猪脾脏淋巴细胞分离
[计划]猪淋巴结系统
![[计划]猪淋巴结系统](https://img.taocdn.com/s3/m/60462c944b35eefdc9d3334d.png)
[计划]猪淋巴结系统淋巴结是反映机体病理状态的器官，颌下淋巴结、颈浅背倾淋巴结、腹股沟淋巴结和骼内淋巴结是宰后检验猪肉时最具有剖检意义的淋巴结。
1 必检淋巴结的位置及主要流向颌下淋巴结，位于下颌间隙，颌下腺的前面，主要收集面部、鼻腔前半和口腔各组织的淋巴液;颈浅背倾淋巴结，位于肩关节前方，肩胛横突肌和斜方肌的下面，基本汇集了颈上部、前肢上部、肩胛与耆甲部的皮肤，深浅层肌肉和骨骼、肋胸壁上部与腹壁中上1/3处组织的淋巴液;腹股沟淋巴结，位于腹股沟部皮下，公畜位于阴茎背倾，母畜位于乳腺后上方，收集股内则、腹下壁皮肤及阴茎或乳房的淋巴液;骼内淋巴结，位于骼外动脉起始部附近，收集骨岔及后肢的淋巴，经腰淋巴干汇入乳糜池，是具有解剖意义的淋巴结。
2 淋巴结在剖检时的变化淋巴结阻留病原微生物时呈现相应的病理变化。
《肉品卫生检验试行规程》规定:猪在放血后，入池前先剖检颌下淋巴结，它的实质指导意义是，猪患炭疽时典型症状为咽喉型，因而颌下淋巴结明显肿胀、出血或坏死，呈砖红色坏死灶，周围组织有大量黄色胶样浸润;猪患结核病时颌下淋巴结因细菌滞留而形成结核;患猪瘟时全身淋巴结周边出血，切面边缘及实质出血，呈大理石状;猪患链球菌病时，颈浅背倾淋巴结出现化脓性炎症，出血发黑，周边出血有瘀斑并发生脓肿;猪肺疫时淋巴结肿大，为浆液性出血性炎症;患猪丹毒时全身淋巴结肿胀充血，切面多汁有轻度黄染;猪患布氏杆菌病在病原菌侵入淋巴结后，繁殖或定居，呈隐性感染，剖检腹股沟淋巴结时可见坏死和水肿;患猪弓形体病时，肠系膜淋巴结呈束状肿胀，切面呈砖红色或灰红色，有白色干酪样坏死。
3 必检淋巴结的指导意义3.1 必检淋巴结能反映病原体侵害机体的途径、程度甚至性质，尤其是传染病，在淋巴结中形成特殊的病理形态学征象。
3.2 家畜淋巴结众多，分布广，必检淋巴结是收集淋巴液较广、最能反映机体病理状态的器官，屠宰解体不易被破坏，同时位于浅表便于剖检。
3.3 必检淋巴结的检验，可避免组织切面过多，招致细菌侵入，以保证肉品卫生质量和商品价值。
西藏小型猪胰岛细胞体外分离和纯化方法
西藏小型猪胰 岛细胞体外分离和纯化方法
戚 文 军 ２ ， 汪亦 男 － － ２ ， 胡 强 ， 唐 华１ ， ２那 顺 巴雅 尔 ， 顾为望１ ， ２
（ １ ． 东莞松 山湖明珠 实验动物科技有限公司， 东莞 ５ ２ ３ ８ ０ ８ ； ２ ． 南方医科大学实验动物中心暨比较 医学研究所， 广州 ５ １ ０ ５ １ ５ ） ［ 摘要］ 目的 确定成体西藏小型猪胰 岛细胞体外分离、纯化的理想条件 ，为异种移植治疗糖尿 病提供高质量的胰岛细胞 。方法 对比不同质量浓度的胶原酶（ １ ｍ ｇ ／ ｒ ｒ ａ ， ２ ｍ ｇ ／ ｒ ｒ ａ ， ３ ｎ Ｉ ｌ ｌ ， ４ ｍ ｎ １ ） 和同一质量浓度 不同时间点（ ０ ｍ ｉ ｎ ， １ ５ ｍｉ ｎ ， ３ ０ ｍ ｉ ｎ ， ４ ５ ｍ ｉ ｎ ， ６ ０ ｍ ｉ ｎ ， ７ ５ ｍ ｉ ｎ ， ９ ０ ｍ ｉ ｎ ） 分 离获得胰岛细 胞的数量和效果； 使用 Ｆ ｉ ｃ ｏ ｌ ｌ ４ ０ ０密度梯度 离心、淋巴分离液分离、离心和静置４ 种方法纯化胰 岛 细胞悬液，比较最终收集到的胰 岛细胞数量和效果； 用Ｄ Ｔ Ｚ染色计算胰岛细胞的纯度； 用Ａ Ｏ ／ Ｐ Ｉ 染 色计算胰岛细胞存活率。结果 确定了不同 质量浓度的胶原酶获取胰 岛细胞的最佳时间， 胶原 酶ｌ ｍｇ ／ ｍｌ 和２ ｍ ｇ ／ ｎ ￣ 组为４ ５ ｍ ｉ ｎ ，３ ｍ ｇ ／ ｍ ｌ 和４ ｍ ｇ ／ ｍ ｌ 组为 ３ ０ ｍ ｉ ｎ ， 各组在最佳时间点获得胰岛细
胞 的分 离效 果影 响 显著 ［ ２ － ４ 】 ，而纯 化 的手 段 决 定 了
最 终获得 的胰 岛细胞 的纯度和 数量 。本 文通过 对 比 实验确 定西藏 小型猪胰 岛细胞 体外分 离 、纯化 的理 想 条 件 ，为 下 一步 的异 种移 植 打 下 基础 ［ ５ ＇ 引。
猪病学
猪瘟（Swine fever）猪瘟是由猪瘟病毒引起猪的急性、热性、高度接触性、败血性传染病。
一直是造成养猪业重大损失的疫病之一。
其病理变化及诊断要点：（一）病理剖检变化1、超急性猪瘟病例，常常无明显病理变化，病猪突然死亡。
2、急性、亚急性病例，主要表现为多发性出血。
全身出血：常见于皮肤、会厌软骨、膀胱及胆囊黏膜，心内、外膜，各脏器的浆膜和黏膜。
全身淋巴结（包括颌下淋巴结、肩前淋巴结、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结等）均肿胀、呈现典型的周边出血，色鲜红。
由于淋巴结髓质肿胀，表现出大理石样外观。
脾脏：一般不肿大，脾脏边缘及其尖部可见大小不等、稍突出于脾脏表面，质地坚硬，切面呈三角形或椎形的红色梗死灶。
脾脏被膜下可见散在小出血点。
肾脏：不肿大，呈灰黄色，贫血状，于灰白色肾脏表面布满红色或褐色出血点，外观似麻雀卵，故称“雀斑肾”。
骨骼：由于猪瘟病毒损伤造血组织和影响钙、磷代谢，造成幼猪骨骼发育不良，肋骨和肋软骨交界处肿胀，即“骨骺线增宽”。
因骨髓出血，故有“黑骨髓”之称。
中枢神经系统：大脑、小脑呈现病毒性脑炎的典型病变，剖开颅腔，可见软脑膜呈树枝状充血，混浊，脑内压增高，稍突出于颅腔。
肺脏：猪瘟常与巴氏杆菌混合感染造成典型的出血性大叶性肺炎病变，重症病例可表现为纤维素性胸膜肺炎或心包炎。
肠道：猪瘟又称“烂肠瘟”，常表现为出血性纤维素性肠炎，或纤维素性坏死性肠炎。
如并发肠道沙门氏杆菌感染时，病变加重，尤其在回肠和盲肠交界处由于淋巴滤泡坏死常常表现为溃疡，此种溃疡病变为轮层状坏死，外观似钮扣，故称为“扣状肿”。
此外，如怀孕母猪感染猪瘟病毒可造成木乃伊胎、死胎和畸形胎。
在死胎猪中最常见的病理变化为皮下水肿、腹水和胸腔积液。
畸形胎主要表现为头、四肢和脊髓发育不良，脑和肺脏甚至不发育。
胚胎期感染且出生后不久死亡的仔猪表现为皮肤和内脏器官出血。
（二）病理组织学变化淋巴结：淋巴结周边陈旧性出血则有橙色血脂或淋巴结周边新鲜出血，淋巴细胞排空和网状细胞增生。
脾脏分离淋巴细胞
从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
方法一:
１用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液。
２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。
室温水平离心2000转/分钟，30分钟。
３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。
吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS离心洗两遍（1000转/分钟，10分钟）。
４倾倒上清，用RPMI-1640重悬细胞。
方法二：
用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，2000r/min离心3min，弃上清。
加红细胞裂解液8mL，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细胞完全破碎，2000r/min离心3min，弃上清去除红细胞，Hank’s液洗1-2遍，用RPMI-1640（含10%胎牛血清）重悬细胞。
采用淋巴细胞分离液进行成年猪胰岛细胞纯化的研究
灌注充分的猪胰尾纯化后的胰岛 （ ４ ＊０） 图１成年猪胰腺的灌注和胰岛分离纯化结果 ２ 胰岛纯化前后的数量和当量结果如下 ： ） 纯化前胰岛收获量为 ： 岛数， 胰 ｇ 胰腺８ ４ ± ４ ８（Ｅ ： ２ ± ２９ ５ ８ １０ Ｉ Ｑ５ ３ ３６ ３ 个倌）； 纯化后胰岛收获量为 ： 岛数 腺７ ８ ±１９ ， （Ｅ ： ８ － ２ ８ 胰 胰 ８ ６ ６７ ＩＱ ９ ７ － ７ ４ ４ ２ ＋／ ｇ）。 ３ 所得胰 岛纯度很高 ，为９ ％以上。 ） ５
患者也是移植研究的—个热门方向。 文献报道成年猪和胎猪等的胰岛分离 、纯化较多，但是均存在Байду номын сангаас岛 纯度不高，试剂配制 比例不统一 、操作 复杂等问题；本研究将采用一种 淋 巴细胞分离液进行成年猪胰 岛的分离纯化 ，得到了纯度和量均较高的 胰岛，为进一步胰岛移植研究打下基础。
４）胰岛纯度测定 ：纯化后的胰岛计数 时，用显微镜下胰腺组织总 面积中胰岛的面积所占的 比 例定为纯度。 ５ 统计学处理数据采用均数五± 表示 ，使用Ｓ Ｓ １． ） ｓ Ｐ Ｓ ０ １ 软件分析处
ｉｄ ｉ ａ ｉ ｅ ［ ．ｅ Ｔ ａ ｓｌ ｔ ｉ ， ０ （２： － １ ｎ ｉ ｄ ｌｓ ｔ Ｊ Ｃ ｌ ｒｎｐａ ａ ｏ ２ ３１） ３ ４ ． ｖ ｕ ｌｓ ］ ｌ ｎ ｔｎ ０ ３
作 者简 介 傅红 兴 （ ９９ ），男 ，讲 师 ，长期从 事微囊化胰 岛移植研究 。 １７ 一
理。
３ 结 果 １ 灌注充分的胰腺外观呈葡萄状 ；采用新的纯化液纯化 ， ） 得到 的 胰 岛量很多，而且纯度非 常高 （ 图１ 如 ）。
１ 动物 、试剂 与器材
１ 动物 ： ） 成年杂种猪 ，雌雄不限 ；猪龄６ ７ ，体重１ ～ ０ｋ ， ～Ｂ ０ ２ ０ｇ ０ 温州篮子集 团禽畜屠宰场提供。 ２）试剂 ：胶原酶Ｖ ｓ ｍａ ｉ 公司 ；双硫 腙 （ Ｔ ｇ Ｄ Ｚ）上海 试剂三 厂 ； Ｆｃ ｌ Ｐ ｑ ｅ Ｌ Ｓ（ Ｅ Ｈｅｈ ｃｒ ｔ． ｉｏｌ ａｕ Ｔ Ｐ Ｕ Ｇ ａ ｈ ａｅＬｄ ）；ＨＥ Ｅ Ｓ ａ ｇ ａ ｍｙ — Ｍ Ｐ Ｓ（ ｈ ｎ Ｈ ｉ Ｍｄ Ｓｉ ｃ Ｔ ｃｎｌ ｉ ． ｄ）；青一 ｃ ｎｅ ｅｈｏ ｇ ｓ ｔ ｅ ＆ ｏ ｅＬ ． 链霉素溶液 （ ０ ｘ １Ｏ ）、Ｒ Ｍ １４ 吉诺 Ｐ Ｉ６０（ 生物 医药技术有限公司 ）；Ｄ 酶 （ ＮＡ 包头生物制剂公 司 ），Ｅ ｒ— ｏｉｓ ｕｏｃｌｎ ｌ 液、Ｈ ｎ ｓ ａｋ液、Ｄ Ｈａｋ ￣实验室 自制。 — ｎ￣ ３ ）实验器材 ：立式 电热压力蒸汽灭菌器 ：Ｌ Ｚ 一 ０ Ａ，上海 申安 Ｄ Ｘ ３Ｋ 医疗器械厂 ；电热恒温振荡水槽 ：Ｄ Ｚ ４０ ，上海森信 实验仪器有限 Ｋ －５Ｂ 公 司； 倒置显微镜 ： Ｄ 一 Ｂ Ｌ Ｍ Ｕ ；荧光显微镜 ：Ｏ Ｙ Ｐ Ｓ Ｘ Ｓ １ ，Ｏ Ｙ Ｐ Ｓ Ｌ Ｍ Ｕ ；光 学显微镜 ： Ｓ Ｏ ，Ｎｋｎ ＹＩ ０ ｉ ；洁净工作 台：Ｈ ＬＡ ｐｒ ｕ；低温离心机和 ｏ Ｄ ｐａ ｔ ａｓ 二氧化碳培养箱 ：Ｔ ｅｍ ｌ ｔｎＣｒｏａｏ 。 ｈｒｏ ｅ ｒ ｏｐｒ ｎ Ｅ ｃｏ ｉ ｔ
猪病的病理剖检诊断
猪病的病理剖检诊断一．尸体剖检的概念★是适用病理解剖学的知识，通过检查尸体的病理变化，获得诊断疾病的依据。
1．特点：（1）方便快速，直接客观。
有的疾病通过病理剖检可一目了然予以确诊。
（2）可验证病死猪生前的临床诊断与治疗的正确性。
2．要求（1）具备病理生理，病理解剖，传染病及微生物等学科的知识。
（2）剖检时应做到全面客观地观察、描述并详细记录。
（3）防止病原的扩散和人为的传播，做好环境的消毒和尸体的无害化处理。
3．相关概念（1）尸冷：猪死后由于体内产热过程停止，尸体温度逐渐降至外界环境温度水平。
（2）尸僵：猪死后几个小时（3-6小时），从头部开始各部位的肌肉因痉挛性收缩而变得僵硬，各关节不能屈伸，尸体固定成一定的姿态。
该过程在10-24小时内完成，24-48小时尸僵按原来顺序开始消失，肌肉变质。
（3）尸斑：猪死亡后由于心脏和大动脉管的临终收缩及尸僵的发生将血液排挤到静脉内，并由于重力作用，血液流向尸体的底下部，组织呈暗红色，死后1-1.5小时出现，24小时左右发生溶血，组织染成污红色。
（4）血液凝固：猪死后不久，在心脏和大血管内的血液即凝固成血凝块。
（5）尸体自溶：指体内组织受到酶的作用而引起自体消化的过程。
如：胃肠道粘膜脱落。
（6）尸体腐败：指尸体组织蛋白由于细菌的作用而发生腐败分解现象，表现为腹围膨大、尸绿、尸臭。
二．尸体剖检的注意事项1．选择的场地应便于消毒和防止病原体扩散，最好在专设的解剖室内进行。
2．剖检人员应配备工作服、胶鞋、工作帽、一次性塑料手套和相应的器械。
3．病猪死亡后若需剖检应尽快进行以防尸体腐败。
4．为防病原扩散，可将尸体装入塑料袋内，也可用浸透消毒液的棉花球堵塞尸体的天然孔，并用消毒药液喷尸体表面各部。
5．剖检完毕，把尸体、垫料和被污染的土层一起放入坑内，撒上生石灰或喷洒消毒液后用土掩埋，有条件的也可焚烧。
6．运送尸体的车辆和绳索等用后要严格消毒。
三．尸体剖检的顺序及检查方法1．尸体剖检顺序为了全面而系统地检查尸体内外所呈现的病理变化，避免遗漏，尸体剖检应按照一定的顺序进行。
实验项目一猪骨髓间充质干细胞的分离和培养
猪骨髓间充质干细胞的培养与分离实验准备：器材：手术刀片，手术刀柄，剪刀，镊子，弯钳，5ml灭菌注射器，7号注射针头，10ml离心管，离心机，100mm培养皿，75ml培养瓶试剂：低糖DMEM（含有10%FBS,75μg/ml青霉素，50μg/ml硫酸链霉素）1000iu/ml青链霉素的PBS（生理盐水）(装入灭菌的洗瓶中)无血清低糖DMEM.2%台盼蓝染液材料采集：一，胎猪骨髓采集：【1】 1，无菌条件下从猪子宫内取出胎儿置入到保温瓶中，加入含有青链霉素的PBS或生理盐水中，立即送回实验室。
2，在无菌操作下取下左右股骨，除净肌肉、骨膜及股骨两端软骨组织；用PBS冲洗3-4次用灭菌生理盐水冲洗干净，在超净工作台内剥离肌肉和骨膜，得到完整的股骨。
立即用含有1.0ml DMEM+3000iu/ml肝素的注射器冲骨髓腔，迅速换上5号的针头将冲出的骨髓血轻轻吹打，再加入等量培养液（DMEM+10%FBS）稀释，然后以1:4比例缓慢加入到Percoll分离液（1.073g/ml）的表面，1000r/min 30min,小心吸取乳白色的有核细胞层。
目前用于分离MSCs的方法主要有密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和贴壁筛选法。
密度梯度离心法目前主要包括利用percoll分离液分离MSCs和利用淋巴细胞分离液分离MSCs两种。
Percoll密度梯度离心法根据细胞密度不同将细胞分为数层，因此得到的MSCs纯度较高，但是操作繁琐，而淋巴细胞密度梯度离心法虽得到的MSCs不及percoll密度梯度离心法得到的细胞纯度高，但是操作简单，且获得的MSCs增殖活性较强。
【13】来自:胎猪骨髓间充质干细胞核移植及核移植胚胎干细胞的分离取2-3月龄猪胎儿，在无菌操作下取下左右股骨，用含1000iu/ml青链霉素的PBS浸泡30min,除净肌肉、骨膜及股骨两端软骨组织；用PBS冲洗3-4遍；用吸有4ml а-MEM细胞培养液的一次性无菌5ml注射器刺入处理好的股骨的一端，冲出骨髓，然后用7号针头轻轻吹吸数次，使冲出的骨髓尽可能分散为单个细胞，100目滤沙过滤；1000rpm/min,离心5min,用а-MEM细胞培养液制成细胞悬液，计数后，调整有核细胞的密度为1-2x107/ml.,然后接种培养。
脾淋巴细胞分离
小鼠脾脏单个核细胞的分离一、实验目的1. 熟悉细胞分离的基本原理2. 掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法3. 掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法二、实验原理1.台盼蓝染色：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。
丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。
通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。
2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官。
人的脾脏位于左季肋区的后外侧部，呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。
三、实验材料小鼠手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板平皿，尼龙膜指套、研磨棒、吸管、试管、EP管、移液器和tipsPBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）细胞计数板0.2%台盼蓝染液8.显微镜四、实验步骤（一）取小鼠脾脏1.小鼠颈椎脱位处死——用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。
2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织。
（二）制备单个核细胞悬液：1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。
用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。
弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。
然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；3.弃去上清，弹散细胞沉淀，加PBS缓冲液至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
(放置冰上)4.取100uL至EP管中，进行计数和活力测定（建议5倍稀释）5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力（三）计算细胞浓度1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。
猪脾转移因子的制备及临床应用
猪脾转移因子的制备及临床应用乔宏兴;白静【摘要】本试验采用透析法提取猪脾转移因子(TF),并对其理化性质、生物活性、安全性进行了研究.结果表明,TF可增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能,体外抑菌结果显示金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌对转移因子敏感,而链球菌不敏感.对猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎分别使用TF(0.2、0.1、0.05 mL/kg)和药物进行治疗,结果表明使用0.1 mL/kg TF的剂量效果较好.%In this experiment,transfer factor was extracted by dialysis from porcine spleen and physics and chemistry nature, biological activity,safety testing was researched, the result showed that TF could enhance the phagocytosis of mouse peritoneal macrophages, TF was sensitive to Staphylococcus, E. Coli, Salmonella, but had little effects on Streptococci. We used TF(0. 2, 0. 1, 0. 05 mL/kg) respectively and drug treatment for porcine epidemic diarrhea and porcine circovirus? The result showed that 0.1 mL/kg use of the effect was better.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2011(038)007【总页数】3页(P203-205)【关键词】转移因子;巨噬细胞;抑菌【作者】乔宏兴;白静【作者单位】郑州牧业工程高等专科学校,河南郑州 450011;郑州牧业工程高等专科学校,河南郑州 450011【正文语种】中文【中图分类】S852.4转移因子(transfer factor,TF)是从致敏淋巴细胞中提取的一种可溶性不耐热的小分子肽,分子质量为3500～5000,56℃30min可灭活,低温保存数年活性不消失。
20100528 猪常见病原实验室检查及分离培养方法
病原名称
流行性腹泻病毒
样品种类
采样方法
采病仔猪空肠一段置灭菌的平皿中，刮取肠内容物及空肠粘膜，用含有1000U/ml青霉素和1000ug/ml链霉素的PBS液做5倍稀释制成悬液，4℃条件下3000rpm离心30min，取上清液，经0.22um微孔滤膜过滤，用于细胞培养接种。
圆环病毒病
病原名称
支气管败血波氏杆菌菌落不变红，直径约1－2cm，光滑、圆整、隆起、透明，略呈茶色；较大的菌落其中心较厚且凹陷，有的菌落在凹陷处有皱褶成茶褐色，对光观察呈浅蓝色。
分离多杀性巴氏杆菌的马丁琼脂平板，于37℃培养18－24h。多杀性巴氏杆菌菌落直径约1－2cm，圆整、光滑、隆起、透明，菌落单个或呈粘液状融合成菌苔。
圆环病毒
样品种类
采样方法
取病料（肺或和淋巴结），研磨粉碎（与PBS1：5），－20℃反复冻融3次，10000rpm离心15min，上清液用氯仿抽提3次，然后用灭菌的孔径为0.22um微孔滤膜过滤，分装，－70℃保存。用于接种细胞。
兰耳病
病原名称
PRRS病毒
样品种类
采样方法
采集病猪、疑病猪、新鲜死胎或活产胎儿组织的病料，哺乳仔猪的肺、脾、脑、扁桃体、支气管淋巴结、血液和胸腔液。木乃伊胎儿和组织自溶胎儿不宜进行病毒分离。用含抗生素的维持液（含2%胎牛血清的MEM营养液）做1：10稀释，4500 rpm离心30 min，经0.45nm滤膜过滤，上清液用MEM做1：30稀释，制成悬液，供分离病毒接种之用。
猪副伤寒
细菌名称
猪沙门氏菌
样品种类
采样方法
最好将死后12h内的猪整体送检。或无菌采取心血、肝、脾、淋巴结等，放置于30%甘油盐水中送检。
培养基
猪的病毒性传染病——猪圆环病毒2型感染
猪的病毒性传染病——猪圆环病毒2型感染概述猪圆环病毒2型感染(Porcine circovirus type 2 infection)是由猪圆环病毒2型所引起的一系列疾病的总称，包括猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎-肾病综合征(PDNS)、繁殖障碍、肺炎、肠炎、先天性震颤等。
1991年加拿大首次爆发该病，随后世界上许多国家和地区都有该病的报道。
在我国，2000年通过血清学调查证实了北京、河北、天津、江苏、上海等地的猪群中存在PCV2感染抗体。
2001年，与PCV2感染相关的猪断奶后多系统衰竭综合征开始在南方地区流行，2002年全国各地规模化猪场暴发猪断奶后多系统衰竭综合征，给我国养猪业造成了相当大的经济损失。
各地兽药厂家也一时束手无耻。
目前，本病已经遍及世界各养猪国家，已成为养猪生产中突出的问题之一。
近期研究表明，PCV2与猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、猪的流产和繁殖障碍、猪增生性坏死性肺炎(PNP)和猪先天性脑震颤(CT)等的发生密切相关。
PCV2常与猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)或猪细小病毒(PPV)并发感染或继发细菌感染，使患病猪病情加重，死亡率升高。
病原猪圆环病毒2型(PCV2)属圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)。
是一种小而无囊膜、二十面体、共价闭合、环状的单股DNA病毒，病毒粒子直径平均为17nm，分子量为0.58×106Da。
PCV2在氯化铯中浮密度为1.37g/cm3，蔗糖梯度离心的沉降系数为52S，对pH 3的酸性环境、氯仿作用或高温环境(70℃)有较强的抵抗力。
不凝集牛、羊、猪、鸡等多种动物和人的红细胞。
PCV2完整的基因组大小多数为1768bp，少数为1767bp。
各分离株之间核苷酸序列的同源性大于96％，而与PCV1分离株之间的核苷酸序列的同源性小于80％。
PCV1和 PCV2的ORF1的核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为83％和86％，而ORF2的仅为67％和65％。
生猪屠宰检疫中淋巴结的选择及剖检意义
２ ． ５慢性增生性淋巴结炎 淋巴结出现这种变化 ， 通常情况下是 由 于受到一些病理 的损害。 由于病灶周 围出现
了大量的结缔组 织， 这种情 况下就会使得淋 巴结出现增生和肿 大的问题， 同时淋 巴结会 呈现出苍白色或者灰 白色 ，切面为灰白色． 质地坚硬 ， 并且极具光泽 。 比如结核等一 慢性 疾病都会导致淋 巴结呈现这种现象。
的感染情 况进行反映。 一旦机体的局部组织
为明显。
要的意义， 这一系统所反应出的问题， 不仅 能够实现对肉品的卫生质量的判断． 同时也 是禽 畜发生疾病 的重要依据 。在生猪 屠宰 中， 对林 白系统 的检验是最基本也是最主要 的检疫方式，基层兽医必须掌握 这一技术 ， 才能使肉品的质量得到保证。 因此． 在实际
猪 。全身淋巴结都会呈现边缘出血现象 。
２ ． ８急性增生性淋巴结炎 如果猪患有副伤寒或者气喘病， 淋巴结 就会 出现松软、肿大、切面隆突、湿润、并 且其 中还有坏死的黄白色小点， 又称 “ 脊髓
这一部分又被称为肩前淋巴结， 位于肩 关节前方 ， 肩胛斜方 肌和 横突肌 的下方。 猪 前半部的大多数淋 巴液都会在此处聚集， 其
余部分则由颈深淋 巴结进行收集。 １ ． ３腹股沟浅淋巴结
或者灰色略显黄色， 呼吸系统的淋巴结通常
为青灰色。
样 变” ，因为整个淋巴结的色泽以及质地都
如脑髓一般。
结束语
２ ． ２淋巴结充血 淋巴结呈现充血的症状， 往往是炎症初
期 的反应 ，这一时期，淋巴结会 出现血丝、 肿胀 、 表面发红 以及变硬的情况， 同时切面 还会 呈现暗红色， 在按压的时候 ， 从其中会 渗 出血滴。 有 的切面则呈现弥散樱红色 ， 或 者周 边呈现樱红色。 ２ ． ３浆液性淋巴结炎
猪病病理剖检诊断技术在猪病诊断上的应用
摘 要：做好猪病病理剖检诊断，首先要对猪正常的组织器官有着熟练的认识，了解猪死亡后尸体变化，从而杜绝因死后变化而诊断错猪病变化。
同时，要深入的理解和认识猪的解剖特征、各种猪病特征变化以及各种常见病理变化，对于整个剖检诊断手序以及流程要明确认识，以此保证期剖检诊断效率，确保能够及时、有效的发现具有诊断价值的病变。
最后，将病猪的实际病理变化以及外部检查情况相结合，对猪病病理进行诊断。
本文从猪病病理剖检诊断技术在猪病诊断上的应用进行分析和研究，对如何提高猪病病理剖检诊断效率以及质量进行深入的探讨。
关键词：猪病；病理剖检诊断技术；应用猪病诊断技术通常情况下可以分为临床诊断、病理剖检诊断以及实验室诊断三个方面。
因多数猪病临床症状不够典型，只是单纯的通过临床诊断对猪病进行正确诊断相对比较困难，如果通过实验室诊断，则需要具备一定的设备条件，需要耗费一定的时间和精力。
所以，对病猪进行病理剖检诊断，可以通过病猪组织器官的病变特征进行诊断。
现如今，病理剖检诊断因相对比较简单、易操作，已经被广泛应用在我国的规模化猪场的猪病诊断中。
基于此，猪病病理剖检技术在猪病诊断上的应用有着极其重要的意义，不仅需要对猪各种组织器官具有一定的了解，还要掌握猪的解剖特征、死后变化等。
因此，要加大对猪病病理剖检诊断技术在猪病诊断上的应用研究，以供大家参考。
1 深入了解并熟悉掌握猪的解剖特征通过猪病病理剖检诊断技术对猪病的病理进行诊断，首先要深入了解并熟练掌握猪的解剖特征。
只有深入了解猪的解剖特征，才可以正确认识猪正常组织器官的形态、位置、大小以及色泽，保证对猪组织器官识别的准确率，避免在剖检诊断中发生识别错误的情况。
通常情况下，主要有以下几个方面：①猪是杂食性动物，且胃相对比较大，通常情况下其猪胃容量为5～8L。
除此之外，猪还具有许多的特征，比如，雌猪卵巢、盲肠基本结构等。
②猪的皮肤相对比较厚，其皮下组织具有大量的脂肪细胞，从而形成了相对比较厚的脂肪层；③猪的肌肉纤维相对比较细，肌肉颜色呈鲜红色，其股部、臀部以及颈部肌肉相对比较发达；④猪的淋巴结呈灰白色。
猪脾脏淋巴细胞分离
五、注意事项
• 往分离液加组织液时，要沿着管壁，缓慢
加入，避免它们互混。
• 密度梯度离心后，弃去上层血浆时，要尽
量轻，切勿打破形成的分层。
• 细胞计数时，要等量加入细胞悬液和台盼 蓝染液，结果也要2倍。
• 整个实验操作要尽量快，避免细胞过度死 亡。
思考题
• 1、台盘蓝染液如何配置？
• 2、你认为本次试验成败的关键因素是什么 ？应该怎样把握？
• 红细胞、粒细胞比重大，约为1.090，离心后沉于 管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分 层液比重，约为1.075，离心后漂浮于分层液的液 面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中；血小 板的比重最小，约为1.030，离心后浮于分层液上 面。
• 借助密度梯度离心，吸取分层液液面的细胞，就 可从外周血中分离到单个核细胞。
猪脾脏淋巴细胞分离与细胞计数
华南农业大学生命科学学院微生物学教研室 张玲华课题组
一、实验目的
• 掌握密度梯度离心的原理及方法 • 掌握细胞计数板的工作原理及使用方法
二、实验原理
• 聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液 (商品名为淋巴细胞分离液) ,比重 1.077±0.001 。
• 倾斜地缓缓地 将你的组织液 沿着管壁加入 分离液(5mL) 上层，避免互 混。
密度梯度离心
← 分离的对象 在取淋巴细胞层的方法上，可以采用吸掉上层的血浆，或者直接缓缓从中间 吸出约2mL的淋巴细胞层。
取淋巴细胞层
• 弃去上层血浆
• 将中间的淋巴 细胞层（约 2mL）移到新 的离心管中
加入Hank’s液
活细胞百分率 =
细胞总数
× 100%
三、实验材料
脾脏淋巴细胞分离方法
脾脏淋巴细胞分离⽅法⼩⿏脾脏淋巴细胞分离⽅法需要提前准备的材料：提前⾼压灭菌：⼿术器械，200⽬尼龙⽹，除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。
红细胞裂解液，六孔板，培养⽫，75%酒精，100ml烧杯，⽆菌注射器5-10ml，15ml、50ml 离⼼管，4mlEP管，离⼼机等。
1、配制的percoll⼯作液：配制15 ml100%percoll液（简称⼯作液）：13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备⽤。
2、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml70%percoll液（1.090g/ml）：2.1 ml⼯作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备⽤60%percoll液（1.077g/ml）：1.8 ml⼯作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备⽤50%percoll液（1.067g/ml）：1.5 ml⼯作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备⽤40%percoll液（1.050g/ml）：1.2 ml⼯作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备⽤30%percoll液（1.043g/ml）：0.9 ml⼯作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备⽤20%percoll液（1.031g/ml）：0.6 ml⼯作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备⽤找⼀只15ml离⼼管，从低到⾼（20% percoll液→70%percoll液）依次装⼊，装好备⽤。
3、⼩⿏脾脏细胞分离（1）颈椎脱⾅处死⼩⿏。
75%酒精浸泡10min（2）⽆菌条件下取出⼩⿏脾脏，去除筋膜等置于Hanks’ 液中，将脾脏放⼊2ml离⼼管中剪碎。
（3）将200⽬尼龙⽹置于六孔板上，⽤注射器头研磨，过程中不停加Hanks’ 液冲洗。
（4）收集脾细胞悬液置于离⼼管中，1500rpm 10min，弃上清。
生猪屠宰检疫中腺体和淋巴结的摘除
生猪屠宰检疫中腺体和淋巴结的摘除核心提示：河南省南阳市城区动物卫生监督所胡俊兰，张玉全，高力河南省南阳黄牛科技中心王海利根据国家有关规定，在生猪屠宰检疫中，应严格摘除三腺，即：甲状腺、肾上腺和病变淋巴结。
但仅摘除此三腺是不够的，其它腺体和根据国家有关规定，在生猪屠宰检疫中，应严格摘除三腺，即：甲状腺、肾上腺和病变淋巴结。
但仅摘除此三腺是不够的，其它腺体和淋巴结同样对人体无益。
摘除三腺的同时，也应摘除其它无益腺体和淋巴结。
其它腺体和淋巴结的内容、位置、大小、颜色、作用、危害、处理如下。
1 其它腺体和淋巴结唾液腺（分三对发达的腮腺、颌下腺和舌下腺）、胰腺、血淋巴结（水淋巴结）、扁桃体、胸腺、脾脏。
这些腺体和淋巴结随内脏或肉尸进入餐桌，有的人甚至将扁桃体和脾脏当作佳肴，这是习惯的误区。
胰腺、扁桃体、胸腺可作为生化原料。
2 其它腺体和淋巴结的结构、位置、大小、颜色2.1 唾液腺分为三对发达的腮腺、颌下腺和舌下腺。
由被膜和腺实质构成，被膜是一层疏松结缔组织，伸入腺实质，腺实质主要由腺泡和导管组成。
腺泡是腺体的分泌部，由一层椎体形腺细胞围成。
导管是分泌物排出的管道系统。
2.1.1 腮腺埋于耳根腹侧，下颌骨后缘的脂肪内，经下颌骨下缘转至面部，开口于第4、第5上臼齿相对颊黏膜上。
其范围较广，面积较大，重约300 g，呈三角形，棕红色。
2.1.2 颌下腺位于腮腺深面，颌下腺管在下颌骨内侧向前伸延，开口于舌系带两侧的口腔底的黏膜上，其大小如鸡蛋，致密，呈扁圆形，略带红色。
2.1.3 舌下腺位于舌体和下颌骨之间的黏膜下。
分为两部，前部较大，为多管舌下腺，其长而薄，后部为长管舌下腺，其短而厚。
2.2 胰腺具有明显的小叶结构，与唾液腺相似，其导管有两条，直接开口于十二指肠。
其呈三角形，重约500 g，呈灰黄色，柔软。
2.3 血淋巴结（水淋巴结）其分布在血管丰富处，如脊椎下、腰部两侧、腹腔、骨盆腔等处。
水淋巴结是在整个屠宰过程中，由于各种因素直接或间接作用于猪体，如：机械损伤、长途运输使机体过于疲劳、各种应激反应、电压电流过大等造成的浅表淋巴结水肿。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
加入Hank‘s液后，要混匀
为了彻底洗涤淋巴细胞的分离液 残留，一般需要重复洗涤一次。
计数
取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合
• 先在低倍镜 下找到中方 格区域，再 在中倍镜下 进行细胞计 数。
五、注意事项
• 往分离液加组织液时，要沿着管壁，缓慢
加入，避免它们互混。
• 密度梯度离心后，弃去上层血浆时，要尽
量轻，切勿打破形成的分层。
• 细胞计数时，要等量加入细胞悬液和台盼 蓝染液，结果也要2倍。
• 整个实验操作要尽量快，避免细胞过度死 亡。
思考题
• 1、台盘蓝染液如何配置？
• 2、你认为本次试验成败的关键因素是什么 ？应该怎样把握？
文献分析。
猪脾脏淋巴细胞分离与细胞计数
华南农业大学生命科学学院微生ห้องสมุดไป่ตู้学教研室 张玲华课题组
一、实验目的
• 掌握密度梯度离心的原理及方法 • 掌握细胞计数板的工作原理及使用方法
二、实验原理
• 聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液 (商品名为淋巴细胞分离液) ,比重 1.077±0.001 。
四、实验操作
• 破碎 • 分离 • 洗涤 • 计数
机械破碎（细胞筛） 密度梯度离心 Hank’s液多次离心 细胞计数板
破碎并过筛
• 剪一小块脾脏（先用Hank‘s液清洗掉表面 的杂物），置于细胞筛（放在平皿上）中， 用针头不断搓烂组织块，同时用Hank’s液 （5mL）将细胞洗到平皿中。
转移组织液
• 红细胞、粒细胞比重大，约为1.090，离心后沉于 管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分 层液比重，约为1.075，离心后漂浮于分层液的液 面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中；血小 板的比重最小，约为1.030，离心后浮于分层液上 面。
• 借助密度梯度离心，吸取分层液液面的细胞，就 可从外周血中分离到单个核细胞。
实验报告
• 标题
• 实验目的、实验原理、实验用品、注意事 项这些基本参考实验指导（word版）
• 实验操作可以按照自己的理解去写，尽量 简洁明了
• 实验结果及分析是重点，无论结果如何， 尽量真实表现，有问题说问题，有发现说 发现，有成就说成就，有建议说建 议。。。。
评分标准
• 出勤情况 • 感性材料，如报告工整，白细胞的观察结果图片 • 理性材料，主要是实验报告中的结果汇报及结合
细胞计数
数上不数下，数左不数 右。
大方格 中方格
细胞计数板
每个大方格的容 积是0.1mm3
细胞数量：
单个核细胞浓度（细胞数/ml)
= 4个大方格内细胞总数
4
×104×a (稀释倍数）
= 5个中方格内细胞总数 ×5 × 104×a (稀释倍数）
细胞活力检测：（死细胞被染成蓝色，活细胞不着色）
活细胞数
活细胞百分率 =
细胞总数
× 100%
三、实验材料
• 材料：猪脾脏 • 仪器：离心机，显微镜、超净工作台 • 用具：细胞筛、手术刀、手术剪、镊子、烧
杯、吸管，培养皿、细胞计数器、离心管、 肝素抗凝管 • 试剂：淋巴细胞分离液(比重1.077±0.001）、 无Ca2+、Mg2+的Hank's 液
注：Hank's 液为缓冲等渗液，类似营养液，保持细胞活性及完整性，可抵抗轻微的 酸碱变化。
• 倾斜地缓缓地 将你的组织液 沿着管壁加入 分离液(5mL) 上层，避免互 混。
密度梯度离心
← 分离的对象 在取淋巴细胞层的方法上，可以采用吸掉上层的血浆，或者直接缓缓从中间 吸出约2mL的淋巴细胞层。
取淋巴细胞层
• 弃去上层血浆
• 将中间的淋巴 细胞层（约 2mL）移到新 的离心管中
加入Hank’s液