布病的实验室诊断

2013年上半年世界羊布鲁氏菌病分布图（引自OIE）
.ICDC, China CDC
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3
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世界卫生组织建议的人布鲁氏菌病诊断
• 世卫组织建议的检测包括： • 虎红平板试验(RBT) • 血清凝集试验(SAT) • Coomb`s试验 • 补体结合试验(CFT) • ELISA • 荧光偏振 • 布氏菌培养 • PCR
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血平皿 布氏菌菌落 15 布氏琼脂布鲁氏菌菌落
研究方法
VITEK2 全自动微生物生化分析仪
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布氏菌生化鉴定
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全自动微生物生化鉴定结果
➢借助VITEK2COMPACT全自动微生物分析系统建立了 一套布鲁氏菌的生化鉴定参考标准分型方法。 ➢完善布鲁氏菌生化鉴定数据库。 ➢鉴定布鲁氏菌速度快，可靠性高，确定布鲁氏菌 属的鉴定指标为L-脯氨酸芳胺酶（ProA）、酪氨酸 芳胺酶（TyrA）、尿素酶（URE）、氨基乙酸芳胺 酶（GlyA）；区分羊种布氏菌的指标为ELLMAN （ELLM）；区分牛种布氏菌的指标为乳酸盐产碱 （1LATK）；区分猪种布氏菌指标为丙氨酸-苯丙氨 酸-脯氨酸芳胺酶（APPA）. . ➢当鉴定为人苍白杆菌时，18 需与布鲁氏菌进行鉴别。
. PPV和NPV等）
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Amsterdam, The Netherlands www.kit.nl
WHO人布鲁氏菌病的诊断检测
保健点
诊断机构 参比实验室
IgM/IgG侧向层析检测 荧光偏振检测 虎红平板试验 血清凝集试验 2-ME 试验 IgM/IgG ELISA 库姆斯 (IgG) CFT 培养 （仅在BSL-3中） PCR
检测BCSP31基因的PCR方法，可以在属的水 平上检测和鉴定布鲁氏菌菌株
OIE推荐鉴定布鲁氏菌种的方法之一
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布鲁氏菌属BCSP31-PCR电泳结果
M 1 2345 6
-----223bp
M DL2000 DNA Ladder
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1。B. melitensis 2. B. abortus 3. B. s2u4is 4. B. ovis 5. B. neotomae 6.B. canis
布鲁氏菌病概况
➢ 布鲁氏菌病（以下简称布病）是一种全球分布的由布氏 菌引起的人兽共患传染病。
➢ 布氏菌通过皮肤粘膜、消化道、呼吸道等途径浸润人体 而出现发热、关节痛、乏力、多汗为主的临床症状，可 以造成骨关节、免疫、消化、循环、神经等多系统损害， 其临床表现复杂多变，无特异性。
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1
全球布鲁氏菌病疫情
病原特征
羊种菌为人主要致病菌
染料抑
血清凝集
噬菌体裂解
生
菌
种
物 型
H2S 硫 复
A
M
R Tb Wb BK2
堇红
1 - ++ - + - - - +
羊 2 - ++ + - - - - +
3 - ++ + + - - - +
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19
病原特征
30000 25000 20000 15000 10000
5000 0
自动化设备
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培养特性
专性需氧，生长缓慢 生长温度20-40℃，最佳生长温度35-37℃，
pH6.6-7.4，马耳他布鲁氏菌和某些牛种菌需要较 严格的5%-10%CO2。 布鲁菌属对营养要求较高，生长中需要各种氨基 酸、离子、烟酸和生物素，有点菌种需要血清或 全血才能生长
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布鲁氏菌培养与鉴定
➢ 1985年WHO布鲁氏菌病专家季员会把布氏菌属分为6个种19 个生物型。羊种（1 ～3型）、牛种（1 ～9型）、猪种（1～ 5型）及绵羊型副睾种、沙林鼠种、犬种各1个生物型。
➢ 中国已分离到14个生物型，即羊种（1～3型），牛种（除5 型以外的7个型），猪种（1.3型），绵羊副睾种和犬种各1 个型。
• 世卫组织未具体确定流程、取舍值和检测特征（诊断灵敏性和特异性） • 没有明确的阳性和阴性预测值（PPV & NPV）
结论
➢ 取舍值（及灵敏性/特异性）因抗原来源和流程差异而不同，有待优化 ➢ PPV和NPV取决于疾病的流行程度，有待确立
建议
➢ 开展检测前，应在设计适当的环境中确定诊断功效（灵敏性、特异性、
1963
羊3型为主
发病数
发病率
2.5
1969-1971 羊1型为主
2
2005
1.5
1
0.5
0
1950 1955 1960 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995 2000 2005 2008
300 250 菌数 200 150 100
50 0
50年代
60年代
70年代
80年代
2）自动化培养：血培养瓶置全自动血培养仪中→ 有菌生长仪器报警→做鉴定
2、骨髓培养：
按临床骨髓穿刺法抽取骨髓，按照血液培养方法 培养。
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自动培养仪和培养瓶
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布鲁氏菌培养与鉴定
疑似布鲁氏菌时：抽取菌液少许，接种到血 琼脂培养基中，进行纯培养。要求一定生物 安全柜内操作！
生化反应进一步鉴定：
AMOS-PCR 鉴定布氏菌种
➢ 临床上以羊、牛、猪三个种意义最大，羊种致病力最强。多
种生物型的产生可能与病原菌为适应不同宿主而发生遗传变
异有关。
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8
布氏菌可被碱性染料着色，如革兰染色为阴性，姬姆莎染色 呈红色，布氏菌对染料吸收缓慢
布氏菌革兰染色
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10
布鲁氏菌的分离培养
1、血培养：
1）双相培养基：血液10mL注入双相培养基中 →37℃温箱培养→每48小时观察→无细菌生长继 续培养→培养至30日才发出报告。
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简易/快捷
灵敏性 +++
+++
++
++ ++
特异性 +++
+++
++
++ ++
+++ 参考 ++++
++
++
复杂/要求高 7
+++
++ ++ ++++ 参考 +++++
+++
布鲁氏菌病病原学
➢ 布鲁氏菌为革兰阴性短小杆菌，0.5-0.7×0.6-1.5nm，初次分 离时多呈球杆状和卵圆形，故称“布鲁氏菌”。菌体无鞭毛， 不形成芽胞，毒力菌株可有菲薄的荚膜。
90年代
2000后
羊1 羊3
年代
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1950年至今羊种菌型变迁2分0 布
羊 种 菌 菌 型 变 迁
冻干机设备
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菌种保存管
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BCSP31-PCR
Fra Baidu bibliotek
引物和扩增片段，产物223bp
Primer1：B4
5’-TGG CTC GGT TGC CAA TAT CAA-3’ Primer2：B5
5’-CGC GCT TGC CTT TCA GGT CTG-3’