流式细胞术基本原理详版(医学相关)
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所以横坐标表示的是 细胞的直径大小；纵 坐标表示的是细胞的 复杂程度。
两者相结合就能说明 细胞种类
13
二维等高图和密度图
14
Pseudo 3D Plot 假三维图与三维图
15
3D Plot
流式细胞仪如何获取细胞信号？
—FSC —SSC —FL
16
— 前向角信号（Forward Scatter，FSC）
17
前向角信号：细胞的大小
18
10
1000
Count Count
FSC
19
FSC
— 侧向角信号（Side Scatter， SSC）
20
10
1000
Count Count
SSC
21
SSC
FL
22
count
FL
23
FSC、SSC、FL
24
如何分离90°角内的各种荧光信号？
25
荧光染料
—吸收某一波长的光波后能发射出大于吸收光波 长的光波的物质
488n
激发光
>600nm
PI
26
荧光染料种类
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途
FITC
488
525
免疫荧光
PE(RD1) 488
575
免疫荧光
PerCP 488
670
免疫荧光
PI
488
620
DNA染色
ECD
488
620
免疫荧光
- Charged Plates
+
Single cells sorted into test tubes
34
几个概念
信号放大模式 信号类型 CV值 样本流速 激光延迟 液滴延迟 荧光补偿 阈值 门 对照
35
—信号放大
– PMT将光信号转换成电信号，调整PMT的电压， 信号强度将随之改变
3
目前流式细胞仪可以检测的类别
细菌
浮游生物
红细胞
DM：0.2μ m ——15μ m
单核细胞
4
淋巴细胞 中性粒细胞
5
流式细胞仪的基本构造
流动室与液流系统：将 细胞单个压入流动室
光学滤镜
信号收集与数据 处理系统
激光发射器 发出所需要的波长的激光
光源与光学系统
侧向散射光检测器
前向散射光检测器
6
流动室
— 空白对照：即不进行标记的细胞。主要用于确定待测 标本的基础荧光阈值或检测染色方法时候成功。
研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加 以定量
2
流式细胞仪的特点
单个细胞/生物颗粒分析 同时多参数、多荧光分析 高通量检测/高速度 10000个细胞/秒以上 定性/定量分析 分选特定性状或功能的细胞 可检测的样本种类多样
(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体 组织，培养细胞 (2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液
流式细胞术基本原理
陈晓东 产品技术专员
广州市珈源医学试剂有限公司
流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种 可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒 （通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特 定群体加以分选
研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生 物、及人工合成微球等
光信号
光电倍增管（PMT）
电信号
放大器
放大器两种放大方式： 线性放大（lin） 对数放大（log）
36
线性放大（lin）
—按光强度的线性关系输出信号.适用于在较小 范围内变化的信号以及代表生物过程的信号， 如DNA含量、总蛋白含量等。
37
对数放大（log）
—按光强度的对数关系输出信号.在免疫学测量 中通常使用对数放大。
阴性对照
理想状态
实际情况
补偿效果
46
阈值
— 信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于
碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要
的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。
屏蔽ຫໍສະໝຸດ Baidu音信号和碎片信号
47
门（Gate）
— 分析/分选感兴趣的细胞群
48
对照
— 同型对照：为没有特异性、与荧光抗体蛋白亚型一致 的免疫球蛋白，通常是未进行免疫小鼠血清的纯化 IgG1或IgG2，用于检测和消除（一抗）非特异性结合 到组织细胞而产生的背景染色。
30
封闭式光路（CantoⅡ、LSR系列、Aria系列）
31
分选
—将目标细胞 分离并富集 ，进行后续 研究。
—分选纯度 >99%
32
震荡
激光
33
偏转板
Fluorescence Activated Cell Sorting
488 nm laser
FALS Sensor Fluorescence detector
—低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析， 如DNA分析。
42
激光延迟（laser delay）
Laser 1 Laser 2
43
液滴延迟（drop delay）
44
颜色补偿
—采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成 的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时， 都需要作颜色补偿。
45
—FITC主要由FITC的检测器检测，但部分光也会 进入PE检测器。如果单染FITC，同时打开PE检 测器，则如图：
—前向角散射信号（FSC） 反映细胞大小
—侧向角散射信号（SSC） 反映细胞颗粒度
—荧光信号（FL Signals）（FL1、2、3……） 胞内、胞外染色情况
11
流式细胞仪显示图的种类
FSC和SSC 直方图
12
散点图
把前向散射光图和侧 向散射光图的一维图 像在二维图像上投影， 便是我们平常所看到 的流式图。
38
电脉冲信号类型
—将与电脉冲信号 强弱相关的电压 数字化
—有三类电脉冲信号 – 高度信号H – 面积信号A – 宽度信号W
39
CV值
CV值（变异系数）： 样品均一度及仪器分辨率的标志
CV值一般<2%
40
样本流速
41
样本流速选择
—高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采 集速度快,但分辨率低.
PeCy5 488
675
免疫荧光
APC
633
670
免疫荧光
DAPI
359
462
DNA染色
颜色 绿色 橙色 红色 橙红 橙红 红色 红色 蓝色
27
荧光染料光谱特征
28
荧光分离原则
— 在流式细胞仪中，一般经过LP或SP滤片将荧光大 致分开后，再经过一BP滤片分离出特征荧光
29
流式细胞仪的光路
开放式光路 Calibur、Influx
Injector Tip
鞘液
荧光信号 聚焦的激光光束
7
光学滤片
— 当光子遇到滤片时，光子或通过滤片，或被滤片吸收 ，或被滤片反射。
8
光学滤片的种类
长通滤片（LP）：630LP 短通滤片（SP）：550SP 带通滤片（BP）: 488/10
9
10
流式细胞仪可获取的信号种类
共有两类：散射信号与荧光信号
两者相结合就能说明 细胞种类
13
二维等高图和密度图
14
Pseudo 3D Plot 假三维图与三维图
15
3D Plot
流式细胞仪如何获取细胞信号？
—FSC —SSC —FL
16
— 前向角信号（Forward Scatter，FSC）
17
前向角信号：细胞的大小
18
10
1000
Count Count
FSC
19
FSC
— 侧向角信号（Side Scatter， SSC）
20
10
1000
Count Count
SSC
21
SSC
FL
22
count
FL
23
FSC、SSC、FL
24
如何分离90°角内的各种荧光信号？
25
荧光染料
—吸收某一波长的光波后能发射出大于吸收光波 长的光波的物质
488n
激发光
>600nm
PI
26
荧光染料种类
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途
FITC
488
525
免疫荧光
PE(RD1) 488
575
免疫荧光
PerCP 488
670
免疫荧光
PI
488
620
DNA染色
ECD
488
620
免疫荧光
- Charged Plates
+
Single cells sorted into test tubes
34
几个概念
信号放大模式 信号类型 CV值 样本流速 激光延迟 液滴延迟 荧光补偿 阈值 门 对照
35
—信号放大
– PMT将光信号转换成电信号，调整PMT的电压， 信号强度将随之改变
3
目前流式细胞仪可以检测的类别
细菌
浮游生物
红细胞
DM：0.2μ m ——15μ m
单核细胞
4
淋巴细胞 中性粒细胞
5
流式细胞仪的基本构造
流动室与液流系统：将 细胞单个压入流动室
光学滤镜
信号收集与数据 处理系统
激光发射器 发出所需要的波长的激光
光源与光学系统
侧向散射光检测器
前向散射光检测器
6
流动室
— 空白对照：即不进行标记的细胞。主要用于确定待测 标本的基础荧光阈值或检测染色方法时候成功。
研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加 以定量
2
流式细胞仪的特点
单个细胞/生物颗粒分析 同时多参数、多荧光分析 高通量检测/高速度 10000个细胞/秒以上 定性/定量分析 分选特定性状或功能的细胞 可检测的样本种类多样
(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体 组织，培养细胞 (2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液
流式细胞术基本原理
陈晓东 产品技术专员
广州市珈源医学试剂有限公司
流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种 可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒 （通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特 定群体加以分选
研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生 物、及人工合成微球等
光信号
光电倍增管（PMT）
电信号
放大器
放大器两种放大方式： 线性放大（lin） 对数放大（log）
36
线性放大（lin）
—按光强度的线性关系输出信号.适用于在较小 范围内变化的信号以及代表生物过程的信号， 如DNA含量、总蛋白含量等。
37
对数放大（log）
—按光强度的对数关系输出信号.在免疫学测量 中通常使用对数放大。
阴性对照
理想状态
实际情况
补偿效果
46
阈值
— 信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于
碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要
的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。
屏蔽ຫໍສະໝຸດ Baidu音信号和碎片信号
47
门（Gate）
— 分析/分选感兴趣的细胞群
48
对照
— 同型对照：为没有特异性、与荧光抗体蛋白亚型一致 的免疫球蛋白，通常是未进行免疫小鼠血清的纯化 IgG1或IgG2，用于检测和消除（一抗）非特异性结合 到组织细胞而产生的背景染色。
30
封闭式光路（CantoⅡ、LSR系列、Aria系列）
31
分选
—将目标细胞 分离并富集 ，进行后续 研究。
—分选纯度 >99%
32
震荡
激光
33
偏转板
Fluorescence Activated Cell Sorting
488 nm laser
FALS Sensor Fluorescence detector
—低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析， 如DNA分析。
42
激光延迟（laser delay）
Laser 1 Laser 2
43
液滴延迟（drop delay）
44
颜色补偿
—采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成 的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时， 都需要作颜色补偿。
45
—FITC主要由FITC的检测器检测，但部分光也会 进入PE检测器。如果单染FITC，同时打开PE检 测器，则如图：
—前向角散射信号（FSC） 反映细胞大小
—侧向角散射信号（SSC） 反映细胞颗粒度
—荧光信号（FL Signals）（FL1、2、3……） 胞内、胞外染色情况
11
流式细胞仪显示图的种类
FSC和SSC 直方图
12
散点图
把前向散射光图和侧 向散射光图的一维图 像在二维图像上投影， 便是我们平常所看到 的流式图。
38
电脉冲信号类型
—将与电脉冲信号 强弱相关的电压 数字化
—有三类电脉冲信号 – 高度信号H – 面积信号A – 宽度信号W
39
CV值
CV值（变异系数）： 样品均一度及仪器分辨率的标志
CV值一般<2%
40
样本流速
41
样本流速选择
—高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采 集速度快,但分辨率低.
PeCy5 488
675
免疫荧光
APC
633
670
免疫荧光
DAPI
359
462
DNA染色
颜色 绿色 橙色 红色 橙红 橙红 红色 红色 蓝色
27
荧光染料光谱特征
28
荧光分离原则
— 在流式细胞仪中，一般经过LP或SP滤片将荧光大 致分开后，再经过一BP滤片分离出特征荧光
29
流式细胞仪的光路
开放式光路 Calibur、Influx
Injector Tip
鞘液
荧光信号 聚焦的激光光束
7
光学滤片
— 当光子遇到滤片时，光子或通过滤片，或被滤片吸收 ，或被滤片反射。
8
光学滤片的种类
长通滤片（LP）：630LP 短通滤片（SP）：550SP 带通滤片（BP）: 488/10
9
10
流式细胞仪可获取的信号种类
共有两类：散射信号与荧光信号