【CN110016462A】从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910125091.4

(22)申请日 2019.02.20

(71)申请人 优睿赛思（武汉）生物科技有限公司

地址 430000 湖北省武汉市东湖开发区高

新大道666号生物创新园C6栋C6221室

(72)发明人 娄阳　吴海　

(74)专利代理机构 武汉河山金堂专利事务所

(普通合伙) 42212

代理人 胡清堂

(51)Int.Cl.

C12N 5/0781(2010.01)

(54)发明名称

从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋

巴细胞的方法

(57)摘要

本发明公开了一种从脾脏细胞中高效分离

单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，本发明利用

采用多重淋巴细胞表面标记物抗体的负筛选，以

及快捷的荧光标记抗原物质方法的建立和利用

荧光标记抗原物质来进行高特异性的筛选，从而

实现对单个抗原特异性B淋巴细胞的高通量快速

筛选，并且使最终获得抗体特异性B淋巴细胞的

阳性率从传统杂交瘤方法的不足5％，提高至

30％。所以，该方案不但能够极大程度缩短单克

隆抗体开发的时间，而且能够大大提高所获得单

克隆抗体的数量和多样性。权利要求书1页 说明书5页 附图3页CN 110016462 A 2019.07.16

C N 110016462

A

权　利　要　求　书1/1页CN 110016462 A

1.一种从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，所述脾脏细胞为经过普通抗原免疫的脾脏细胞，其步骤如下：

1)利用以生物标记的非B细胞淋巴细胞表面标志物抗体对脾脏细胞进行负筛选，再利用亲和素磁珠与磁性分离原理去除非B细胞，以提高脾脏细胞中B淋巴细胞相对丰度；

2)利用荧光标记的IgM多克隆抗体和预标记筛选用抗原，对步骤1得到的脾脏细胞进行进一步负筛选，以流式细胞技术去表面不表达IgG分子的B细胞，保留与预标记筛选抗原结合的目标淋巴细胞；

3)利用7-AAD进行分选，去除死细胞；

4)用流式细胞仪，进行单细胞的筛选，得到目标淋巴细胞。

其中，所述预标记筛选抗原为与小分子荧光染料偶联的普通抗原。

2.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述预标记筛选抗原为与包含亲和素的小分子荧光染料偶联且经生物素标记的普通抗原。

3.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述预标记筛选抗原的制备方法包括以下步骤：采用滴加方式进行偶联反应，分多次将包含亲和素的小分子荧光染料滴加到经生物素标记普通抗原中进行偶联，每次滴加后孵育使其偶联充分；其中包含亲和素的小分子荧光染料的用量为经生物素标记普通抗原的5倍以上。

4.根据权利要求2或3所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述预标记筛选抗原的制备方法还包括以下步骤：在包含亲和素的小分子荧光染料和经生物素标记普通抗原偶联完成后，根据偶联产物的大小，选择合适的分子筛离心管，除去未偶联的底物。

5.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述步骤1)为：以生物素标记的CD4单克隆抗体、CD8单克隆抗体和CD14单克隆抗体对脾脏细胞进行负筛选，再利用亲和素磁珠与磁性分离原理去除T淋巴细胞和单核细胞得到CD4、CD8和CD14阴性的脾脏细胞，提高B淋巴细胞的相对丰度。

6.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述步骤2)中荧光标记的IgM多克隆抗体为FITC标记的IgM多克隆抗体。

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