛影葡胺 Ficoll-Hypaque: 1.088±0.001
LC, M :1.088 RBC, 粒细胞：>1.092
在1ml小鼠脾脏细胞悬液混匀，然后用滴管沿盛有 2ml淋巴 细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液面上。 将该试管置水平式离心机中离心（1800rpm）15分钟。 用滴管小心地直接插入白色絮状的细胞层（含单个核细 胞），吸出界面层细胞，移入另一试管内。 在该细胞收集管内加入生理盐水，用滴管轻轻上下冲洗混 匀，然后在离心（1000rpm）10分钟，弃去上清液，将沉 淀细胞充分摇匀，再用生理盐水离心洗涤1次。 用0.3ml生理盐水（约6滴）将沉淀细胞稀释，摇匀。 取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分 混匀，用计数板在显微镜下计数，计算单个核细胞浓度 （个/ml）。 检查细胞活力：取细胞悬液一滴加入等量锥兰溶液于另一 试管中充分混匀，用载玻片在显微镜下计数100~200个单 个核细胞中着色的死细胞数
4 脾脏单个核细胞分离及流式细胞术染色(1)(1)
• 3．急性大失血法：用粗针头一次采取大量心脏血液，可使动物致死。 • 4．吸入麻醉致死法：应用乙醚吸入麻醉的方法处死。大、小鼠在20～30秒
3.清洗：加500ulPBS,吹打混匀后， 5000rpm， 4℃，5min
4.检测：小心用枪去除上清，再加入500ul PBS吹打混匀，置于冰上， 流式细胞仪检测
CD3： T cell CD4+ T cell； CD8+ T cell
补充知识
通常分离细胞是为了下一步实验。有些实验如需要对细 胞作进一步培养，则在分离细胞时一定要严格无菌操作。
在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他 细胞。
计数完毕后请立即清洗细胞计数板！
思考题
1.实验过程中注意问题有哪些？
实验小鼠处死方法
• 1．颈椎脱臼法：是大、小鼠最常用的处死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱日，造成脊髓 与脑髓断离，动物立即死亡。
实验四
小鼠脾脏单个核细胞分离及 流式细胞术染色
钱国军 邹本坤 2016-03-31
解剖图
小鼠脾脏位于上腹部左后侧， 体积较大，长条形，属于外 周免疫器官。外周血中淋巴 细胞可经再循环驻入脾脏等 外周免疫器官的特定区域， 所以富含各类免疫细胞。
实验原理
细胞计数
3mm
W1
W2
W3
4 脾脏单个核细胞分离及流式细胞术染色(1)
lived dead
实验材料：
小鼠 手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶 平皿，尼龙膜指套、研磨棒
PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）
细胞计数板 0.2%台盼蓝染液 显微镜（关掉之前，请把光度调到最小！！）
实验步骤
（一）取小鼠脾脏：
小鼠颈椎脱位处死（注意安全）； 用75%酒精喷小鼠腹部，使其皮毛沾湿。用剪刀，剪开皮肤 暴露腹腔，再找到脾脏，劲量剪除脾脏周围组织；
• • • •
实验小鼠处死方法
• 1．颈椎脱臼法：是大、小鼠最常用的处死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱日，造成脊髓 与脑髓断离，动物立即死亡。
注意： 细胞总数和细胞活力可以一起做 细胞总数=视野内活细胞数+死细胞数 细胞活力=活细胞数/总数x100%
1.颈椎脱臼处死小鼠：用拇指和食指用力往下按住鼠头，另一只手抓住 鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离 2.摘取脾脏：用75%酒精喷小鼠腹部，使其皮毛沾湿。用剪刀，剪开皮 肤暴露腹腔，再找到脾脏，尽量剪除脾脏周围组织 3.研磨脾脏：在培养皿中加入3mlPBS，将脾脏放入过滤网制成的指套中， 再放入培养皿中，用注射器的活塞棒或研棒将脾脏研碎。将含有脾脏细 胞的PBS移入15ml离心管。再取3mlPBS冲洗培养皿后移入15ml离心管。
（三）计算细胞浓度
将上述细胞悬液做一定倍数（10倍左右）的稀释（小鼠脾 脏细胞一般为1x107-2x108）； 混匀稀释后，取10uL加至细胞计数板中(不要有气泡），计 数细胞计数板中4大方格细胞总数； 计算细胞总数：
细胞浓度=4个大方格细胞总数/4*104*稀释倍数。
细胞总数=细胞浓度x细胞悬液的体积
复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数
小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：实验地点：实验人：1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。
外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。
免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。
红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。
是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。
2实验材料：1)健康小鼠2)手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3)70%乙醇4)PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）5)0.2%台盼蓝6)细胞计数板、计数器7)离心机8)显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏●将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。
●用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。
3.2制备单个核细胞悬液●将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。
●吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min，弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min，以破坏红细胞。
然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。
●弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
3.3计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324×104×10=3.24×107/ml3.4计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16个，计算细胞活力为：324-16/324×100%=95.1%在理论范围之内4实验结果4.1研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。
实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。
脾淋巴细胞分离
小鼠脾脏单个核细胞的分离一、实验目的1. 熟悉细胞分离的基本原理2. 掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法3. 掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法二、实验原理1.台盼蓝染色：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。
丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。
通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。
2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官。
人的脾脏位于左季肋区的后外侧部，呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。
三、实验材料小鼠手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板平皿，尼龙膜指套、研磨棒、吸管、试管、EP管、移液器和tipsPBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）细胞计数板0.2%台盼蓝染液8.显微镜四、实验步骤（一）取小鼠脾脏1.小鼠颈椎脱位处死——用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。
2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织。
（二）制备单个核细胞悬液：1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。
用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。
弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。
然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；3.弃去上清，弹散细胞沉淀，加PBS缓冲液至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
(放置冰上)4.取100uL至EP管中，进行计数和活力测定（建议5倍稀释）5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力（三）计算细胞浓度1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。
脾脏单个核细胞的制备
脾脏单个核细胞的制备: 将5 只小鼠断颈椎处死, 无菌取出脾脏, 分别剪碎, 置200 目无菌尼龙网上, 分次滴入4~ 5 ml RP MI1640 培养液, 轻轻研磨脾脏, 直到脾脏变白; 收集细胞悬液( 由于红细胞所占比例很低且对实验影响不大, 故无需作红细胞裂解处理) , 1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5 min, 弃上清; 加入2 ml pH7. 4 的PBS, 混匀后1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5min, 弃上清; 加入4 ml RPMI1640 培养液, 混匀, 用RPMI1640 培养液稀释200 倍后滴加在细胞计数板上进行细胞计数, 根据计数结果用RPMI1640 将细胞悬液调成2 × 106 / 300 µl 的浓度。
《流式细胞术检测小鼠脾细胞内细胞因子刺激方案的筛选》单细胞悬液的制备：将大鼠颈椎脱位处死后, 置70%乙醇中浸泡5 m in, 无菌取出脾脏和胸腺置于平皿中, 除掉结缔组织, 用生理盐水清洗3次。
加入2 mL RPM I- 1640完全培养液, 用剪刀分别将脾和胸腺剪成1 mm 1 mm 1 mm 碎块后, 用毛玻片轻柔研磨组织碎片, 经8层纱布过滤制成单细胞悬液, 经H anks液离心洗涤后, 将细胞悬浮于含10% 小牛血清的RPM I- 1640 培养液。
台盼蓝染色, 计数活细胞在95%以上, 调整细胞数至5×1010 cells /L。
《粗江蓠多糖对大鼠淋巴细胞周期的影响》制备脾细胞悬液脾淋巴细胞的获取:手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等手术器械,300 目尼龙网等须经消毒处理; 以颈椎脱臼法处死小鼠, 用7 5 % 乙醇浸泡小鼠10-15min 。
沿腹腔中线剪开小鼠胸腔, 取出脾脏置于培养皿中, 剪去脂肪和筋膜组织, 用R PMI-1640培养液漂洗。
粗剪成小块, 用注射器芯轻轻挤压, 加人基础培养液, 混悬, 用300目尼龙网过滤到玻璃离心管中, 再加人基础培养液冲洗网上剩余组织细胞。
细胞分离实验
视频3.2 研磨法分离小鼠脾脏单个核细胞同学们好！组织由细胞和细胞间质组成，利用研磨或酶解组织的方法可使其中细胞游离。
研磨法主要用于结构相对疏松的脾脏、肝脏、垂体、胎盘等动物组织。
研磨工具有注射器内芯、载玻片、盖玻片等，以注射器内芯最为常用。
实验原理：单个核细胞是指外周血和免疫器官中具有单个核的细胞，主要包括单核细胞和淋巴细胞等密度相近的几种免疫细胞。
脾脏是重要的外周免疫器官，富含单个核细胞，同时含有大量红细胞。
研磨脾脏可使其中细胞游离，裂解法除去红细胞后即可获得单个核细胞为主的细胞悬液。
实验材料及用品：6~8周龄健康小白鼠；超净工作台及配套用品（酒精灯、酒精棉球缸、试管架、火柴、记号笔、废物缸、废液缸等）；灭菌的2mL玻璃注射器内芯、200目细胞滤网、10mL聚丙烯离心管、眼科剪、尖头镊子、5mL一次性注射器、一次性6cm平皿、一次性9cm平皿、1mL微量加样器、枪头、一次性吸管、EP管、D-Hanks液、0.83%的氯化铵溶液；10mL低速离心机；托盘天平；40mL小烧杯；水浴锅；不锈钢棉球缸；75%酒精；0.4%台盼蓝生理盐水染液。
实验操作环节主要有：小鼠处死——小鼠消毒——剖取脾脏——研磨游离脾脏细胞——离心收集脾脏细胞——裂解红细胞——收集单个核细胞——台盼蓝染色——镜检细胞活率具体操作步骤如下：1、小鼠处死：用脱颈法处死小鼠。
2、小鼠消毒：将小鼠放入不锈钢棉球缸中，向其中加入75%酒精至覆盖小鼠，消毒3~5min。
3、剖取脾脏：将装有小鼠的不锈钢棉球缸用酒精棉球擦拭消毒后转入超净工作台；吸取5mL D-Hanks液，注入6cm平皿中；再吸取5mL D-Hanks液，放置备用；取出已消毒的眼科剪和镊子，将小鼠转入9cm平皿中，使其腹部朝上；沿腹中线剪开小鼠腹部皮肤和腹膜；用手将腹部皮肤和腹膜向左右两侧拉开，使腹部内脏暴露；将小鼠腹部左侧肠道向右上方向翻开，暴露暗红色长条状脾脏；剪开与脾脏连接的组织，将脾脏放入D-Hanks液。
(完整word)脾淋巴细胞分离
小鼠脾脏单个核细胞的分离一、实验目的1。
熟悉细胞分离的基本原理2。
掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法3。
掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法二、实验原理1.台盼蓝染色：正常的活细胞,胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。
丧失活性或细胞膜不完整的细胞,胞膜的通透性增加,可被台盼蓝染成蓝色。
通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。
2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官.人的脾脏位于左季肋区的后外侧部,呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器,能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。
三、实验材料小鼠手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板平皿，尼龙膜指套、研磨棒、吸管、试管、EP管、移液器和tipsPBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）细胞计数板0。
2%台盼蓝染液8。
显微镜四、实验步骤（一）取小鼠脾脏1.小鼠颈椎脱位处死-—用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉,使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。
2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤,剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织.（二）制备单个核细胞悬液：1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。
用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中;2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。
弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。
然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；3.弃去上清，弹散细胞沉淀,加PBS缓冲液至2ml,吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
(放置冰上）4.取100uL至EP管中,进行计数和活力测定（建议5倍稀释)5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力（三）计算细胞浓度1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。
%94 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离
26
计数池
正面观
支持堤
侧面观
1mm 支持堤 支持堤 计数池 缝隙） （0.1mm缝隙） 缝隙
27
计数时需要遵循一定的方向逐格进行，以免重复或遗漏，对 压线细胞采用数左不数右，数上不数下 数左不数右， 数左不数右 数上不数下的原则
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细胞数量明显增大时可适当加大稀释倍数。 细胞数量明显增大时可适当加大稀释倍数。 充池时要一次完成，不能产生满溢 满溢、 充池时要一次完成，不能产生满溢、气泡 或充池不足的现象 的现象。 或充池不足的现象。 大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数 大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数 的原则， 数左不数右的原则 避免多数或漏数。 下、数左不数右的原则，避免多数或漏数。
取脾脏
24
实验步骤： 实验步骤：
制备单个核细胞悬液： （二）制备单个核细胞悬液： 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液的平皿 盛有PBS缓冲液的平皿中 然后再置于尼龙指 1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指 针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中 使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中； 套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中； 离心10min 吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管中， 1500rpm离心10min。 2. 吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管中，以1500rpm离心10min。 弃去上清， ACK至2~3ml，轻轻吹打混匀并放置3~4min， 放置3~4min 弃去上清，加ACK至2~3ml，轻轻吹打混匀并放置3~4min，以破坏 红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml PBS缓冲液至10ml， 1500rpm离心10min； 离心10min 红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min； 弃去上清， PBS缓冲液至10ml， 1500rpm离心10min； 缓冲液至10ml 离心10min 3. 弃去上清，加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min； 弃去上清， PBS缓冲液至10ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核 缓冲液至10ml 4. 弃去上清，加PBS缓冲液至10ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核 细胞悬液。 细胞悬液。
小鼠脾单个核细胞的分离-20141113硕士班
器 材
（1）水平式离心机
（2）显微镜
（3）血球计数板、血盖片
（4）一次性试管、滴管 （5）擦镜纸、卷筒纸、镊子
试 剂：
（1）小鼠脾脏细胞悬液
（2）淋巴细胞分离液（市售，比重：1.088±0.001）
（3）生理盐水
（4）白细胞稀释液 （5）0.4%锥兰生理盐水溶液
操作步骤
将1ml小鼠脾细胞悬液混匀，用滴管沿盛有2ml淋巴细胞分离液的 试管壁轻轻铺于分离液面上 ↓ 将该试管置水平式离心机中离心（2000rpm）15 min ↓ 用滴管小心地直接插入白色絮状的细胞层（含单个核细胞）， 吸出界面层细胞，移入另一离心管内 ↓ 加入足量生理盐水，用滴管轻轻上下冲洗混匀 ↓ 离心（1000rpm）10 min ↓ 弃去上清液，将沉淀细胞充分摇匀，加生理盐水，洗涤 1 次 ↓ 离心（1000rpm）10 min ↓ 弃去上清液，将沉淀细胞充分摇匀 ↓ 用生理盐水将沉淀细胞稀释至0.3ml(约6滴），摇匀 ↓ 取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分混匀，用计数板在显微镜下计数， 计算出白细胞总数（/ml）
×10×2×103 个/ml
15
1. 细胞数量明显增大时可适当加大稀释倍数。 2. 充池时要一次完成，不能产生满溢、气泡或充池不足的现象。
3. 大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数下、数左不数右的原则，
避免多数或漏数。
1.
红细胞计数时，如果每个中方格之间相差超过20个以上，要重新充池
计数。正常数值范围内，两次红细胞计数相差不得超过5%
3. 加入脾细胞悬液时应十分小心，注意保护分离液的界面，勿使混淆
影响分离效果；
4. 每个吸取细胞悬液的步骤，均要混匀细胞； 5. 做细胞活力检查时，锥兰染色后应尽快计数完毕，时间过长则细胞
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E花环分离法
（纯化T细胞）
T细胞表面的CD2分子－绵羊红细胞受体（E受体）
尼龙纤维分离法
B细胞和单核细 胞具有易粘附特性， 将淋巴细胞悬液加 到尼龙纤维上， 37℃作用1－2小时 后，洗脱的为非粘 附性T细胞。
PBMC
B细胞 单核细胞
尼龙纤维 毛柱
T细胞
流式细胞术
（Flow Cytometry，FCM）
一 、 T细 胞 增 殖 试 验
1. 形态学检查
T细胞增殖试验 原毒的行正理刺分常素激裂：）人后的T、转细能淋非化胞转巴率特体化为母异（外为细7性形0受体％胞有态特积左，丝学异较右以分示性大。此裂意抗、测原原图代定（物）谢T如质细旺P（胞盛HA的如、、功细且C能菌能on类进。A） 4P8H~A72刺小激时
NOTE：尽量少吸分层液；
6、每管加 PBS 到1ml，重悬细胞，3000转离心5分钟。
7、计数：吸弃上清，用100ml PBS重悬细胞，取出20ml加入新 的EP管中，再加入20ml细胞计数液，混匀后取出10ml，加到 计数板内，显微镜下计数。
细胞计数方法
4
查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的平均细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y×104×稀释倍数
2.
3 H-TdR掺 入 法 T细胞增殖试验 原激胞养腺DD淋素NN活巴经进理液嘧AAβ后入细：中中啶的，胞-S淋加，液核原期进对巴入根体苷，料入刺细据闪3H细(被（细激T胞同烁标胞d摄胞物3位仪被RH记合入)周的素检-有，的T成期应细掺测d丝则DDR进答入胞。N分N掺3H行水A细A，裂入合-明有平胞T原掺法成d显丝。的RC入）原分掺增量o新n作料加裂入则A合为或脱，的，可成合P当同在氧推H细位的培成测胸A
FCM将免疫荧光技术应用于流式细 胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受 体）进行快速、精确的分析和自动检测， 并将不同类型的细胞分选收集。FCM还 可 对 同 一 细 胞 的 多 种 参 数 （ 如 DNA 、 RNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息 分析，是当代生命科学研究领域中广泛 使用的一项新技术。
根据实验目的不同，采用不同方法，主要需考 虑(1)细胞纯度；(2)细胞获得量；(3)细胞活力；
Ficoll密度梯度离心法
常用来分离单个核细胞的分层液：比重是 1.077左右的聚 蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)分层液。
红细胞、粒细胞比重大(1.092)，离心后沉于管底；淋巴 细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重(1.070)， 离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞， 就可从外周血/组织液中分离到单个核细胞。
3. MTT法
四 甲基（偶MT氮T 唑 ） 盐法 转 M分 于 胞T细 增 化 解T胞 殖 淋 ， ， MT内 程 巴在 活T或 度 细细 产细成细 胞生 胞胞胞 正被蓝 线培周 相有色 粒关养围丝甲 体。终，分臜 内形止（裂的成前F原琥o甲数r等珀m臜小激的 酸az时 a活量 脱n 加)沉发与 氢入积生细 酶
流式细胞仪工作原理
免疫磁珠分离术
1. 直接法：
抗细胞表面分子抗体+磁性微球
免疫磁珠+细胞悬液 强磁场
与免疫磁珠结合的细胞
2. 间接法：
第二抗体+磁性微粒 第一抗体+细胞
磁场 特定细胞
淋巴细胞分离及检测技术
淋巴细胞的分离 淋巴细胞的功能测定技术
淋巴细胞的功能测定技术
一、体外法 1. 淋巴细胞增殖试验 2. 酶联免疫斑点法 3. 细胞毒试验
2013级五年制本科生 免疫学实验课
基础医学院免疫学系
小鼠脾脏单个核细胞的 分离
实验内容
小鼠脾脏单个核细胞的分离（实验） 淋巴细胞分离及检测技术（讲解）
实验目的
掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离及淋转的 原理和方法
熟悉淋巴细胞的检测技术
细胞分离纯化的目的
测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或 组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细 胞、粒细胞等。
淋巴细胞分离及检测技术
红细胞
巨噬细胞
淋巴细胞
DC细胞
淋巴细胞分离及检测技术
淋巴细胞的分离 淋巴细胞的功能测定技术
淋巴细胞分离
一、外周血单个核细胞的分离 淋巴细胞分离液密度梯度离心法
二、淋巴细胞亚群的分离及鉴定 1. E花环分离法 2. 尼龙纤维分离法 3. 流式细胞术 4. 磁珠分离术
本次课分离小鼠脾脏单个核细胞
Ficoll密度梯度离心法
脾细胞 悬液
培养液
Ficoll
实验材料
分组：两人一组， 每组一只小鼠
器材
数量 试剂及动物
数量
滴管 EP管 计数板 1ml加样器(tip) 20ul加样器(tip) 滴管
1支/2人 3个/2人 1块/2人 1把/4人 1把/4人 1支/2人
分层液
镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用 1000µl加样器隔着纱布将细胞悬液吸出，放入1.5ml EP管中， 做好标记。 3 、加样：吸取2ml细胞悬液沿试管壁缓慢加至分层液顶部(距
1cm处) NOTE：不要打破细胞悬液与分层液的界面；
4、1800 转，室温离心 30 分钟； 5、用毛细管插入液面下，尽量吸取白色毛玻璃层，放入EP管中；
二、B细胞增殖试验
B细胞 增殖试 验 原 液 养 Td结 ， 中R束 不 对 加 掺溶 入 入前 T细性 不 法胞2溶 检2S小无P性 测A时刺是S加 B激P人 细A入作胞B，细用的3H混胞。增-匀 T的在殖d培高R淋程，养效巴度采促3天细。用分，胞裂培 3H悬-
二、体内法
淋巴细胞增殖试验
淋 巴细胞增 殖试验 原 增 胞 能 tran的 。加 ，sf作淋o， 称 此r巴m用 同 淋 实a下 验细t时 巴io，胞细 细 可n细在胞 胞 测te胞有s定t形 转)内丝. 态 化 淋核分转 试 巴酸裂化 验 细和原为 胞蛋或(l原 的y白特mp质异始 应h合性母 答o c成抗细 功yte
1ml/2人
PBS
1瓶/4人
计数液
1瓶/室
RPMI1640（无血清）100ml/室
RPMI1640(5%NCS) 100ml/室
平皿（含纱布块 ）1套/4人
剪刀、镊子
1套/4人
显微镜Βιβλιοθήκη 1台/4人实验步骤
1、处死小鼠，取 4 ml 无血清RMPI 1640 培养液放入平皿中。 2、取出脾脏放到平皿中，将3-4层纱布覆盖到组织上，用直头