293、293T细胞培养及转染一点经验
293细胞转染操作方法
293细胞转染操作方法一、转染前的细胞培养准备1.1 细胞培养基的准备：使用DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培养基，添加10%胎牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素（Penicillin-Streptomycin）混合液，将其预先置于37摄氏度恒温培养箱中加热。
同时，准备冰上的无血清DMEM培养基。
1.2 细胞传代：将293细胞稳定传代到80%的密度，并将细胞分装到培养皿中。
培养皿通常使用直径为6 cm的培养皿。
1.3 细胞接种：将培养皿中的细胞用10 ml DMEM培养基吸取，将细胞均匀分布在一个新的培养皿中。
1.4细胞培养：将新的培养皿放入37摄氏度恒温培养箱中，在5%CO2和95%湿度条件下培养。
二、转染试剂的准备2.1 转染物质的选择：根据实验需求，选择合适的转染试剂，如磷脂体试剂（Lipofectamine 2000）、Calcium Phosphate（CaPO4）沉淀法、聚乙烯亚胺（PEI）等。
2.2转染载体的制备：将所需的转染载体提取并纯化，测定其浓度和纯度。
2.3试剂的稀释：按照转染试剂说明书的要求，将其稀释至适宜浓度。
三、转染操作的步骤3.1细胞处理：在进行转染操作前，需要将细胞从培养皿中用无酶消化的方式将其析出，溶于含血清和无血清的培养基中，计算细胞的数量和体积，用无酶消化的方式将其析出。
3.2细胞分装：将分装的细胞放入每个培养皿中，并用光学显微镜观察细胞的黑暗度和数量。
3.3准备转染混合物：将适量的转染载体与转染试剂混合，置于室温静置15-30分钟，使其相互作用发生。
3.4转染操作：将转染混合物均匀滴加到细胞上，用手轻摇培养皿以均匀涂抹。
转染时间通常为4-6小时。
3.5转染后处理：转染时间结束后，将细胞培养基进行更换，并在体外长时间培养。
四、注意事项4.1转染试剂和转染载体的选择：需要根据实验需求选择合适的试剂和载体，不同的试剂和载体对细胞的转染效率和细胞毒性有所不同。
293T细胞培养攻略
293T细胞培养攻略1.培养基准备293T细胞通常使用DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）作为培养基，配以10%胎牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin）。
在培养293T细胞之前，首先将适量的DMEM加热至37°C，并将相应数量的胎牛血清和抗生素加入其中。
2.细胞传代传代细胞是保持293T细胞健康生长和细胞性能的重要步骤。
当细胞达到80-90%的密度时，可以开始细胞传代。
首先，用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）将细胞培养瓶中的培养基洗涤一次，然后用0.25%胰酶/EDTA（乙二胺四乙酸）溶液将细胞溶解5-10分钟。
溶解后，加入与胰酶/EDTA液体相等的培养基，轻轻悬浮细胞，并将其移至新的培养瓶中。
将新的培养基加入新瓶中，以使其达到适当的细胞密度。
3.293T细胞的培养条件4.细胞转染293T细胞被广泛用于转染实验。
细胞转染是将外源DNA转运到293T 细胞中的方法，以研究基因功能或进行蛋白表达。
293T细胞的易于转染性质使其适合于多种转染实验，包括常规的钙磷法和化学法（如聚乙烯亚胺）以及电穿孔法。
在进行转染实验之前，应将细胞培养至80-90%的密度，并在转染之后对其进行恢复。
5.结束实验时的保存和冻存细胞在完成实验后，如果有需要保存细胞的需求，可以将293T细胞冻存。
为此，收集细胞，并用DPBS（无菌磷酸盐缓冲液）洗涤细胞。
然后，用0.25%胰酶/EDTA液解细胞5分钟，并加入相等体积的培养基以停止胰酶的作用。
将细胞离心，并以适当的速度冻存保护液（如10%DMSO和90%FBS）重新悬浮细胞。
将细胞悬浮液分装至冻存管中，并使用液氮保存。
总结：293T细胞是一种常用的细胞系，在生物医学研究中发挥着重要作用。
通过遵循上述培养攻略，可以获得高质量和可靠的293T细胞培养结果。
有针对性的细胞传代、定期更换培养基、温度和CO2的适当控制以及正确的细胞转染和细胞冻存步骤可以确保细胞的生长和稳定性，为细胞实验提供最佳条件。
293T细胞的培养[1]
![293T细胞的培养[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/d6a8872378563c1ec5da50e2524de518964bd36d.png)
293T细胞的培养[1]293T细胞的培养293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。
293T为贴壁细胞, 这种细胞对培养基的营养成分要求并不高。
培养条件为: 完全培养基: 高糖DMEM, 10%胎牛血清; 冻存液: 胎牛血清或完全培养基, 10% DMSO。
传代方法为:1．吸掉293T细胞培养瓶内的培养液;2．吸取适量的无Ca 2+和Mg 2+的PBS, 轻轻把贴壁的细胞洗两遍;3．加少量的0.05%胰蛋白酶-EDTA (一般25 cm2的培养瓶加1 ml, 75 cm 2的培养瓶加2~3 ml), 放到培养箱温育20 s;4．细胞消化完毕, 加适量培养液终止消化, 并吹打细胞, 制成均匀的细胞悬液;5．加足量的培养液, 分装到新的培养瓶中。
值得注意的是, 293T细胞的贴壁性不强, 轻微的干扰就可能使它们脱落。
所以, 在更换新鲜培养液或者用PBS冲洗的时候应该小心地添加新的培液进去, 以液体不冲打到贴壁的细胞为好。
传代的时候, 只需要用0.05%胰蛋白酶-EDTA即可轻松把细胞消化下来, 不需要消化很长时间。
有些同学反映293T细胞容易结团不易被吹打开来。
如果遇到这样的情况可以在加了胰蛋白酶温育一段时间后即拿1 ml移液枪反复轻轻吹打, 直至肉眼看不到大的细胞块为止, 然后加适量的培养液混匀, 这时候在显微镜下观察, 可见大多数细胞都是单个的, 只有少量的2~3个细胞聚在一起。
一般293T细胞可以长在塑料的培养瓶底面上直到90%融合, 再以1∶4~1∶8的比率传代。
合适的传代周期为2~3天。
传代过程中,消化的时间越短越好, 显微镜下观察到80%细胞脱落即可加培养液中止。
完成传代后放入培养箱前,应该把培养瓶或培养皿沿X、Y轴方向水平移动几下, 防止细胞都聚在中间或者四周。
冷冻293T细胞的冻存液可以用95%小牛血清加5%二甲基亚砜, 复苏率很高。
细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
细胞培养心得
目录293和293T293T细胞的培养心得293T细胞的培养与传代Jurcat细胞的传代悬浮细胞培养方法Jurcat细胞培养方法293T细胞的培养心得点击次数： 12 发表于：2008-08-24 23:25转载请注明来自丁香园来源：丁香园293T细胞差点被我养死，幸好我又将它起死回生，一点心得。
细胞传代：当细胞在细胞培养瓶内长满达到80％时就要传代，一传二，24小时后再传代。
48小时传就不好了，如果在24小时后细胞没有长到80％，应该换新的培养基，不然，培养基变黄，细胞脱落。
细胞消化：将细胞培养瓶竖立放置，吸走培养基，如果培养基中的脱落细胞较多，说明细胞现在很容易脱落，只要加入1ml的PBS+EDTA(0.02%)，来回轻微晃动培养瓶直到细胞完全脱落，加入10mlMEM(10%杭州四季青胎牛血清），混匀，不能吹打，分装2瓶，如果细胞没长满就脱落，则只需加入5mlMEM，不分装。
如果培养瓶中的细胞贴壁较牢固，培养基上清没有细胞脱落碎片，且细胞长满达到80％以上，吸走培养基，加入5ml 的PBS+EDTA(0.02%)，迅速轻微晃动，竖立培养瓶，吸走，加入1ml0.05%胰酶，37度消化不超过3min，细胞完全消化脱壁，取出加入10ml培养基轻微吸打混匀，分装2瓶。
培养基：MEM(GIBCO)+10%胎牛血清（杭州四季青）＋双抗293T细胞的培养与传代点击次数： 24 发表于：2008-08-25 20:47转载请注明来自丁香园来源：丁香园293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。
大家注意293T细胞的一个重要特性：室温下不贴壁，但37度时可以重新贴壁。
我的293T细胞时老板从美国千里迢迢带回来的，当时正是冬天，老板把瓶子放在大衣口袋里在飞机上折腾了两天，等拿到实验室已经看不到贴壁的细胞了。
细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
293T 细胞培养
精心整理293T细胞培养1.培养基:DMEM=丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml离心管，加5ml培养基，500g离心5min，弃上清，加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml左右，记得晃匀。
也不易打散。
悬浮的293T细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293T细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长,换液293T时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
12小时-24小时90%以上细胞贴壁。
293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比其它的经验：1、用大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取2、培养液要新鲜，每次只配1000ml，分为2-4瓶，不用的培养液，冻存在-20度，3、要及时传代，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全贴紧，总是多少有空隙的时候最好。
4、如果细胞贴壁不好，可能是消化过久，或是培养瓶不够干净，当然要除外细胞污染。
细胞的复苏：快速取出冻存的低代次293细胞，将其安放在底端1／2浸于37℃水浴中，轻轻晃动以加速融解。
在超净工作台中，以70％乙醇对细胞培养皿表面消毒，将细胞转移至75cm的细胞培养瓶中，加入10mL低代次293细胞培养基置于细胞培养箱内培养。
6～8h后待细胞贴壁更换培养基。
(1)利用低代次293细胞贴壁的特性，在复苏和传代时不离心，而是加入10mL培养基中和细胞消化液，培养6～8h，细胞贴壁后更换新鲜培养基，从而避免了离心剪切力对细胞造成的机械损伤；(2)在消化细胞时，振荡培养瓶，避免直接反复剧烈吹打细胞。
293细胞转染操作方法
293细胞转染操作方法293细胞是人类胚胎肾细胞中一个常用的细胞系，广泛应用于生物医学研究和生物工程领域。
细胞转染是在细胞外导入外源DNA或RNA分子，从而使目标细胞表达、产生特定蛋白或影响细胞功能的一种实验方法。
293细胞的转染操作方法如下：1.细胞培养和处理：a.293细胞的培养：将293细胞维持在培养基中，并常规进行细胞的传代培养，细胞密度应在对应的培养瓶内保持在适宜范围（通常为70-80%的瓶内细胞密度）。
b.细胞处理：将需要转染的293细胞培养至适宜的状态，通常为对数生长期的细胞。
2.转染试剂的制备：a.转染试剂的制备：根据转染试剂的类型，如钙磷共沉淀、电穿孔和脂质体介导转染等，选择相应的试剂制备。
b.转染试剂的优化：通过调整试剂的浓度、PH值、温度等参数，优化转染试剂的表现以达到最佳的转染效果。
3.转染操作：a.将培养好的293细胞均匀地分配到培养板或培养瓶中。
通常情况下，在转染前24小时适宜添加细胞培养液以维持适宜的细胞密度。
b.将目标DNA或RNA与转染试剂混合。
根据转染试剂的要求和实验的设计，将目标表达物与相应的试剂按照比例进行混合。
混合过程中避免产生气泡。
c.加入混合溶液到培养板或培养瓶中的293细胞中。
将混合溶液均匀地加于细胞上，轻轻摇晃培养瓶以保持溶液分布均匀。
置于恒温培养箱中；通常转染时间为4-6小时，有的转染时间会更长。
d.保持适宜的培养条件，转染后培养细胞至少24小时至72小时，以期获得最佳的表达或功能分析效果。
4.转染后的细胞处理：a.按照实验设计和操作需要，提取或处理转染后的细胞。
可以根据所需，对细胞进行蛋白抽提、RNA提取、药物处理等。
b.需要注意，转染试剂本身可能对细胞有毒性，因此需要对转染后的细胞进行相应的生存性分析，并优化培养条件以提高细胞的存活率和功能表达效果。
这是293细胞转染的一般操作方法。
具体操作时，需要根据实验设计和试剂选择进一步调整操作参数。
293T细胞
培养：90％的DMEM＋10％的胎牛血清培养37度培养箱（注：细胞贴壁很疏松，换液时要注意，否则很容易将细胞弄下来）
传代：当细胞在细胞培养瓶内长满达到80%时就要传代，一传几，根据细胞的团块大小及自己想接种的密度而定。
一般24小时后再传代。
48小时传就不好了，如果在24小时后细胞没有长到80%，应该换新的培养基，不然，培养基颜色发生变化，细胞贴壁就不好了。
消化：293细胞比较脆弱，所以避免用胰酶/EDTA类消化
有人用CS消化液：5 g KCl 2.2 g Na Citrate准确称量后，定容500ml dH2O，高压蒸汽灭菌，4度保存。
使用方法：将293细胞培养基倒掉后，加1-2ml CS液洗一遍细胞，留约1ml CS消化液覆盖细胞，37度或室温，根据不同实验室293细胞的状态，可自己调整消化时间，使用该CS消化液的优点之一就是，消化操作简便，因为可消化后直接接种到新鲜的培养瓶中，而不用洗掉CS消化液。
293T细胞转染
胰酶/EDTA 消化液 转染试剂（TransFast） 2）器材 20ul/200ul/1ml 微量移液器和 Tip 头 酒精灯 废液缸 血球计数板 涡旋振荡器 恒温水浴箱 台式离心机 35mm 培养皿 转染管 15ml 离心管 观察用倒置显微镜 荧光显微镜和 CCD
4. 实验步骤 细胞传代 (1) 试验准备：200ul/1mlTip 头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒 精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 (2) 弃掉培养皿中的培养基，用 1ml 的 PBS 溶液洗涤两次。 (3) 用 Tip 头加入 1ml Trypsin 液，消化 1 分钟（37。C，5%CO2 )。用
基继续培养 24－48 小时。
第二次细胞传代 1） 在转染后 24 小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情
况。 2） 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度 0.8X105 个细胞
/35mm 培养皿将细胞重新粉入培养皿中。 3） 在正常条件下培养 24 小时后按照染色要求条件固定。
转染条件优化可以参考 TransFast 的使用说明书。
而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般 的瞬时转染方法多采用脂质体法。 利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比 例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转 染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有 巨大的作用。
上图是本次实验采用的脂质体中阳离子组分的结构的示意图。 本次实验ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ用的脂质体是 promega 公司的 TransFast 脂质体试剂，它 是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用 的 293T 细胞优化的转染试剂。
293T 细胞培养
293T 细胞培养1.培养基: DMEM =丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37 度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml 离心管，加5ml 培养基，500g 离心5min，弃上清，加1ml 培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml 左右，记得晃匀。
3. 传代:吸出旧培基，加5mlPBS 洗一遍，用移液管加1ml 胰酶，洗一遍吸出，37 度放1min 左右计时，看到大片大片脱落了即加入新培基吹打，吹洗充分后，吸1ml加到事先加好10ml 新培育基的新瓶里。
293T 细胞是用5 型腺病毒75 株系转化，含有Ad5 E1 区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1 区缺陷互补细胞系。
293T 细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5 和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293T 细胞的大规模培养。
293T 细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM 中能生长很好。
一般来讲，1:10 传代后，一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。
悬浮的293T 细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293T 细胞在传代120 次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293 细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境,pH 值在6.9～7.1 时,可顺利贴壁生长, 换液293T 时动作要轻。
一般用高糖的DMEM 培养基。
2、传代：倒去废液，PBS 洗一次（轻），用0.02%EDTA 与0.25%Trypsin 消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin 作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM 终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
293、293T细胞培养及转染一点经验
qq ：439572370HEK-293是用DMEM 培养基培养吗？
HEK-293细胞是我在锐赛生物实验室做项目时常培养的细胞，DMEM+10%血清+双抗+谷氨酰胺，这类的细胞贴壁性不是太强，所以不要消化过久，容易损伤细胞。
状态较好的293细胞
细胞生长较快，一般1:3~1:5传代，30%~50%融合度2-3
天即可长满。
细胞状态不好后会变瘦、产生大量黑点（细胞碎片）。
网友咨询：我们这里的293转染质粒效率一直不高，
各种方法均试过了，很少能达到50%，老板说他在
国外做293转染很容易达到80%以上。
我想问一下哪里有好的293细胞卖？非常感谢。
答：293系列的细胞都是非常好转染的：注意点：
1.转染前细胞的铺板密度、细胞状态
2.转染的时间
3.转染试剂与质粒的比值
干扰载体转染293T 细胞48h 的图片，供参考。
293T 细胞生长速度更快，形态较293A 细胞小，贴壁性比293
细胞弱很多，消化时间更要注意，没培养过的刚接手细胞要在注意留种的同时多试验消化几次，掌握经验值。
293
细胞常用于腺病毒包装、293T
细胞常用于慢病毒包装。
293t细胞电转染条件
293t细胞电转染条件293T细胞是一类广泛用于在生物医学研究中表达重组蛋白质的细胞，其具有易于转染的优点，可以通过电转染等方法实现高效率的转染。
以下是293T细胞电转染的一些常见条件及注意事项。
1.细胞密度：293T细胞在转染前应达到80%的密度，这可以提高转染效率。
密度过高或过低均会影响转染效果。
2.质粒DNA：选用高质量的质粒DNA，应避免污染。
DNA质量不好、含盐离子等污染物质均会导致转染效率下降。
3.转染试剂：电转染试剂通常由DNA、细胞和电转染缓冲液组成，不同品牌的转染试剂组成可能不同。
4. 电穿孔仪：目前广泛采用的电穿孔仪为AMAXA品牌的Nucleofector®，根据细胞类型及目的有不同的穿孔条件，可以在AMAXA公司官网中查询。
5.转染时间：对电转染的转染时间尚无统一标准，需要结合实验室条件和试验要求等因素，进行参数优化。
6.电压和电容量：电压和电容量是影响转染效率的重要因素。
要根据细胞类型、质粒DNA和穿透液等试剂的要求进行调整。
7. 转染缓冲液：转染缓冲液是电转染的关键因素之一、目前常用的缓冲液有DMEM、Opti-MEM、PBS等。
应根据质粒DNA的要求选择合适的缓冲液。
8.孵育条件：在电转染后需要对细胞进行适当的孵育，以促进质粒DNA的表达。
9.转染后处理：电转染后需根据需要添加适当的选择抗生素，以筛选包含肿瘤抗原基因的细胞。
综上所述，293T细胞电转染具有高效、简单、经济且可重复的优点，成为目前最为常用的转染方法之一、在实验设计和参数优化时，需要注意选择合适的试剂和仪器，优化电压和电容等参数，合理选择转染后的处理及分析方法，以获得准确、可靠的实验数据。
293T细胞的培养[1]
![293T细胞的培养[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/40bc40de6137ee06eff918ce.png)
293T细胞的生长状态直接关系到包装病毒和转染的效率, 应尽量选择传代次数少, 培养总时间短的细胞。从细胞形态上看, 相差显微镜下观察立体感强并且形态良好的细胞产病毒率或者转染效率都很高。
虽然293T细胞的应用非常广泛, 几乎每个实验室都有一株自己的293T细胞株, 但是经常有同学提出: 为什么在正常的培养条件下, 细胞却很难传代下去, 包装病毒效率很低, 对转染效率也不满意呢？
事实上, 引起类似问题的元凶是一种生物界最小的原核细胞生物－支原体。支原体污染后, 它们不会使细胞死亡而是与细胞长期共存, 培养基不发生浑浊, 细胞无明显变化, 外观上给人以正常感觉, 但事实上细胞正在受到到多方面影响, 如引起细胞变形, 影响DNA合成, 抑制细胞生长等。我们曾经收集到四株分别来自四个不同实验室的293T细胞, 经检测均为支原体阳性, 令人惊讶的是这四株细胞都已经不是典型的293T细胞形态, 每两株之间比较竟然形状各不相同, 很难相信这是同一种细胞！这些支原体阳性细胞普遍传代周期长, 显微镜下观察细胞碎片多, 长期支原体感染已经使这些细胞羸弱不堪, 胞内DNA和蛋白质合成受到严重的影响。
293T细胞的培养
293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。
293T为贴壁细胞, 这种细胞对培养基的营养成分要求并不高。培养条件为: 完全培养基: 高糖DMEM, 10%胎牛血清; 冻存液: 胎牛血清或完全培养基, 10% DMSO。
传代方法为:
1．吸掉293T细胞培养瓶内的培养液;
2．吸取适量的无Ca 2+和Mg 2+的PBS, 轻轻把贴壁的细胞洗两遍;
3．加少量的0.05%胰蛋白酶-EDTA (一般25 cm2的培养瓶加1 ml, 75 cm 2的培养瓶加2~3 ml), 放到培养箱温育20 s;
293T细胞中包装慢病毒的方法
慢病毒包装实验方案实验步骤一、细胞培养1、用含10% FBS的H-DMEM培养基于37 °C、5% CO2培养箱中培养293T细胞，其中加100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和10 μg/ml ciprofloxacin防止支原体污染，2、待10cm皿中细胞融合度到80%左右，用0.25%胰酶消化293T细胞，分到两个6cm皿中，另一盘10cm 293T作同样处理，使细胞在接种之后的18-24 h达到70%融合度。
●注意事项293T细胞转染慢病毒24h之前，培养液中停止使用抗生素和ciprofloxacin，减少对病毒转染的影响；注意接种后的293T细胞密度，过高和过低的细胞密度都会导致转染后细胞死亡。
二、细胞转染3、每个6-cm培养皿在转染之前4 h用5 ml 不含血清的H-DMEM培养基换液，4、应用500 μl Optimum和14.18 μl Lipofactamine2000混匀于室温静置5 min，将500 μl Optimum、1.7 μg 慢病毒载体、1.13 μg psPAX2和0.57 μg MD2.G混匀配制成DNA mixture，然后与静置 5 min的Optimum/Lipofactamine2000混匀，于室温静置20 min后，将混匀后的mixture加入到培养基中。
5、6 h之后将培养基更换为含10% FBS的H-DMEM完全培养基，6、分别收集48 h、72 h和96 h的细胞上清液。
●注意事项①293T细胞容易脱落皿底，加H-DEME沿皿侧壁缓慢加入，并且边加边轻微摇晃使培养基均匀分布皿底防止细胞无培养基死亡②质粒换算要准确，③将mixture加入培养基中要边滴边摇晃培养皿使其mixture与培养基混匀，这样直至结束。
293t细胞电转染条件(一)
293t细胞电转染条件(一)293T细胞电转染条件在分子生物学中，293T细胞是常用的细胞系之一，特别适用于表达外源蛋白质或进行蛋白质亚细胞定位研究。
电转染是293T细胞中常用的基因转染方法之一，下面列出了电转染293T细胞的条件。
1. 细胞培养•293T细胞应在37℃、5% CO2下培养•培养基建议使用高糖DMEM（Dulbecco’s modified eagle’s medium）或高糖MEM（Minimum essential medium）等，含10%胎牛血清（FBS）和1%万能抗生素•细胞密度建议在80%以上2. 电转染条件•500 µl DMEM培养基中添加10 µg DNA（含目的基因），同时加入125 µl电转染缓冲液（如polyethylenimine（PEI）缓冲液等）•在室温下孵育20-30分钟•向细胞中加入转染混合液，并轻轻摇晃培养皿，均匀涂抹转染混合液•培养24-72小时后，进行蛋白质表达或其他实验操作3. 注意事项•电转染前将细胞培养至80%以上，以确保细胞数量充足•电转染前，DNA和缓冲液需充分混合，在室温下孵育至少20分钟，使DNA与缓冲液充分结合•电转染前，转染混合液需要先在6孔板或12孔板中进行前行测定，以确定最佳转染量和细胞存活率以上是电转染293T细胞的条件，希望能为进行293T细胞研究的科研工作者提供帮助。
4. 电转染试剂选择电转染293T细胞需要使用特定的试剂，下面列出了一些常见的试剂以及注意事项：•Polyethylenimine（PEI）: 可以快速高效地转染293T细胞，但需要注意浓度不要过高，否则会导致细胞死亡。
•Lipofectamine 2000: 能够高效转染293T细胞，同时对细胞毒性较小，但需要注意用量不要过高。
•Calcium phosphate（CaPO4）：转染成功率较PEI和Lipofectamine 2000稍低，但毒性较小，适用于一些特殊的实验操作。
293细胞转染操作方法
(用于将DNA转染入HEK293T细胞
使用手册
Cat. No. 18668-04 Size:0.4ml
常温运输,储存于4℃一产品介绍
英格恩生物公司(Engreen Biosystem Co,Ltd.是专业的转染试剂研发生产厂商。Entranster TM是英格恩生物公司研发合成的纳米聚合物转染试剂,该试剂采用纳米技术合成,是最新一代转染试剂。由于纳米技术的应用, Entranster TM -H在HEK293T细胞中转染效率最高的可以达到95%以上,同时有很低的细胞毒性。
DNA纯度不高建议采用OD260/OD280在1.8左右,无蛋白和RNA ,无内毒素DNA
转染24小时
后效率低
DNA与转染试剂比例不佳建议预实验优化
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稀释用溶液含血清或蛋白建议采用OPTI-MEM或无血清DMEM稀释。
质粒表达系统毒性大建议采用其他可靠质粒做阳性对照,比较转染结果
细胞密度太大建议减少细胞数量
注意:静置时间30分钟较15分钟,转染效率更高。
⑷将转染复合物加入到含细胞和完全培养基的培养容器上,轻柔混匀。
注意:①对本试剂,采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。②完全培养基可加抗生素。
⑸培养4-6小时后更换培养基,继续培养24-48小时。
注意:①如细胞没有毒性等不良情况,转染后4-6小时可不必更换培养基。不同细胞培养容器转染用量
6-well优化方案
每孔DNA的量0.5μg 1.5μg 3μg
每孔转染试剂量0.5μl 1.5μl 3μl
根据预实验的最优化条件,按培养器皿表面积比例应用到其他培养容器。
五常见问题与解决方案
问题可能原因解决方案
HEK-293T细胞转染操作步骤
在细胞培养板中以逐滴加入的方式，在每孔中加入 200 μl 转染复合 物。轻柔晃动 6 孔板，将转染复合物和细胞培养物混匀。 细胞继续培养 24-72h 后，进行病毒滴度检测。
在无菌管中加入 180 μl 稀释培养基。 加入 2 μg 质粒 DNA（按摩尔化学计量混合 1:2:2 比例的表达载体， 包装质粒和包膜质粒，体积共计 20μl)，轻柔混匀。
在上述 DNA 稀释液中加入 6μl X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent（转染试剂：DNA=3：1），轻柔混匀。 +15 至+25℃下孵育 15~30 min，形成转染复合物。
经优化的转染结 果。转染质粒： pGI DNA Transfection Reagent，DNA 和稀释培养基（如 Opti-MEM® I Reduced Serum Medium 或无血清培养基）孵育到室温 （+15 至+25℃）现方式做保护处理对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑并不能对任何下载内容负责
使用 X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent 转染 HEK-293T 细胞系 慢病毒生产的优化实验步骤
在转染实验前 18~24 小时，将 HEK-293T 细胞按照 5.0× 105 细胞/孔的 密度接种到 6 孔板中，每孔中含有 2ml 完全生长培养基（60~80%的细 胞汇集度）。细胞培养过夜。
293T细胞培养
293T细胞培养293T 细胞培养1.培养基: DMEM =丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37 度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml 离心管，加5ml 培养基，500g 离心5min，弃上清，加1ml 培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml 左右，记得晃匀。
3. 传代:吸出旧培基，加5mlPBS 洗一遍，用移液管加1ml 胰酶，洗一遍吸出，37 度放1min 左右计时，看到大片大片脱落了即加入新培基吹打，吹洗充分后，吸1ml加到事先加好10ml 新培育基的新瓶里。
293T 细胞是用5 型腺病毒75 株系转化，含有Ad5 E1 区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1 区缺陷互补细胞系。
293T 细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5 和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293T 细胞的大规模培养。
293T 细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM 中能生长很好。
一般来讲，1:10 传代后，一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。
悬浮的293T 细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293T 细胞在传代120 次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293 细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境,pH 值在6.9～7.1 时,可顺利贴壁生长, 换液293T 时动作要轻。
一般用高糖的DMEM 培养基。
2、传代：倒去废液，PBS 洗一次（轻），用0.02%EDTA 与0.25%Trypsin 消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin 作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM 终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
293Tcellculture将所用培养基,血清,胰酶转移至室温,放置30min
293T cell culture1.将所用培养基，血清，胰酶转移至室温，放置30min，紫外灭菌需用物品。
2.细胞汇合度80%-90%，进行传代（高倍镜下观察细胞与细胞之间的空隙）。
3.用5 ml 或10 ml的移液管吸出培养液，沿培养皿壁轻轻加入2-3 ml DMEM，“十”字形上下左右轻轻摇晃2次，洗去残留的血清，弃尽液体。
4.沿培养皿壁轻轻加入2-3 ml 0.25%的胰酶，让液体自左至右缓缓铺平。
转移培养皿至显微镜下，在高倍镜下观察细胞。
5.当细胞触角全部收回（约2 min）后，将培养皿放回超净台内，加入4-6 ml 完全培养基（DMEM + 10% FBS）终止反应。
环形吹下皿底的细胞，转移至15 ml 的离心管中，20 ℃，800 rpm离心5 min。
6.弃去上清，加入4 ml新鲜完全培养基（DMEM + 10% FBS），吹打混匀，转移细胞悬液至4个新培养皿中，每皿1 ml（1：4分），补加9 ml 新鲜完全培养基（DMEM + 10% FBS）。
7.在超净台内“十”字形上下左右混匀8-10 次，转移至培养箱内，“十”字形上下左右混匀5 次，细胞培养皿放在停下的地方，不再转移。
8.37 ℃，5% CO2，培养。
TRANSFECTION WITH FUGENE 61.转染前24h传代293T cells，共2皿，当细胞50%~80%融合时，开始转染。
2.配制DMEM+10%FBS 100ml，置于37℃预热。
3.配制质粒-OptiMEM（10cm/皿）：plasmids Weight of plasmids Volume of optiMEM6 (pMD2.G) 1.1μgpsPAX2 1.1μg11μl Target gene vector/ctrl vector 1.65μg4.配制Fugene-6-OptiMEM混合液（10cm/ 皿）：Fugene-6 OptiMEM19.8μl220μl注：Fugene-6和Opti-MEM混合后，静置5min；DNA-Opti-MEM和Fugene-6-Opti-MEM混合混合后，静置15min。
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qq ：439572370HEK-293是用DMEM 培养基培养吗？
HEK-293细胞是我在锐赛生物实验室做项目时常培养的细胞，DMEM+10%血清+双抗+谷氨酰胺，这类的细胞贴壁性不是太强，所以不要消化过久，容易损伤细胞。
状态较好的293细胞
细胞生长较快，一般1:3~1:5传代，30%~50%融合度2-3
天即可长满。
细胞状态不好后会变瘦、产生大量黑点（细胞碎片）。
网友咨询：我们这里的293转染质粒效率一直不高，
各种方法均试过了，很少能达到50%，老板说他在
国外做293转染很容易达到80%以上。
我想问一下哪里有好的293细胞卖？非常感谢。
答：293系列的细胞都是非常好转染的：注意点：
1.转染前细胞的铺板密度、细胞状态
2.转染的时间
3.转染试剂与质粒的比值
干扰载体转染293T 细胞48h 的图片，供参考。
293T 细胞生长速度更快，形态较293A 细胞小，贴壁性比293
细胞弱很多，消化时间更要注意，没培养过的刚接手细胞要在注意留种的同时多试验消化几次，掌握经验值。
293
细胞常用于腺病毒包装、293T
细胞常用于慢病毒包装。