猪脾脏淋巴细胞分离
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• 加入Hank’s液至10mL， 再1000rpm，5min后，弃 上清，加入Hank’s液重悬， 取少量细胞悬液计数。
加入Hank‘s液后，要混匀
为了彻底洗涤淋巴细胞的分离液 残留，一般需要重复洗涤一次。
计数
取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合
• 先在低倍镜 下找到中方 格区域，再 在中倍镜下 进行细胞计 数。
• 红细胞、粒细胞比重大，约为1.090，离心后沉于 管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分 层液比重，约为1.075，离心后漂浮于分层液的液 面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中；血小 板的比重最小，约为1.030，离心后浮于分层液上 面。
• 借助密度梯度离心，吸取分层液液面的细胞，就 可从外周血中分离到单个核细胞。
文献分析。
四、实验操作
• 破碎 • 分离 • 洗涤 • 计数
机械破碎（细胞筛） 密度梯度离心 Hank’s液多次离心 细胞计数板
破碎并过筛
• 剪一小块脾脏（先用Hank‘s液清洗掉表面 的杂物），置于细胞筛（放在平皿上）中， 用针头不断搓烂组织块，同时用Hank’s液 （5mL）将细胞洗到平皿中。
转移组织液
活细胞百分率 =
细胞总数
× 100%
三、实验材料
• 材料：猪脾脏 • 仪器：离心机，显微镜、超净工作台 • 用具：细胞筛、手术刀、手术剪、镊子、烧
杯、吸管，培养皿、细胞计数器、离心管、 肝素抗凝管 • 试剂：淋巴细胞分离液(比重1.077±0.001）、 无Ca2+、Mg2+的Hank's 液
注：Hank's 液为缓冲等渗液，类似营养液，保持细胞活性及完整性，可抵抗轻微的 酸碱变化。
实验报告
• 标题
• 实验目的、实验原理、实验用品、注意事 项这些基本参考实验指导（word版）
• 实验操作可以按照自己的理解去写，尽量 简洁明了
• 实验结果及分析是重点，无论结果如何， 尽量真实表现，有问题说问题，有发现说 发现，有成就说成就，有建议说建 议。。。。
评分标准
• 出勤情况 • 感性材料，如报告工整，白细胞的观察结果图片 • 理性材料，主要是实验报告中的结果汇报及结合
细胞计数
数上不数下，数左不数 右。
大方格 中方格
细胞计数板
每个大方格的容 积是0.1mm3
细胞数量：
单个核细胞浓度（细胞数/ml)
= 4个大方格内细胞总数
4
×104×a (稀释倍数）
= 5个中方格内细胞总数 ×5 × 104×a (稀释倍数）
细胞活力检测：（死细胞被染成蓝色，活细胞不着色）
活细胞数
五、注意事项
• 往分离液加组织液时，要沿着管壁，缓慢
加入，避免它们互混。
• 密度梯度离心后，弃去上层血浆时，要尽
量轻，切勿打破形成的分层。
• 细胞计数时，要等量加入细胞悬液和台盼 蓝染液，结果也要2倍。
• 整个实验操作要尽量快，避免细胞过度死 亡。
思考题
• 1、台盘蓝染液如何配置？
• 2、你认为本次试验成败的关键因素是什么 ？应该怎样把握？
猪脾脏淋巴细胞分离与细胞计数
华南农业大学生命科学学院微生物学教研室 张玲华课题组
一、实验目的
• 掌握密度梯度离心的原理及方法 • 掌握细胞计数板的工作原理及使用方法
二、实验原理
• 聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液 (商品名为淋巴细胞分离液) ,比重 1.077±0.001 。
• 倾斜地缓缓地 将你的组织液 沿着管壁加入 分离液(5mL) 上层，避免互 混。
Байду номын сангаас
密度梯度离心
← 分离的对象 在取淋巴细胞层的方法上，可以采用吸掉上层的血浆，或者直接缓缓从中间 吸出约2mL的淋巴细胞层。
取淋巴细胞层
• 弃去上层血浆
• 将中间的淋巴 细胞层（约 2mL）移到新 的离心管中
加入Hank’s液
加入Hank‘s液后，要混匀
为了彻底洗涤淋巴细胞的分离液 残留，一般需要重复洗涤一次。
计数
取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合
• 先在低倍镜 下找到中方 格区域，再 在中倍镜下 进行细胞计 数。
• 红细胞、粒细胞比重大，约为1.090，离心后沉于 管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分 层液比重，约为1.075，离心后漂浮于分层液的液 面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中；血小 板的比重最小，约为1.030，离心后浮于分层液上 面。
• 借助密度梯度离心，吸取分层液液面的细胞，就 可从外周血中分离到单个核细胞。
文献分析。
四、实验操作
• 破碎 • 分离 • 洗涤 • 计数
机械破碎（细胞筛） 密度梯度离心 Hank’s液多次离心 细胞计数板
破碎并过筛
• 剪一小块脾脏（先用Hank‘s液清洗掉表面 的杂物），置于细胞筛（放在平皿上）中， 用针头不断搓烂组织块，同时用Hank’s液 （5mL）将细胞洗到平皿中。
转移组织液
活细胞百分率 =
细胞总数
× 100%
三、实验材料
• 材料：猪脾脏 • 仪器：离心机，显微镜、超净工作台 • 用具：细胞筛、手术刀、手术剪、镊子、烧
杯、吸管，培养皿、细胞计数器、离心管、 肝素抗凝管 • 试剂：淋巴细胞分离液(比重1.077±0.001）、 无Ca2+、Mg2+的Hank's 液
注：Hank's 液为缓冲等渗液，类似营养液，保持细胞活性及完整性，可抵抗轻微的 酸碱变化。
实验报告
• 标题
• 实验目的、实验原理、实验用品、注意事 项这些基本参考实验指导（word版）
• 实验操作可以按照自己的理解去写，尽量 简洁明了
• 实验结果及分析是重点，无论结果如何， 尽量真实表现，有问题说问题，有发现说 发现，有成就说成就，有建议说建 议。。。。
评分标准
• 出勤情况 • 感性材料，如报告工整，白细胞的观察结果图片 • 理性材料，主要是实验报告中的结果汇报及结合
细胞计数
数上不数下，数左不数 右。
大方格 中方格
细胞计数板
每个大方格的容 积是0.1mm3
细胞数量：
单个核细胞浓度（细胞数/ml)
= 4个大方格内细胞总数
4
×104×a (稀释倍数）
= 5个中方格内细胞总数 ×5 × 104×a (稀释倍数）
细胞活力检测：（死细胞被染成蓝色，活细胞不着色）
活细胞数
五、注意事项
• 往分离液加组织液时，要沿着管壁，缓慢
加入，避免它们互混。
• 密度梯度离心后，弃去上层血浆时，要尽
量轻，切勿打破形成的分层。
• 细胞计数时，要等量加入细胞悬液和台盼 蓝染液，结果也要2倍。
• 整个实验操作要尽量快，避免细胞过度死 亡。
思考题
• 1、台盘蓝染液如何配置？
• 2、你认为本次试验成败的关键因素是什么 ？应该怎样把握？
猪脾脏淋巴细胞分离与细胞计数
华南农业大学生命科学学院微生物学教研室 张玲华课题组
一、实验目的
• 掌握密度梯度离心的原理及方法 • 掌握细胞计数板的工作原理及使用方法
二、实验原理
• 聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液 (商品名为淋巴细胞分离液) ,比重 1.077±0.001 。
• 倾斜地缓缓地 将你的组织液 沿着管壁加入 分离液(5mL) 上层，避免互 混。
Байду номын сангаас
密度梯度离心
← 分离的对象 在取淋巴细胞层的方法上，可以采用吸掉上层的血浆，或者直接缓缓从中间 吸出约2mL的淋巴细胞层。
取淋巴细胞层
• 弃去上层血浆
• 将中间的淋巴 细胞层（约 2mL）移到新 的离心管中
加入Hank’s液