流式细胞分析和混合淋巴细胞反应实验中小鼠脾脏的摘取(图文解说)
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
正确抓取小鼠并处死
颈椎脱臼处死小鼠：用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉 ，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离
实验步骤：
（一）取小鼠脾脏： 小鼠颈椎脱位处死，置70%乙醇溶
液中浸泡3-5min； 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交
界处皮肤，取脾脏并尽量将去脂肪 及筋膜组织。
（二）制备单个核细胞悬液：
1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液(10ml)的平皿中，然后再 置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指 套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液置于15ml离心管中，再取5mlPBS冲 洗培养皿后移入15ml离心管。以1500rpm离心5min。弃 去上清，轻轻弹散细胞沉淀,加红细胞裂解液ACK至2-3ml ，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加 PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；
上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致 敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。
密度梯度离心法
Ficoll-Hypaque密度梯度离心法：人外周血单个核细 胞(peripheral blood mononuclear cell PBMC)包 括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细 胞不同，利用密度在1.077±0.001g/L之间近于等渗的 Ficoll-Hypaque混合溶液(称为淋巴细胞分层液)作密 度梯度离心时,•各种血液成分将按密度梯度重新分布聚 集。
当脾功能亢进时可破坏大量血小板及血细胞。脾有丰富 的血窦，可储存一定量（约200毫升）的血液，在机体 剧烈运动或爬山或突然失血时，脾的平滑肌收缩，放出 储存血液以补充机体的需要。
胸腺（thymus）
脾切实验报告
一、实验目的1. 了解脾脏在免疫系统中的作用。
2. 掌握脾切除手术的操作步骤及注意事项。
3. 观察脾切除后动物生理变化，分析脾脏对机体的影响。
二、实验原理脾脏是人体最大的淋巴器官，具有过滤血液、清除病原体、产生抗体和调节免疫反应等作用。
脾切除实验可以模拟脾脏缺失的状态，研究脾脏在免疫系统中的作用。
三、实验材料与仪器1. 实验动物：小白鼠2. 仪器：手术刀、手术剪、手术钳、镊子、剪刀、注射器、生理盐水、消毒液等3. 药品：肝素、抗生素等四、实验步骤1. 动物麻醉：使用肝素进行动物麻醉，确保实验过程安全。
2. 脾脏暴露：沿腹中线切开皮肤，暴露腹壁肌肉，分离肌肉组织，暴露腹腔。
3. 脾脏游离：用手术剪和手术钳分离脾脏周围组织，使脾脏与周围器官分离。
4. 脾脏切除：用手术剪将脾脏与脾蒂分离，用手术钳夹住脾蒂，切断脾蒂，取出脾脏。
5. 缝合创口：用生理盐水清洗创面，用消毒液消毒，用可吸收线缝合腹壁肌肉和皮肤。
6. 抗生素预防感染：术后给予抗生素预防感染。
五、实验观察与结果1. 术后观察：观察动物的精神状态、活动能力、饮食、呼吸等生理指标。
2. 实验结果分析：（1）术后初期，动物出现食欲不振、精神萎靡、活动能力下降等症状。
（2）术后第3天，动物开始恢复食欲，精神状态好转，活动能力逐渐恢复。
（3）实验过程中，未发现动物出现严重并发症。
六、实验讨论1. 脾脏在免疫系统中的作用：脾脏是人体最大的淋巴器官，具有过滤血液、清除病原体、产生抗体和调节免疫反应等作用。
脾切除实验表明，脾脏在机体免疫系统中具有重要作用。
2. 脾切除后的生理变化：脾切除后，动物出现食欲不振、精神萎靡、活动能力下降等症状。
这是因为脾脏在免疫系统中的作用减弱，导致机体免疫力下降。
3. 脾切除手术的注意事项：在进行脾切除手术时，应确保动物麻醉充分，避免手术过程中动物挣扎，造成手术风险。
同时，手术过程中应严格无菌操作，预防术后感染。
七、结论脾脏在人体免疫系统中具有重要作用。
实验二__小鼠脾细胞提取及计数
实验二小鼠脾细胞提取及计数一、介绍本次实验整体情况（8：00－8：05，5分钟）：本次实验的操作包括三部分：包被和封闭ELISA板、眼球取血、脾细胞的提取及计数。
其中包被和封闭ELISA板以及眼球取血是为实验三ELISA实验做准备。
ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）酶联免疫吸附试验具体原理下次课讲解。
二、包被和封闭ELISA板：备注：提前10分钟到实验室发放包被和封闭ELISA板所用试剂1. 讲解内容(8：05－8：15，10分钟)包被和封闭ELISA板是为下一次实验酶联免疫吸附试验（ELISA）做准备。
包被就是将已知抗原或抗体吸附于固相载体表面并保持其免疫原性。
在ELISA 板上加上抗原以后，因为电荷数与板不同，所以抗原吸附板上，但是吸附后固相载体表面尚有未被占据的空隙；封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而防止在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。
下面介绍如何包被ELISA反应板及微量加样器使用注意事项。
（1）包被ELISA板：1) 试剂和器材（老师已经在ELISA板上统一标记好）a. pH9.6的碳酸盐缓冲液 ;b. 绵羊红细胞抗原－SRBC;（a和b为包被液，实验室老师已经配好）c.聚乙烯塑料板，微量加样器2) 操作方法a. 包被液：碳酸盐缓冲液1：200 稀释抗原SRBC；b. 聚乙烯塑料板：8孔/2人，每孔加100ul包被液，37度恒温2小时。
（2）微量加样器使用方法及注意事项(让学生自己操作一下，老师教学生看量程):1) 量取样品时选择适当量程的加样器，（P20： 0.5～20.0µl；P200： 20～200 µl； P1000：200～1000 µl）。
老师结合不同型号的微量加样器，指导如何读数，白色由左至右读数，黑/蓝色由上至下读数。
2)转动旋钮，调整量取体积。
顺时针旋转增加体积，逆时针减少体积。
小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离
小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离
“小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离”实验过程
1. 培养皿加入纱布，在纱布上滴2ml淋巴细胞分离液。
2. 脱颈处死小鼠，在75%酒精中浸泡30s(示意消毒小鼠)。
3. 无菌条件下将腹部剪开，脱皮。
(2min)
4. 选取小鼠腹部左侧，剪开腹膜，深红色细长组织即脾脏（淋巴细胞组织）
5. 用镊子从下方夹取脾脏，，剔除结缔组织和脂肪后，将组织置于滴有小鼠淋巴细胞分离液的纱布上。
6. 脾脏用弯头镊子在纱布上研磨至无血色组织后，纱布上加入1ml淋巴细胞分离液，再用移液器吸取研磨的液体，移至1.5ml离心管内。
(3min)
7. 离心（1500rpm,3min）留上清，移入新的15ml 离心管中，去除红细胞，此时可以取胸腺。
(可以做到这里停止，示意淋巴细胞和免疫器官胸腺)
8. 在装有上清的离心管中加入3ml 1640培养基，离心1500rpm，3min，取沉淀，弃上清，重复清洗2次。
（6min）
9. 在显微镜下将细胞浓度调为5×106个/ml备用。
小鼠脾脏中分离淋巴细胞
从小鼠脾脏平分别淋巴细胞
１小鼠断颈处逝世,酒精浸泡５分钟,超净台内打开左侧腹部皮肤,当心分别皮下组织和腹部肌肉吐露出脾脏,提起,剪去四周结缔组织,放入有PBS的小瓶中.无菌镊子夹碎,挤压脾脏,将获得的细胞悬液移入无菌试管中.２另取无菌试管,先参加淋巴细胞分别液,然后将试管竖直,略放平,汲取方才制备的细胞悬液迟缓的参加试管中,一般分别液和细胞悬液的体积比为１：２,要轻要慢,不冲要破了淋巴细胞分别液和细胞悬液的界面.选用合适本身分别目标细胞的离心力和时光进行离心.小我用1500转/分钟,20分钟.３离心后掏出试管,可以看到不合的分层,一般上面长短细胞成分和细胞碎片,接下来是单个核细胞,再往下是红细胞等.吸走上层非细胞层弃之,吸出单个核层在别的无菌试管中,因为淋巴细胞分别液对细胞有毒性感化,参加PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟,10分钟）.４,洗好的细胞参加１６４０造就液和２０％的血清中重悬,迟缓参加已经制备好的尼龙毛柱子中,封好,放３７度孵育一小时.一小时后掏出,超净台内将柱子立起,针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号打针器做的）,以HANKS液和血清先后迟缓冲洗,巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来,B细胞也相对吸附冲洗下来的不久不多,所以冲洗来的大多是T细胞,纯度可打到８０％到９０％,再次冲洗并且用力挤压,如许得到的就是B细胞.得到的细胞可以以１６４０加血清配制的造就液进一步造就或做它用.但是淋巴细胞分别液得到的细胞只能算是粗分,假如试验请求高最好选用磁珠或
流式分别.。
实验四脾淋巴细胞分离及流式检测 邵
1 2 3
9
10
可重复滤过
超净台下操作全过程 4
5
8 6
7
实验步骤
（二）制备单个核细胞悬液：
塑料漏皿
1. 将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套 中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中， 加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。 弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置34min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离 心5min；
实验步骤
（一）取小鼠脾脏（3人1组） • 小鼠颈椎脱位处死
用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍 向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离
• 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界 处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪 及筋膜组织。
取脾脏
1
2
3
4
5
6
7
8
9
可重复滤过
10
（四）计算细胞活力
1. 50μl细胞悬液+ 50μl的0.2% 苔盼兰溶液并混匀；
2. 取一滴显微镜下观察：
如果细胞被染成蓝色，旋转显 微镜微调节钮，细胞无反光， 则为死细胞；而细胞不被染色， 晶莹透亮，旋转显微镜调节钮， 细胞明显反光而且有立体感， 为活细胞；
3. 计算细胞活力：计数100个 细胞中活细胞的百分率，一般 活力应在95%以上。
实验步骤
（三）计算细胞浓度
1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释） 2.混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞总数； 3.计算细胞总数：
脾脏流式细胞术
尼龙膜分离脾脏，5mlPBS重悬脾脏单个细胞+5ml淋巴细胞分离液，玻璃管中2000rpm 水平离心20min。
（其间只要接触到脾脏细胞的大枪头都不要换，可准备一个一次性手套，再利用的枪头可以打在里面）。
吸取中间细胞层于新玻璃管中，PBS洗2遍，1500rpm，5min。
用500ul 8%1640重悬细胞，进行细胞计数，调整细胞数为相同浓度（5*106个/ml，即5*105 个/孔。
不得少于2-3*105 个/孔）铺96孔板。
每只老鼠的脾脏做3个孔重复，若做MTT，可加阴性对照，同样三个孔重复。
加入猪瘟病毒抗原（细胞毒或血毒都可）刺激，2ul血毒/孔，培养72h后吸取上清检测IL-4 和IFN-γ含量。
下层细胞可做MTT。
剩余的细胞，水平离心，弃去营养液，用PBS重悬后，加入三色抗体，孵育30Min 后，离心洗1-2次（看细胞数决定），底部细胞用1%胎牛血清的PBS重悬可以保存一夜。
解刨小鼠提取脾细胞实验报告
解刨小鼠提取脾细胞实验报告
解刨小鼠提取脾细胞实验报告
一、实验目的
本实验旨在通过解刨小鼠，提取脾细胞，以便进行后续的免疫学研究。
二、实验材料和仪器
1. 实验材料：小白鼠、生理盐水、70%乙醇、福尔马林、石蜡等。
2. 实验仪器：手术刀、注射器、组织培养皿、显微镜等。
三、实验步骤
1. 解剖小白鼠：将小白鼠放入无菌条件下，用70%乙醇消毒表面。
然后用手术刀在胸部进行切口，打开胸腔，找到心脏，将心脏割断。
接
着将小白鼠向上抬起头部，用手术刀在颈部进行切口，打开颈部皮肤
和肌肉层，在颈动脉两侧夹住气管和食管，并清除周围组织。
最后将
气管和食管割断，并将颈动脉及其分支全部割断。
2. 取出脾脏：用注射器注入生理盐水，将脾脏从周围组织中分离出来，然后将脾脏放入组织培养皿中加入生理盐水洗涤。
3. 细胞处理：将清洗干净的脾脏放入福尔马林中固定30分钟，再用酒精和石蜡等物质进行包埋。
最后用显微镜观察并提取细胞。
四、实验结果
通过本实验，成功地解剖出小白鼠，并提取了脾细胞。
经过显微镜观察，我们可以看到细胞形态正常，并且数量充足。
五、实验注意事项
1. 实验操作要求严格无菌。
2. 解剖小白鼠时要保持手术刀的锋利度。
3. 在取出脾脏时要注意不要损伤其结构。
4. 细胞处理过程中要避免污染。
六、实验结论
通过本实验，我们成功地解剖了小白鼠并提取了脾细胞。
这为后续的免疫学研究奠定了基础。
同时，在操作过程中也需要注意无菌和仪器使用等方面的细节。
报告实验二：淋巴细胞分离实验.ppt
c
8
实验步骤
5.加足量稀释液充分洗涤，1000 r/min 离心5min ，弃上清
6. 适量的培养基重悬细胞 ，计数
c
9
注意事项
1.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢 加，以免冲散界面
2. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过 多的上清液或分层液而导致血小板污染
c
10
细胞计数
实验步骤 注意事项
实验二
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
目的 原理 实验步骤 注意熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞 （PBMC）的分离方法
c
3
原理
脾脏各种血细胞的密度不尽相同， 利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作 密度梯度离心，使一定比重的细胞 群按相应密度梯度分布，从而将各 种血细胞加以分离。
c
11
实验步骤
1、准备计数板： 2、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞
悬液 3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许
细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细 胞悬液， 4、计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数 板四角大方格中的细胞数
c
12
c
13
实验步骤
5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104
c
16
c
4
原理
外周血
红细胞
1.093
粒细胞
单个核细胞 (PBMC) 血小板
淋巴细胞 单核细胞
1.092 1.075~1.090
1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
c
5
稀
释
外
周
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
NK细胞表面标志
人类细胞表面标志主要以 CD16、CD56来 认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴 细胞认定为NK细胞。
流式细胞术(FCM)
流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微 粒（如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光 与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新 技术结合，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。
以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体 即可制成免疫磁性微珠。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。 基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FAC： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
（二）制备单个核细胞悬液：
1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液(10ml)的平皿中，然后再 置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指 套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液置于15ml离心管中，再取5mlPBS冲 洗培养皿后移入15ml离心管。以1500rpm离心5min。弃 去上清，轻轻弹散细胞沉淀,加红细胞裂解液ACK至2-3ml ，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加 PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；
4 脾脏单个核细胞分离及流式细胞术染色(1)(1)
• 3．急性大失血法：用粗针头一次采取大量心脏血液，可使动物致死。 • 4．吸入麻醉致死法：应用乙醚吸入麻醉的方法处死。大、小鼠在20～30秒
3.清洗：加500ulPBS,吹打混匀后， 5000rpm， 4℃，5min
4.检测：小心用枪去除上清，再加入500ul PBS吹打混匀，置于冰上， 流式细胞仪检测
CD3： T cell CD4+ T cell； CD8+ T cell
补充知识
通常分离细胞是为了下一步实验。有些实验如需要对细 胞作进一步培养，则在分离细胞时一定要严格无菌操作。
在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他 细胞。
计数完毕后请立即清洗细胞计数板！
思考题
1.实验过程中注意问题有哪些？
实验小鼠处死方法
• 1．颈椎脱臼法：是大、小鼠最常用的处死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱日，造成脊髓 与脑髓断离，动物立即死亡。
实验四
小鼠脾脏单个核细胞分离及 流式细胞术染色
钱国军 邹本坤 2016-03-31
解剖图
小鼠脾脏位于上腹部左后侧， 体积较大，长条形，属于外 周免疫器官。外周血中淋巴 细胞可经再循环驻入脾脏等 外周免疫器官的特定区域， 所以富含各类免疫细胞。
实验原理
细胞计数
3mm
W1
W2
W3
小鼠淋巴细胞分离
小鼠全脾分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离全脾：取脾，横切约1mm厚放入固定液，作为组化样本，其余组织放入1ml 5% FCS 1640.3.脾淋巴细胞的分离：1)脾脏处理：将脾脏置于200目滤网上，用5mL注射器内芯轻轻研磨，不断向组织上滴加2ml 5% FCS 1640，直至组织内绝大部分细胞被分离，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。
.2)500g，3min，弃上清。
3)红细胞裂解：加入1ml 红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温裂解2分钟至红细胞完全破碎。
4)500g，5min，弃上清。
5)洗涤1次：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。
加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；6)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640的量。
7)加入适量10% FCS 1640调整细胞浓度至1×107/mL，置于4ºC备用。
小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离淋巴结：取腋下，腹股沟，肠系膜淋巴结，其中腋下淋巴结置固定液中送组化，其余淋巴结放入1ml 5% FCS 1640.3.淋巴结淋巴细胞的分离：1)淋巴结处理：将淋巴结漂浮于3ml 5% FCS 1640（玻璃平皿）中，用无菌大镊子紧捏淋巴结，并用5mL注射器内芯轻轻研磨，绝大部分淋巴细胞游离置培养基中，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。
.2)500g，3min，弃上清。
3)洗涤：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。
加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；4)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640 的量。
脾细胞的提取
脾细胞的提取
1、用颈椎脱臼法处死小鼠，75%的酒精浸泡2-3分钟。
2、将小鼠移入超净工作台内，无菌条件下，以仰卧位固定在解剖盘上。
3、用眼科镊子夹起腹股沟中线处皮肤，用眼科剪做一横切口。
用镊子捏住切口
两端的皮肤朝着小鼠的尾部和头部纵向撕开皮肤，暴露腹腔膜壁。
4、剪开腹腔壁膜，用镊子夹出脾脏，并用剪子剪去与其相连的组织，将脾脏放入无菌PBS中。
5、用注射器内芯或者研棒研磨脾脏，或用2ml注射器赶出淋巴细胞，过100目
筛网，收集分离的脾细胞悬液，1200r/min离心5min，弃上清。
6、弹散细胞团，加红细胞裂解液5mL左右，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细
胞完全破碎，加大量PBS，1200r/min离心5min，弃上清。
7、加入PBS，混匀，再过100目筛网，1200r/min离心5min。
8、倒掉上清液，加入1640培养液，用吸管吹打均匀，计数，接种。
附：红细胞裂解液（ACK）的配制（500ml）
1．NH4Cl 3.735g。
2．Tris-base 1.3g。
3．用HCl调pH值至7.2。
4．过0.22 um 滤膜。
小鼠脾细胞流式实验步骤_概述说明以及解释
小鼠脾细胞流式实验步骤概述说明以及解释引言部分的内容应包括概述、文章结构和目的。
1. 引言1.1 概述：本文旨在介绍小鼠脾组织中的细胞流式实验步骤。
流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究领域的技术，它能够对单个细胞进行高通量分析，并且在分析多个参数时提供了准确性和高度灵活性。
通过对小鼠脾细胞进行流式实验，我们可以深入了解该组织内不同类型细胞的数量、表型和功能，从而为进一步的研究提供重要依据。
1.2 文章结构：本文分为四个主要部分：引言、小鼠脾细胞流式实验步骤概述、正文和结论。
在引言部分，我们将简要概述本文要讨论的主题，并介绍文章结构；然后，在小鼠脾细胞流式实验步骤概述部分，我们将详细介绍研究对象的相关信息，并解释流式细胞术的基本概念；接下来，在正文部分，我们将重点讨论关于细胞处理和标记方法、流式细胞仪操作步骤以及数据分析与统计方法的内容；最后，在结论部分，我们将总结实验结果和发现，并对其意义、局限性以及下一步研究提出展望和建议。
1.3 目的：本文的目的是向读者全面介绍小鼠脾细胞流式实验步骤。
通过详细阐述实验设计、样本制备、细胞处理和标记方法、流式细胞仪操作步骤以及数据分析与统计方法，我们希望读者能够理解并掌握小鼠脾细胞流式实验的基本原理和操作技巧。
同时，通过讨论实验结果与发现的总结、结果意义与局限性的讨论以及对下一步研究的展望和建议，我们希望启发读者思考关于小鼠脾组织中特定类型细胞功能和相互作用机制方面的问题，为相关领域的深入研究提供思路和指导。
2. 小鼠脾细胞流式实验步骤概述：2.1 研究对象介绍：小鼠脾细胞是指从小鼠脾脏中分离出的细胞群体。
小鼠脾脏是淋巴系统的重要器官之一，其中包含各种免疫细胞，如B细胞、T细胞、巨噬细胞等。
小鼠脾细胞流式实验通过对这些免疫细胞进行标记和分析，可以帮助我们了解免疫反应的机制以及疾病发生过程中免疫系统的变化。
2.2 流式细胞术概念解释：流式细胞术（flow cytometry）是一种用于分析和计数单个活动或已死亡的细胞的技术。
流式细胞研究分析和混合淋巴细胞反应实验中小鼠脾脏的摘取(图文解说)
流式细胞分析和混合淋巴细胞反应实验中小鼠脾脏的摘取（图文解说）作者: 日期:准备眼科镊和眼科剪若干 （文中笔者使用眼科流式细胞分析和混合淋巴细胞反应实验中小鼠脾脏的摘取最近老婆要提取脾脏细胞做流式，我就做个简单的解说，也顺便传到网上供菜鸟理解， 如果有大神看到这篇文章，也欢迎指导。
大家一起讨论，把实验做得更好。
无论是做混合淋巴细胞反应或者流式细胞分析都要用到脾脏。
小鼠的脾脏摘取颇为简 单，但有很多同学是第一次接触，所以在此做一个简单的图文讲解。
在此讲解不甚详细，具 体步骤请同学参照网上已有各种Protocol,本文重点在于图文解说，让大家对照图片和其他Protocol 更好的理解脾脏的摘取。
小鼠处死后泡酒精 2-3分钟，泡久了细胞会缩水， 泡的时间短了起不到消毒杀菌的 作用摆好小鼠体位，取右侧卧位。
沿着小鼠左侧肋骨走行方向做切口。
直镊3把，眼科剪2把）四，向小鼠左后背方探查，在皮下很浅的地方可见深红色脾脏。
脾脏走行向与肋骨方向近似平行、宅.rI4*五, 用镊子轻轻提起脾脏。
脾脏下会连着许多结缔组织，轻轻把它们撕掉。
■ 'IkII-r--.7X XZ放于培养皿中【事先在培养皿中放入 PBS （混淋）或红裂（流式）和200 白色的为后面要用到的过滤六，完整摘下脾脏， 目的铁丝网】 如下右图所示，银色的为本步骤中使用的铁丝网, 膜七，一把新的眼科剪和一把新的眼科镊（新消毒过的。
本文所用的为新高压的），把脾脏在培养皿里剪成小块。
然后用 2.5ml或5ml注射器柄，把脾脏研磨成细胞。
研磨过程要轻柔，否则会损伤脾脏中的细胞。
4 A八, 研磨至培养皿中不见整块脾脏，只剩一些不能磨碎的结缔组织为止。
九，再加入4ml红细胞裂解液，冲洗铁丝网，注射器内芯，并用枪头吹打混匀，裂解5mi n十，将液体一并转入15ml离心管中，400g,5min,离心十^一, 弃去上清，加入5ml含10%FBS的1640 ,重悬，用装有200目的尼龙滤膜过滤(可过滤两次);尼龙滤膜就是第六步中右图的白色滤膜。
提取小鼠体内脾细胞实训过程记录
提取小鼠体内脾细胞实训过程记录实验目的：通过体内脾细胞提取，研究免疫细胞的增殖、分化和功能等方面的生理生化特性。
实验原理：小鼠脾脏是免疫细胞的主要器官，其中包含了大量的淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。
提取小鼠脾细胞，可用于免疫细胞的培养、表型分析、功能研究等。
实验步骤：1.小鼠剖腹取脾：先在实验动物按照规范的动物操作技术下施行人道安乐死，随后对小鼠进行无菌外科手术，在消毒的手术台上固定小鼠，并用无菌剪刀切开腹部，显露腹腔。
定位到脾脏后，用消毒的剪刀和镊子轻轻牵引脾脏，将脾脏完整地取出。
2.清洗脾脏：将取出的脾脏置于无菌PBS缓冲液中，用无菌镊子和剪刀把脾脏上的脂肪和血管组织清除干净，并将脾脏放入含无菌PBS的培养皿中。
3.细胞提取：用无菌注射器灌注0.5mL无菌PBS缓冲液，将其注入脾脏中，用剪刀剪碎脾脏组织，使细胞充分分散。
接着，将脾脏组织转移到一个50mL离心管中，并加入5mL无菌PBS缓冲液。
用离心机将脾脏组织沉淀离心，将上清液倒掉，沉淀的细胞被称为脾单细胞悬液。
4.细胞计数：将脾单细胞悬液重新悬浮在含PBS的15mL离心管中，用显微镜和细胞计数板计数细胞。
根据计数结果，计算细胞的浓度。
5. 离心沉淀：将细胞悬液倒入离心管中，并进行离心，离心速度约为1500 rpm，离心时间为5分钟。
离心后，将上清液丢掉，离心管中的细胞沉淀称为脾细胞。
6.细胞培养：将脾细胞再次悬浮在含有适当培养基的培养皿中，加入足够的细胞密度，放入恒温培养箱中培养。
培养条件根据不同实验的要求进行设置，一般情况下，培养基中含有的细胞因子、血清和其他添加剂都是必要的。
7.实验后处理：根据具体实验要求，对培养的脾细胞进行进一步的实验处理，如分离、染色、鉴定、培养基替换等。
实验注意事项：1.手术操作时要注意无菌操作，避免污染。
2.取脾脏后要迅速进行后续操作，避免细胞损伤。
3.细胞培养过程中，要保持适当的温度和湿度，以及细胞所需的培养基成分。
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告1. 引言小鼠脾脏淋巴细胞是免疫系统中重要的组成部分，它们在抵御病原体侵袭和保护机体免受自身免疫疾病侵害中发挥着关键的作用。
因此，为了研究小鼠脾脏淋巴细胞的特性和功能，我们需要将其从脾脏中分离出来并进行计数。
本实验旨在描述小鼠脾脏淋巴细胞的分离与计数方法。
2. 材料与方法2.1 实验材料•小鼠脾脏样品•细胞培养基•消化酶•离心管•细胞计数板•显微镜2.2 实验方法2.2.1 小鼠脾脏样品的获取1.选择适龄的小鼠，以确保其脾脏发育成熟。
2.用消毒工具将小鼠颈部暴露，进行脾脏的解剖。
3.将脾脏置于无菌的容器中，迅速将其转移到实验室。
2.2.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离1.将小鼠脾脏放置在无菌离心管中，并加入足够的细胞培养基。
2.使用搅拌器或离心机将脾脏组织均匀分散于培养基中。
3.加入消化酶，按照说明书中的浓度和时间进行消化。
4.在消化结束后，用细胞培养基冲洗脾脏组织，以去除余留的消化酶。
2.2.3 小鼠脾脏淋巴细胞的计数1.取适量的脾脏细胞悬液，加入细胞计数板中。
2.在显微镜下观察并计数细胞计数板中的淋巴细胞数量。
3. 实验结果3.1 小鼠脾脏样品的获取从适龄的小鼠身上成功解剖出脾脏，并将其转移到实验室。
3.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离经过消化酶的作用，小鼠脾脏细胞成功地被分离并悬浮于培养基中。
3.3 小鼠脾脏淋巴细胞的计数通过显微镜观察，我们计数了细胞计数板中的淋巴细胞数量，并记录了结果。
具体数据如下： 1. 格子1：20个淋巴细胞 2. 格子2：18个淋巴细胞 3. 格子3：22个淋巴细胞 4. 格子4：19个淋巴细胞根据计数结果求平均值，得到平均每格淋巴细胞数目为19.75个。
4. 结论根据我们的实验结果，我们成功地分离出小鼠脾脏淋巴细胞，并进行了有效的计数。
通过计数结果，可以推断小鼠脾脏淋巴细胞的数量在每格约为19.75个左右。
这些实验结果为进一步研究小鼠脾脏淋巴细胞的特性和功能提供了基础数据。
小鼠脾脏t细胞流式分选实验步骤
实验目的：通过流式细胞仪对小鼠脾脏T细胞进行分选，以探究T细胞在免疫应答中的作用及机制。
一、实验前准备1.1 实验材料准备1.1.1 小鼠脾脏组织1.1.2 10mL注射用生理盐水1.1.3 0.25胰酶液1.1.4 洗涤缓冲液（PBS）1.1.5 红细胞裂解液1.1.6 表面标记抗体：CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC1.1.7 流式细胞仪1.1.8 离心管、移液枪、吸头、培养皿等实验器材1.2 实验环境准备1.2.1 无菌操作台1.2.2 常温恒温器1.2.3 培养箱1.2.4 流式细胞仪操作间二、实验步骤2.1 小鼠脾脏细胞分离2.1.1 将小鼠处死并取出脾脏组织，放入含有10mL生理盐水的培养皿中，剪碎均匀。
2.1.2 加入0.25胰酶液，放入37摄氏度恒温器中消化30分钟。
2.1.3 将组织碎片过滤，用PBS洗涤，避免红细胞污染。
2.1.4 使用红细胞裂解液裂解红细胞，离心沉淀，得到细胞悬液。
2.2 细胞表面标记2.2.1 取得细胞悬液，计数并调整浓度至合适水平。
2.2.2 分别加入CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC表面标记抗体，进行表面标记反应，避免光照。
2.2.3 进行表面标记抗体的洗涤和离心，得到标记的细胞悬液。
2.3 流式细胞仪分选2.3.1 将标记的细胞悬液输入流式细胞仪，设置合适的参数。
2.3.2 进行T细胞的流式细胞仪分选，并收集目标T细胞子集。
2.3.3 对收集的目标T细胞子集进行进一步的分析或培养。
三、实验注意事项3.1 实验过程中要保持无菌操作，避免细胞污染。
3.2 实验中避免表面标记抗体受光照。
3.3 实验材料和仪器的准备和操作要符合实验要求，确保实验结果的准确性和可靠性。
通过上述步骤，可以对小鼠脾脏T细胞进行流式分选实验，进一步探究T细胞在免疫调节中的作用及机制，为相关研究提供重要的实验数据支持。
在实验过程中，对于小鼠脾脏T细胞的流式分选需要严格控制各个步骤，确保实验结果的可靠性和准确性。
小鼠脾脏淋巴细胞检测方法
小鼠脾脏淋巴细胞检测方法说实话小鼠脾脏淋巴细胞检测这事儿，我一开始也是瞎摸索。
我试过好多种方法，走了不少弯路呢。
我最早的时候，那就是按照一些书上的基本步骤来。
先得把小鼠处死，这一步可得小心点，千万不要把脾脏什么的给弄破弄坏了，就好比你拆一个特别精密的小零件，得小心翼翼的，不然就全乱套了。
然后取脾的时候，我就出过岔子。
有次取脾太着急，结果把旁边的一些组织也带出来了不少，这就会影响后面步骤的准确性。
我后来就明白了，得用镊子特别小心地把脾脏完整地分离出来才好。
取出来脾脏之后就要研磨来制备细胞悬液。
我研磨的时候一开始总是掌握不好力度，要么就是研磨得太轻了，细胞没有完全释放出来，就像你榨果汁，但是力气小了，好多果肉还在果渣里一样；要么就是研磨得太重，把细胞弄破了一些，这就惨了。
经过好多回试验，我才逐渐掌握了那个合适的力度，就像你慢慢找到了开锁的正确手感一样。
制备好细胞悬液后下面就是分离淋巴细胞了。
有密度梯度离心法，可这方法里那个离心的转速啊，就像一个神秘的数字，我试了好几个不同的转速，才找到了最适合的那个数值，能把淋巴细胞比较干净地分离出来。
刚开始的时候要么转速不对，淋巴细胞和别的细胞混在一起分不开，要么就是纯度不够。
对于检测淋巴细胞数量和活性这一步，我以前用过台盼蓝染色的方法。
但这个染液的量得用好，有一次染液加多了，结果看细胞都花了眼，都辨不清死活了。
后来知道就只能加那么一点点，就够覆盖细胞就好，然后在显微镜下仔细看蓝的就是死细胞，没着色的就是活细胞。
而且这个观察的时候，也得有耐心，要多个视野都看看统计，不能就看一眼就下结论。
这就像你数一堆东西一样得仔细都数到。
还有用流式细胞术检测淋巴细胞的各种亚群，这个仪器老高级了，但操作起来参数设置很关键，我一开始也是晕头转向的，老是测不准。
后来向做过的同事请教，又自己不断尝试不同的参数组合，才慢慢能得到准确的结果。
比如说那个门的设置，就像是给不同的人群划区域，要是划得不好，就把类型分错了。
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流式细胞分析和混合淋巴细胞反应实验中
小鼠脾脏的摘取
最近老婆要提取脾脏细胞做流式，我就做个简单的解说，也顺便传到网上供菜鸟理解，如果有大神看到这篇文章，也欢迎指导。
大家一起讨论，把实验做得更好。
无论是做混合淋巴细胞反应或者流式细胞分析都要用到脾脏。
小鼠的脾脏摘取颇为简单，但有很多同学是第一次接触，所以在此做一个简单的图文讲解。
在此讲解不甚详细，具体步骤请同学参照网上已有各种protocol,本文重点在于图文解说，让大家对照图片和其他protocol更好的理解脾脏的摘取。
一，小鼠处死后泡酒精2-3分钟，泡久了细胞会缩水，泡的时间短了起不到消毒杀菌的作用
二，摆好小鼠体位，取右侧卧位。
三，沿着小鼠左侧肋骨走行方向做切口。
准备眼科镊和眼科剪若干（文中笔者使用眼科直镊3把，眼科剪2把）
四，向小鼠左后背方探查，在皮下很浅的地方可见深红色脾脏。
脾脏走行向与肋骨方向近似平行
五，用镊子轻轻提起脾脏。
脾脏下会连着许多结缔组织，轻轻把它们撕掉。
六，完整摘下脾脏，放于培养皿中【事先在培养皿中放入PBS （混淋）或红裂（流式）和200目的铁丝网】如下右图所示，银色的为本步骤中使用的铁丝网，白色的为后面要用到的过滤膜
七，一把新的眼科剪和一把新的眼科镊（新消毒过的。
本文所用的为新高压的），把脾脏在培养皿里剪成小块。
然后用2.5ml或5ml注射器柄，把脾脏研磨成细胞。
研磨过程要轻柔，否则会损伤脾脏中的细胞。
八，研磨至培养皿中不见整块脾脏，只剩一些不能磨碎的结缔组织为止。
九，再加入4ml红细胞裂解液，冲洗铁丝网，注射器内芯，并用枪头吹打混匀，裂解5min 十，将液体一并转入15ml离心管中，400g,5min,离心
十一，弃去上清，加入5ml含10%FBS的1640 ,重悬, 用装有200目的尼龙滤膜过滤(可过滤两次); 尼龙滤膜就是第六步中右图的白色滤膜。
十二，滤液离心400g,5min,弃上清，加入1ml含10%FBS的1640,重悬混匀，稀释50(20+980)倍计数，；
至此，脾脏细胞就算提取完成了。
后面几步没有上图，但做过实验的同学很容易就能理解是怎么回事啦。