小鼠脾脏中分离淋巴细胞
小鼠脾脏中分离淋巴细胞
从小鼠脾脏平分别淋巴细胞
１小鼠断颈处逝世,酒精浸泡５分钟,超净台内打开左侧腹部皮肤,当心分别皮下组织和腹部肌肉吐露出脾脏,提起,剪去四周结缔组织,放入有PBS的小瓶中.无菌镊子夹碎,挤压脾脏,将获得的细胞悬液移入无菌试管中.２另取无菌试管,先参加淋巴细胞分别液,然后将试管竖直,略放平,汲取方才制备的细胞悬液迟缓的参加试管中,一般分别液和细胞悬液的体积比为１：２,要轻要慢,不冲要破了淋巴细胞分别液和细胞悬液的界面.选用合适本身分别目标细胞的离心力和时光进行离心.小我用1500转/分钟,20分钟.３离心后掏出试管,可以看到不合的分层,一般上面长短细胞成分和细胞碎片,接下来是单个核细胞,再往下是红细胞等.吸走上层非细胞层弃之,吸出单个核层在别的无菌试管中,因为淋巴细胞分别液对细胞有毒性感化,参加PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟,10分钟）.４,洗好的细胞参加１６４０造就液和２０％的血清中重悬,迟缓参加已经制备好的尼龙毛柱子中,封好,放３７度孵育一小时.一小时后掏出,超净台内将柱子立起,针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号打针器做的）,以HANKS液和血清先后迟缓冲洗,巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来,B细胞也相对吸附冲洗下来的不久不多,所以冲洗来的大多是T细胞,纯度可打到８０％到９０％,再次冲洗并且用力挤压,如许得到的就是B细胞.得到的细胞可以以１６４０加血清配制的造就液进一步造就或做它用.但是淋巴细胞分别液得到的细胞只能算是粗分,假如试验请求高最好选用磁珠或
流式分别.。
实验四脾淋巴细胞分离及流式检测 邵
1 2 3
9
10
可重复滤过
超净台下操作全过程 4
5
8 6
7
实验步骤
（二）制备单个核细胞悬液：
塑料漏皿
1. 将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套 中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中， 加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。 弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置34min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离 心5min；
实验步骤
（一）取小鼠脾脏（3人1组） • 小鼠颈椎脱位处死
用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍 向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离
• 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界 处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪 及筋膜组织。
取脾脏
1
2
3
4
5
6
7
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9
可重复滤过
10
（四）计算细胞活力
1. 50μl细胞悬液+ 50μl的0.2% 苔盼兰溶液并混匀；
2. 取一滴显微镜下观察：
如果细胞被染成蓝色，旋转显 微镜微调节钮，细胞无反光， 则为死细胞；而细胞不被染色， 晶莹透亮，旋转显微镜调节钮， 细胞明显反光而且有立体感， 为活细胞；
3. 计算细胞活力：计数100个 细胞中活细胞的百分率，一般 活力应在95%以上。
实验步骤
（三）计算细胞浓度
1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释） 2.混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞总数； 3.计算细胞总数：
提取淋巴细胞实验报告
一、实验目的本实验旨在学习淋巴细胞提取的方法，掌握淋巴细胞的分离、纯化和计数技术，为后续的淋巴细胞功能研究奠定基础。
二、实验原理淋巴细胞是免疫系统中的一种重要细胞，主要存在于血液和淋巴组织中。
本实验采用Ficoll分离液法，根据不同细胞密度的差异，将淋巴细胞从其他细胞中分离出来。
三、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠2. 仪器：离心机、移液器、加样器、离心管、无菌操作台、眼科剪、眼科镊、显微镜、计数板3. 试剂：Ficoll分离液、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、淋巴细胞分离液、75%酒精、无菌生理盐水、10%甲醛固定液四、实验方法1. 小鼠免疫器官分离（1）将小鼠麻醉后，固定在手术台上；（2）用眼科剪剪开小鼠的腹部皮肤，暴露出腹腔；（3）用眼科镊取出小鼠的脾脏，放入装有PBS的无菌皿中；（4）用眼科剪将脾脏剪成小块，放入装有PBS的无菌皿中；（5）用无菌生理盐水冲洗脾脏，去除杂质；（6）将脾脏组织转移至新的无菌皿中，加入淋巴细胞分离液；（7）用移液器将淋巴细胞分离液和脾脏组织充分混合；（8）将混合液转移到离心管中，以1000rpm离心10分钟；（9）弃去上清液，保留沉淀物。
2. 淋巴细胞分离（1）将沉淀物加入适量的淋巴细胞分离液，轻轻混合；（2）将混合液转移到新的离心管中，以1000rpm离心10分钟；（3）弃去上清液，保留沉淀物。
3. 淋巴细胞计数（1）将沉淀物加入适量的PBS，轻轻混合；（2）将混合液转移到计数板上，在显微镜下观察；（3）按照计数板上的网格进行细胞计数。
4. 淋巴细胞纯度鉴定（1）将计数后的淋巴细胞加入适量的10%甲醛固定液，固定10分钟；（2）用PBS洗涤固定后的淋巴细胞，去除甲醛；（3）将淋巴细胞加入适量的细胞染色剂，染色30分钟；（4）用PBS洗涤染色后的淋巴细胞，去除染色剂；（5）将淋巴细胞转移到离心管中，以1000rpm离心5分钟；（6）弃去上清液，保留沉淀物；（7）将沉淀物加入适量的PBS，轻轻混合；（8）用移液器将混合液转移到计数板上，在显微镜下观察淋巴细胞形态，判断淋巴细胞纯度。
小鼠淋巴细胞增殖测定步骤
小鼠淋巴细胞增殖测定步骤
小鼠淋巴细胞增殖测定是用来评估免疫功能和细胞毒性的常用方法。
以下是一般的小鼠淋巴细胞增殖测定的步骤：
1. 准备小鼠：选择合适的小鼠品系和年龄，并确保小鼠健康。
2. 分离淋巴细胞：采集小鼠淋巴组织（例如脾脏或淋巴结）并进行细胞分离。
常用的方法包括机械破碎和离心分离。
3. 细胞计数与稀释：用血细胞计数器或显微镜计数细胞数目，并进行适当的稀释以获得合适的细胞密度。
4. 细胞悬液制备：将分离的淋巴细胞与培养基混合，使细胞悬浮于培养基中。
5. 细胞培养：将细胞悬液移至培养皿中，并在37°C、5% CO2
的条件下培养一段时间。
一般培养24-72小时。
6. 刺激因子处理：在培养皿中添加适当的刺激因子（如细胞激动剂或抗原），以刺激细胞增殖。
7. 溶菌酶处理：在培养结束后，加入溶菌酶等溶解剂，使未被细胞内的放射性同位素取代的DNA释放到培养基中。
8. 获得DNA：收集并离心细胞上清液，将其中的DNA沉淀。
9. 放射性测定：使用放射性技术，如液体闪烁计数器，测量
DNA中的放射性同位素含量。
10. 统计分析：根据放射性同位素的计数，计算细胞增殖水平，并进行统计分析。
这些步骤可以根据具体实验目的和方法的需求进行适当的调整和修改。
脾脏分离淋巴细胞
从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
方法一:
１用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液。
２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。
室温水平离心2000转/分钟，30分钟。
３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。
吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS离心洗两遍（1000转/分钟，10分钟）。
４倾倒上清，用RPMI-1640重悬细胞。
方法二：
用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，2000r/min离心3min，弃上清。
加红细胞裂解液8mL，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细胞完全破碎，2000r/min离心3min，弃上清去除红细胞，Hank’s液洗1-2遍，用RPMI-1640（含10%胎牛血清）重悬细胞。
小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离
“小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离”实验过程
1.培养皿加入纱布，在纱布上滴2ml淋巴细胞分离液。
2.脱颈处死小鼠，在75%酒精中浸泡30s(示意消毒小鼠)。
3.无菌条件下将腹部剪开，脱皮。
(2min)
4.选取小鼠腹部左侧，剪开腹膜，深红色细长组织即脾脏（淋巴细胞组织）
5.用镊子从下方夹取脾脏，，剔除结缔组织和脂肪后，将组织置于滴有小鼠淋巴细胞分离液的纱布上。
6.脾脏用弯头镊子在纱布上研磨至无血色组织后，纱布上加入1ml淋巴细胞分离液，再用移液器吸取研磨的液体，移至1.5ml离心管内。
(3min)
7.离心（1500rpm,3min）留上清，移入新的15ml离心管中，去除红细胞，此时可以取胸腺。
(可以做到这里停止，示意淋巴细胞和免疫器官胸腺)
8.在装有上清的离心管中加入3ml 1640培养基，离心1500rpm，3min，取沉淀，弃上清，重复清洗2次。
（6min）
9.在显微镜下将细胞浓度调为5×106
个/ml备用。
1/ 1。
脾脏淋巴细胞分离方法[精华]
![脾脏淋巴细胞分离方法[精华]](https://img.taocdn.com/s3/m/120f10c029ea81c758f5f61fb7360b4c2e3f2af0.png)
小鼠脾脏淋巴细胞分离方法000000需要提前准备的材料：0000000提前高压灭菌：手术器械，200目尼龙网，0000000除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。
0000000红细胞裂解液，六孔板，培养皿，75%酒精，100ml烧杯，无菌注射器5-10ml，15ml、50ml 离心管，4mlEP管，离心机等。
00000001、配制的percoll工作液：配制15 ml0000000100%percoll液（简称工作液）：13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备用。
0 000002、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml000000070%percoll液（1.090g/ml）：2.1 ml工作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用0000000 60%percoll液（1.077g/ml）：1.8 ml工作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用0000000 50%percoll液（1.067g/ml）：1.5 ml工作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用0000000 40%percoll液（1.050g/ml）：1.2 ml工作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用0000000 30%percoll液（1.043g/ml）：0.9 ml工作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用0000000 20%percoll液（1.031g/ml）：0.6 ml工作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用0000000找一只15ml离心管，从低到高（20% percoll液→70%percoll液）依次装入，装好备用。
0000003、小鼠脾脏细胞分离00000000（1）颈椎脱臼处死小鼠。
75%酒精浸泡10min0000000（2）无菌条件下取出小鼠脾脏，去除筋膜等置于Hanks’ 液中，将脾脏放入2ml离心管中剪碎。
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2. 3.
平皿的口径不能太大，否则尼龙网不能产生有效的弹 力。 镊子在一边夹住尼龙网，防止尼龙网在研磨过程中滑 动。
参考文献：
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 殷玉俊,等.[J]江苏大学学报医学版,2008,18(1):15-18 泰淑红,等.[J]免疫学杂志,2008,24(1):34-37 Juntao Zou, et,al.[J]Journal of the Neurological Sciences,2008,5:003-007 朱 鹏,等.[J]中华微生物学和免疫学杂志,2007,27(11):1046-1049 朱 鹏,等.[J]世界华人消化杂志,2007,15(31):3289-3294 刘 义,等.[J]生殖与避孕,2007,27(11):691-694 张 慧,等.[J]江苏大学学报医学版,2007,13(2):97-101 王晓莲,等.[J]实用老年医学,2007,21(4):240-242
3/4
达科为生物技术有限公司
EZ-SepTM 系列说明书
小鼠淋巴细胞分离
小鼠全脾分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离全脾：取脾，横切约1mm厚放入固定液，作为组化样本，其余组织放入1ml 5% FCS 1640.3.脾淋巴细胞的分离：1)脾脏处理：将脾脏置于200目滤网上，用5mL注射器内芯轻轻研磨，不断向组织上滴加2ml 5% FCS 1640，直至组织内绝大部分细胞被分离，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。
.2)500g，3min，弃上清。
3)红细胞裂解：加入1ml 红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温裂解2分钟至红细胞完全破碎。
4)500g，5min，弃上清。
5)洗涤1次：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。
加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；6)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640的量。
7)加入适量10% FCS 1640调整细胞浓度至1×107/mL，置于4ºC备用。
小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离淋巴结：取腋下，腹股沟，肠系膜淋巴结，其中腋下淋巴结置固定液中送组化，其余淋巴结放入1ml 5% FCS 1640.3.淋巴结淋巴细胞的分离：1)淋巴结处理：将淋巴结漂浮于3ml 5% FCS 1640（玻璃平皿）中，用无菌大镊子紧捏淋巴结，并用5mL注射器内芯轻轻研磨，绝大部分淋巴细胞游离置培养基中，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。
.2)500g，3min，弃上清。
3)洗涤：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。
加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；4)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640 的量。
脾淋巴细胞分离
小鼠脾脏单个核细胞的分离一、实验目的1. 熟悉细胞分离的基本原理2. 掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法3. 掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法二、实验原理1.台盼蓝染色：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。
丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。
通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。
2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官。
人的脾脏位于左季肋区的后外侧部，呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。
三、实验材料小鼠手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板平皿，尼龙膜指套、研磨棒、吸管、试管、EP管、移液器和tipsPBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）细胞计数板0.2%台盼蓝染液8.显微镜四、实验步骤（一）取小鼠脾脏1.小鼠颈椎脱位处死——用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。
2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织。
（二）制备单个核细胞悬液：1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。
用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。
弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。
然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；3.弃去上清，弹散细胞沉淀，加PBS缓冲液至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
(放置冰上)4.取100uL至EP管中，进行计数和活力测定（建议5倍稀释）5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力（三）计算细胞浓度1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。
小鼠淋巴细胞的分离培养
小鼠淋巴细胞的分离培养
一、血液中淋巴细胞的分离：
1在1.5ML离心管中加入淋巴细胞分离液0.7ML；
2眼部采集小鼠的抗凝血，抗凝剂20%.。
3轻轻将血液加入淋巴细胞分离液的表面，立即以2000—2500转/分离心10MIN。
4小心吸取上层细胞，转移至另一1.5ML离心管中,再用HANK’S 悬浮至1.5ML，再离心，去上清，再悬浮，等待分型用。
二、鼠脾脏中淋巴细胞的分离：
1无菌采集鼠的脾脏，且灭菌注射器的弯针头轻轻扎取，尽可能使单个细胞分离，再分别用4层灭菌纱布过滤2次。
2将滤液小心加入淋巴细胞分离液中。
离心。
3 吸取上层淋巴细胞，HANK‘S液洗涤2次（尽可能去除淋巴
细胞分离液）。
4加入1640培养液进行培养。
、
*淋巴细胞分离液不低于全部液体的50%。
抗体生成细胞实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解抗体生成细胞的分离和培养方法。
2. 学习观察和记录抗体生成细胞的形态变化。
3. 掌握抗体生成细胞活性检测的基本技术。
二、实验原理抗体生成细胞是指能够产生抗体的细胞，通常为B淋巴细胞。
在抗原刺激下，B淋巴细胞分化为浆细胞，浆细胞分泌特异性抗体。
本实验通过分离小鼠脾脏中的B淋巴细胞，体外培养并观察其形态变化，以及检测其产生抗体的能力，来研究抗体生成细胞的特性。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠2. 试剂：抗原、抗体、Ficoll分层液、RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、二甲基亚砜（DMSO）、细胞计数板、显微镜等。
四、实验步骤1. 小鼠脾脏细胞分离- 处死小鼠，取出脾脏。
- 将脾脏放入无菌培养皿中，用无菌剪刀剪碎。
- 加入Ficoll分层液，室温静置30分钟。
- 吸取中层细胞，用RPMI-1640培养基洗涤2次。
- 计数细胞，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。
2. 细胞培养- 将细胞悬液加入含10%胎牛血清、青霉素、链霉素的RPMI-1640培养基中。
- 将细胞悬液分装至培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
- 每2天更换一次培养基。
3. 形态观察- 在显微镜下观察细胞形态变化，记录细胞生长情况。
4. 抗体生成细胞活性检测- 收集细胞培养液，离心去上清。
- 将细胞沉淀用RPMI-1640培养基重悬，加入抗原，37℃孵育1小时。
- 加入抗体，37℃孵育30分钟。
- 加入底物，观察颜色变化。
- 记录抗体生成细胞活性。
五、实验结果1. 细胞形态观察- 在培养过程中，细胞逐渐从单层排列变为多层排列，细胞体积增大，形态趋于扁平。
2. 抗体生成细胞活性检测- 加入抗原和抗体后，部分细胞出现颜色变化，说明这些细胞能够产生抗体。
六、实验讨论1. 本实验成功分离和培养了小鼠脾脏中的B淋巴细胞，并观察到了细胞形态的变化。
2. 抗体生成细胞活性检测结果表明，部分细胞能够产生抗体，证实了实验的成功。
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告一、引言淋巴细胞是免疫系统中重要的细胞成分，其在免疫应答和抗体产生中发挥着关键作用。
为了研究淋巴细胞的功能和特性，需要将其从组织中分离出来并进行计数。
本实验旨在通过对小鼠脾脏进行淋巴细胞分离和计数，来获取关于淋巴细胞数量和纯度的信息。
二、材料与方法1. 实验动物：使用C57BL/6小鼠。
2. 仪器与试剂：离心管、离心机、PBS缓冲液、0.83%氯化铵溶液。
3. 实验步骤：A. 准备工作：i. 将离心管预冷至4℃。
ii. 准备PBS缓冲液，并保持在4℃。
B. 小鼠准备：i. 用无菌技术将小鼠安全固定在手术台上。
ii. 使用无菌器械，剪开腹部皮肤和腹壁，暴露脾脏。
iii. 小心取出脾脏并放入含有PBS缓冲液的离心管中。
C. 细胞分离：i. 使用无菌器械，将脾脏组织切碎至细胞悬浮液状态。
ii. 将细胞悬浮液通过70μm滤网过滤，以去除大块组织残渣。
iii. 向过滤后的细胞悬浮液中加入等体积的0.83%氯化铵溶液，进行红细胞溶解。
iv. 用PBS缓冲液洗涤淋巴细胞沉淀，重复此步骤2-3次。
D. 细胞计数：i. 取适量的淋巴细胞悬浮液，加入等体积的尝试涂片溶剂进行稀释。
ii. 在尝试涂片上使用布朗管计数室计数淋巴细胞数量。
三、结果根据实验操作所得数据，我们得到了以下结果：1. 成功分离出小鼠脾脏中的淋巴细胞。
2. 经过红细胞溶解和洗涤步骤后，淋巴细胞沉淀呈现白色悬浮液状态。
3. 在计数室中观察到淋巴细胞的形态特征，如小型、圆形和较大的核。
四、讨论本实验成功地分离出了小鼠脾脏中的淋巴细胞，并通过计数室观察到了其形态特征。
然而，有一些潜在问题需要考虑和改进：1. 纯度问题：尽管我们成功分离出淋巴细胞，但在实验过程中是否存在其他细胞类型的污染仍需进一步验证。
可以通过流式细胞术等技术来评估纯度。
2. 细胞活力：在实验过程中，我们没有对淋巴细胞进行活力测试。
(完整word)脾淋巴细胞分离
小鼠脾脏单个核细胞的分离一、实验目的1。
熟悉细胞分离的基本原理2。
掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法3。
掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法二、实验原理1.台盼蓝染色：正常的活细胞,胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。
丧失活性或细胞膜不完整的细胞,胞膜的通透性增加,可被台盼蓝染成蓝色。
通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。
2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官.人的脾脏位于左季肋区的后外侧部,呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器,能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。
三、实验材料小鼠手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板平皿，尼龙膜指套、研磨棒、吸管、试管、EP管、移液器和tipsPBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）细胞计数板0。
2%台盼蓝染液8。
显微镜四、实验步骤（一）取小鼠脾脏1.小鼠颈椎脱位处死-—用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉,使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。
2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤,剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织.（二）制备单个核细胞悬液：1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。
用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中;2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。
弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。
然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；3.弃去上清，弹散细胞沉淀,加PBS缓冲液至2ml,吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
(放置冰上）4.取100uL至EP管中,进行计数和活力测定（建议5倍稀释)5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力（三）计算细胞浓度1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。
淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞的原理
淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞的原理淋巴细胞分离液是一种常用的实验试剂，用于分离脾淋巴细胞。
通过对淋巴细胞的分离，可以获得纯净的淋巴细胞群体，为后续的实验研究提供了条件。
淋巴细胞是一类免疫细胞，主要存在于淋巴组织和淋巴液中。
淋巴细胞的分离液是一种含有特定成分的溶液，能够有效地分离脾淋巴细胞。
其原理主要包括以下几个步骤：第一步，准备脾组织。
取得小鼠的脾脏，将其置于无菌条件下进行操作。
脾脏是免疫系统的重要器官，其中富含淋巴细胞。
首先将脾脏放入含有冷PBS（磷酸盐缓冲液）的离心管中，并用离心机低速离心，以去除掉其他组织和血管。
第二步，制备单细胞悬浮液。
将脾组织移至无菌的培养皿中，用无菌匀浆棒将组织碾碎。
随后，加入适量的无菌PBS，充分混合，制备出均匀的组织悬浮液。
第三步，加入淋巴细胞分离液。
将淋巴细胞分离液缓慢地滴加到组织悬浮液中，同时轻轻摇动培养皿，使淋巴细胞分离液充分与组织悬浮液混合。
淋巴细胞分离液中的特定成分能够与其他细胞发生作用，使淋巴细胞得以分离。
第四步，离心分离。
将混合液倒入离心管中，用离心机进行高速离心。
离心的目的是通过离心力将淋巴细胞与其他细胞分离开来。
离心结束后，可观察到淋巴细胞沉积在离心管底部，上层液体中则含有其他细胞和杂质。
第五步，收集淋巴细胞。
将上层液体倒掉，只留下沉积的淋巴细胞。
用无菌的PBS洗涤淋巴细胞，去除残留的淋巴细胞分离液和其他杂质。
重复洗涤步骤，可更好地保证淋巴细胞的纯度。
通过以上步骤，我们可以获得高纯度的脾淋巴细胞。
这种分离方法简单易行，操作方便，并且能够得到较为理想的结果。
淋巴细胞的分离液在免疫学和细胞生物学等领域具有广泛的应用价值，为研究淋巴细胞的功能和机制提供了重要的实验手段。
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告1. 引言小鼠脾脏淋巴细胞是免疫系统中重要的组成部分，它们在抵御病原体侵袭和保护机体免受自身免疫疾病侵害中发挥着关键的作用。
因此，为了研究小鼠脾脏淋巴细胞的特性和功能，我们需要将其从脾脏中分离出来并进行计数。
本实验旨在描述小鼠脾脏淋巴细胞的分离与计数方法。
2. 材料与方法2.1 实验材料•小鼠脾脏样品•细胞培养基•消化酶•离心管•细胞计数板•显微镜2.2 实验方法2.2.1 小鼠脾脏样品的获取1.选择适龄的小鼠，以确保其脾脏发育成熟。
2.用消毒工具将小鼠颈部暴露，进行脾脏的解剖。
3.将脾脏置于无菌的容器中，迅速将其转移到实验室。
2.2.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离1.将小鼠脾脏放置在无菌离心管中，并加入足够的细胞培养基。
2.使用搅拌器或离心机将脾脏组织均匀分散于培养基中。
3.加入消化酶，按照说明书中的浓度和时间进行消化。
4.在消化结束后，用细胞培养基冲洗脾脏组织，以去除余留的消化酶。
2.2.3 小鼠脾脏淋巴细胞的计数1.取适量的脾脏细胞悬液，加入细胞计数板中。
2.在显微镜下观察并计数细胞计数板中的淋巴细胞数量。
3. 实验结果3.1 小鼠脾脏样品的获取从适龄的小鼠身上成功解剖出脾脏，并将其转移到实验室。
3.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离经过消化酶的作用，小鼠脾脏细胞成功地被分离并悬浮于培养基中。
3.3 小鼠脾脏淋巴细胞的计数通过显微镜观察，我们计数了细胞计数板中的淋巴细胞数量，并记录了结果。
具体数据如下： 1. 格子1：20个淋巴细胞 2. 格子2：18个淋巴细胞 3. 格子3：22个淋巴细胞 4. 格子4：19个淋巴细胞根据计数结果求平均值，得到平均每格淋巴细胞数目为19.75个。
4. 结论根据我们的实验结果，我们成功地分离出小鼠脾脏淋巴细胞，并进行了有效的计数。
通过计数结果，可以推断小鼠脾脏淋巴细胞的数量在每格约为19.75个左右。
这些实验结果为进一步研究小鼠脾脏淋巴细胞的特性和功能提供了基础数据。
实验二淋巴细胞分离实验
注意事项
1.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢 加，以免冲散界面
2. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过 多的上清液或分层液而导致血小板污染
细胞计数
实验步骤 注意事项
实验步骤
1、准备计数板： 2、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞
悬液 3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
目的 原理 实验步骤 注意事项
目的
熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞 （PBMC）的分离方法
原理
脾脏各种血细胞的密度不尽相同， 利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作 密度梯度离心，使一定比重的细胞 群按相应密度梯度分布，从而将各 种血细胞加以分离。
原理
外周血
红细胞
1.093
粒细胞
单个核细胞 (PBMC) 血小板
淋巴细胞 单核细胞
1.092 1.075~1.090
1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
稀
释
外
周, 30min
Ficoll
Ficoll
稀释的血浆、 血小板 PBMC
红细胞 粒细胞
实验步骤
1.实验一获取的小鼠脾脏载玻片研磨 （研磨同时滴加1640培养液，保持细 胞活性）
细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细 胞悬液， 4、计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数 板四角大方格中的细胞数
实验步骤
5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104
注意事项
1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带
气泡 3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀
脾脏淋巴细胞分离方法
小鼠脾脏淋巴细胞分离方法需要提前准备的材料：提前高压灭菌：手术器械，200目尼龙网，除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。
红细胞裂解液，六孔板，培养皿，75%酒精，100ml烧杯，无菌注射器5-10ml，15ml、50ml 离心管，4mlEP管，离心机等。
1、配制的percoll工作液：配制15 ml100%percoll液（简称工作液）：13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备用。
2、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml70%percoll液（1.090g/ml）：2.1 ml工作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用60%percoll液（1.077g/ml）：1.8 ml工作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用50%percoll液（1.067g/ml）：1.5 ml工作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用40%percoll液（1.050g/ml）：1.2 ml工作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用30%percoll液（1.043g/ml）：0.9 ml工作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用20%percoll液（1.031g/ml）：0.6 ml工作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用找一只15ml离心管，从低到高（20% percoll液→70%percoll液）依次装入，装好备用。
3、小鼠脾脏细胞分离（1）颈椎脱臼处死小鼠。
75%酒精浸泡10min（2）无菌条件下取出小鼠脾脏，去除筋膜等置于Hanks’ 液中，将脾脏放入2ml离心管中剪碎。
（3）将200目尼龙网置于六孔板上，用注射器头研磨，过程中不停加Hanks’ 液冲洗。
（4）收集脾细胞悬液置于离心管中，1500rpm 10min，弃上清。
（5）加10ml？红细胞裂解液混悬沉淀，室温静置10min，再1500rpm 10min（6）洗三遍，1500rpm 5min，离心去上清（7）加入2ml 0.85%Nacl溶液混悬沉淀。
小鼠脾脏实验报告
一、实验目的1. 掌握小鼠脾脏的解剖学位置和结构。
2. 学习脾脏细胞分离、培养和计数的方法。
3. 掌握细胞染色、观察和计数的技巧。
4. 了解脾脏细胞在免疫学中的重要作用。
二、实验原理脾脏是机体重要的免疫器官之一，主要负责滤血、产生抗体和清除衰老、异常红细胞等功能。
脾脏中含有丰富的淋巴细胞，如B细胞、T细胞和巨噬细胞等，是研究免疫学的重要模型。
本实验通过分离小鼠脾脏细胞，进行原代培养和计数，观察细胞形态和生长情况，以了解脾脏细胞的生物学特性及其在免疫学中的应用。
三、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠。
2. 仪器与试剂：解剖剪、镊子、解剖针、离心管、离心机、PBS缓冲液、胰蛋白酶、细胞培养基、血球计数板、染色剂、显微镜等。
四、实验方法1. 解剖小鼠：处死小鼠后，打开腹腔，分离脾脏。
2. 脾脏细胞分离：将脾脏组织放入PBS缓冲液中，用解剖剪剪碎组织，加入胰蛋白酶消化酶，37℃消化30分钟。
3. 细胞培养：消化后的细胞用PBS缓冲液洗涤，加入细胞培养基，调整细胞密度，进行原代培养。
4. 细胞计数：采用血球计数板对培养细胞进行计数，观察细胞生长情况。
5. 细胞染色：采用染色剂对细胞进行染色，观察细胞形态和活力。
6. 显微镜观察：用显微镜观察细胞形态、生长情况和染色效果。
五、实验结果1. 脾脏细胞分离：成功分离出小鼠脾脏细胞，细胞形态呈圆形或椭圆形，细胞密度约为1×10^6个/mL。
2. 细胞培养：细胞在培养过程中生长良好，呈单层生长，细胞形态正常。
3. 细胞计数：培养细胞密度逐渐增加，生长曲线呈指数增长。
4. 细胞染色：细胞染色效果良好，细胞核染色深，细胞质染色浅，细胞活力较高。
5. 显微镜观察：细胞形态正常，生长旺盛，无明显病变。
六、实验讨论1. 脾脏是机体重要的免疫器官，含有丰富的淋巴细胞，在免疫学研究中具有重要意义。
2. 本实验成功分离出小鼠脾脏细胞，并进行原代培养和计数，为后续研究提供了良好的实验材料。
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小鼠脾脏中分离淋巴细
胞
Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】
从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
１小鼠断颈处死，酒精浸泡５分钟，超净台内打开左侧腹部皮肤，小心分离皮下组织和腹部肌肉暴露出脾脏，提起，剪去周围结缔组织，放入有PBS的小瓶中。
无菌镊子夹碎，挤压脾脏，将获得的细胞悬液移入无菌试管中。
２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。
选用适合自己分离目的细胞的离心力和时间进行离心。
个人用1500转/分钟，20分钟。
３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。
吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟，10分钟）。
４，洗好的细胞加入１６４０培养液和２０％的血清中重悬，缓慢加入已经制备好的尼龙毛柱子中，封好，放３７度孵育一小时。
一小时后取出，超净台内将柱子立起，针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号注射器做的），以HANKS液和血清先后缓慢冲洗，巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来，B细胞也相对吸附冲洗下来的不多，所以冲洗来的大多是T细胞，纯度可打到８０％到９０％，再次冲洗并且用力挤压，这样得到的就是B细胞。
得到的细胞可以以１６４０加血清配制的培养液进一步培
养或做它用。
但是淋巴细胞分离液得到的细胞只能算是粗分，如果实验要求高最好选用磁珠或流式分离。