植物组织培养 第3章 植物组织培养技术——灭菌方法、无菌操作技术(1)
植物组织培养基本技术
—
Fe SO4 ·7 H 2 O N a - Fe - E D T A FeCl3 · 6 H 2 O Fe2 ( SO 4 ) 3 N a2 - ED T A
K2 H P O4
M nSO 4 · 4 H 2 O ZnSO 4 · 7 H2 O NiCl2 · 6 H 2 O Zn ( 螯合体 )
MS
选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础 。 根据营养水平不同 , 培养基分为基本培养
组织 培 养 中 常 用 的 培 养 基 主 要 有 M S 、 W hite、 N6 、 B5 、 Heller 、 N it sch 、 M iller 和 SH
表3-1 几种常用培养基的配方 ( 1974 ) 2 830 463 — — — N6 ( 1968 ) 2 527 5 134 — — — B5 ( 1953) — — Heller ( 1972) 720 — 950 — Nitsc h 单位 : mg / L
中常用的氨基酸有丙氨酸 、 甘氨酸 、 谷氨酰胺 、 丝氨酸 、 酪氨酸 、 天冬酰胺 , 以及多种氨基酸
有机氮源 , 对植物外植体的芽 、 根 、 胚状体的生长 、 分化均有良好的促进作用 。 植物组织培养
3 1
培养基及其配制
29
丝氨酸和谷氨酰胺有利于花药胚状体或不定芽的分化 ; 半胱氨酸可作为抗氧化剂 , 防止培养材 料褐化 , 延缓酚氧化 。 另外 , 植物组织培养中还加入一些天然的 有机物 , 如椰 子乳 ( CM ) 、 酵母 提取液 ( YE ) 、
( 7) 铁
( 6) 硫
官发育和提高抗逆性 。 缺锌时 , 叶子变黄 , 或出现白斑 , 叶子小 。 ( 10) 铜 叶缘向上卷曲黄化 , 变厚变脆 ; 顶芽死亡 。 ( 12) 钼 ( 13) 钴 ( 二) 有机养分 ( 11) 硼
植物组织培养技术1(1)
（三）、植物组织培养的类型
根据培养方式：固体培养、液体培养
固体培养：将培养物放在含有琼脂等固化剂的培养基表面进行 培养。 液体培养：将培养物放在未加固化剂的培养基内培养，一般需 进行震荡，又称液体震荡培养。
固体培养
液体培养
固体培养、液体培养的特点：
(1)固体培养法
是最常用的方法。该方法简单，易行，但养
组织培养实验室的 设计与主要设备
二、仪器设备和器皿用具
（
1、超净工作台或接种箱 2、空调
一
3、除湿机或加湿器
）
4、恒温培养箱
常 见 仪
5、高压灭菌锅 6、冰箱 7、天平 8、显微镜
器
9、水浴锅
设
10、摇床与转床
备
11、蒸馏水发生器 12、酸度计
13、离心机
组织培养实验室的 设计与主要设备
（二）各类玻璃器皿
脱分化（dedifferentiation)：将已分化的不分裂的静止细 胞，放在培养基上培养后，细胞重新进入分裂状态。一个成 熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。
再分化（redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在一定 的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整植株 的过程。
植物组织培养学
植物组织培养实验室 构建及操作技术
本节教学目的与要求：
(1)掌握组织培养实验室的设计； (2)掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用
方法； (3)掌握调控组织培养的主要环境条件。 (4)掌握灭菌和消毒的区别； (5)掌握灭菌的不同方法和具体操作过程；
本节主要内容
商业性组织培养实验室和小工厂的 设计与主要设备 培养基及其配制 外植体的选择与培养 试管苗的驯化与移栽
3.植物细胞培养（植物组织培养）
3.植物细胞培养（植物组织培养）第三章植物细胞培养植物细胞培养：指对从植物器官或由愈伤组织上分离的单细胞（或⼩细胞团）进⾏培养，形成单细胞⽆性系或再⽣植株的技术。
Haberlandt（1902）⾸次尝试分离和培养植物叶⽚单细胞。
细胞培养的意义有利于进⾏细胞⽣理代谢以及各种不同物质对细胞代谢影响的研究。
进⾏细胞培养，通过单细胞的克隆化，即称为“细胞株”（cell line），可以把微⽣物遗传技术⽤于⾼等植物以进⾏农作物的改良。
细胞培养的增殖速度快，适合⼤规模悬浮培养，⽣产⼀些特有的产物，如许多种植物的次⽣代谢产物，包括各种药材的有效成分等，⽤于医药业、酶⼯业及天然⾊素⼯业，这是植物产品⼯业化⽣产的新途径。
由于植物组织培养中细胞之间在遗传和⽣理⽣化上会出现种种变异，这些细胞形成的植株也都表现出⼀定的差异。
这种差异反映在它们的植株的形态、产量、品质、抗病⾍和抗逆性等⽅⾯。
所以由单细胞培养获得的单细胞⽆性繁殖系，并对不同的细胞进⾏研究，在理论上和实践上都有很重要的意义。
细胞培养就是从⾼等植物的某个特定的器官或组织中取得单个细胞进⾏培养，并诱导其分裂增殖，由细胞分裂形成细胞团，再通过细胞分化形成芽根等器官或胚状体，长成完整植株。
第⼀节植物细胞培养⼀. 单细胞培养(⼀)单细胞分离1.机械法2.酶解法3.从愈伤组织中分离(⼆)单细胞的培养⽅法1、平板培养（细胞的⽣长周期）2、看护培养3、微室培养 4. 条件化培养⼆. 细胞悬浮培养（⼀）悬浮培养的⽅法1、分批培养（细胞的⽣长周期）2、半连续培养3、连续培养——封闭型、开放型（化学、浊度恒定式）4、固定化培养（⼆）培养细胞的同步化1. 化学⽅法(饥饿法、抑制法、有丝分裂抑制法）2. 物理⽅法（分选、低温）（三）培养基振荡⼀、单细胞培养（⼀）单细胞的分离1.机械法: Ball(1965)⾸次由花⽣成熟叶⽚利⽤机械的⽅法使叶⾁细胞得到分离的技术。
⑴⼑⽚刮: 取下叶⽚→叶⽚消毒(75%酒精或7%次氯酸钠)→撕去下表⽪(露出叶⾁细胞) →⽤解剖⼑刮下细胞→单细胞悬浮培养⑵研磨离⼼法: 取下叶⽚→叶⽚消毒(75%酒精或7%次氯酸钠) →研磨匀浆(10g叶⽚+40ml研磨介质)→匀浆过滤(细纱布) →离⼼(先低速去碎屑) →游离细胞沉降到底部(净化细胞) →植株培养或悬浮培养研磨介质: 20µmol蔗糖+ 10µmol MgCl2 + 20µmol Tris-HCl (pH7.8)机械法的特点：⑴细胞不受酶的伤害；⑵不发⽣质壁分离。
植物组织培养技术
植物组织培养技术第一章绪论第二章植物组织培养实验室组成、仪器设备及无菌操作技术第三章植物组织培养基本原理第四章器官培养技术第五章植物胚胎培养第六章花粉及花药培养第七章细胞及原生质体培养第八章组培培养技术在中药学上的应用第一章绪论一、植物组织培养的概念1. 概念植物组织培养（Plant tissue culture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。
2.主要特征（1）在培养容器中进行；（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。
（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。
二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。
1、根据培养材料不同分为：（1）完整植株培养（Plant Culture）：对幼苗和较大植株等的培养。
（2）胚胎培养（Embryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。
（3）器官培养（Organ Culture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。
（4）组织培养（Tissue Culture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。
（5）细胞培养（Cell Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。
（6）原生质体培养（Protoplast Culture）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。
2、根据再生途径分为：（1）器官发生途径（Organogenesis）：直接器官发生途径：植物器官可以直接由外植体上诱导。
如茎尖培养。
间接器官发生途径：成熟细胞经过脱分化（dedifferentiation）及再分化（redifferentiation）过程而形成新的组织和器官的过程。
植物组织培养(1)
0.1.3 植物组织培养的研究类型和任务
• 组织培养：分生组织、形成层组织、薄壁组织、韧皮部组 织等。
• 器官培养：根、茎、叶、花、果实、种子。 • 胚胎培养：幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房等。 • 细胞培养：单细胞或较小细胞团，如性细胞、叶肉细胞、
1. Thimann和Wickson
• 1958年，他们发现腋芽（当顶芽存在时为休眠状态） 的生长，可以通过外源细胞分裂素的应用而启动。这 样，将茎段培养在含有细胞分裂素的培养基上，就可 以在一个具有完整顶芽的生长中的茎上诱导侧芽的形 成。这将消除顶端优势，得到大量不定芽。
Thimann
2. Morel－脱毒、快繁商业化
• 1922 年 ， 植 物 离 体 组 织 培 养 取 得 了 一 些 进 展 。 德 国 人 Kotte和美国人Robbins两人同时分别独立地将分生组织作 为外植体。Kotte研究切下的根尖，如豌豆、玉米根尖， 将它们放在含有Knop溶液盐成分、葡萄糖、含氮化合物 如天冬酰氨酸、丙氨酸以及肉汁的各种营养液中。Kotte 观察到根尖生长持续了2周，但他没有进行继代培养。另 一方面Robbins通过继代，将玉米根尖离体培养了更长的 时间，但随着时间延长，生长量减少，最后消失。
• 1952年， Morel和Martin提出了植物脱毒（virus free）技 术，通过分离已被病毒感染的大丽花个体的根尖，并将其 离体培养，重新获得了无病毒的大丽花。
• 1960年，Morel利用兰花茎尖培养，实现了脱毒和快速繁殖 （rapid clone propagation）的两个目的。这一技术导致欧 洲、美洲和东南亚许多国家“兰花工业”的兴起。
0.2 植物组织培养的形成和发展
实验二 灭菌、无菌操作技术
四、主要实验步骤 1、材料处理及外植体消毒； 室外的叶片→自来水下用软毛刷冲洗干净。如叶片上粘 附许多植物分泌物或其他物质，可以使用洗涤剂（洗衣粉 或洗涤灵）轻轻刷洗，干净为止。 体表灭菌在超净工作台上操作。 紫外照射15～20min→关紫外→工作送风15～20min。 实验台上准备好无菌水，灭菌的三角瓶，灭菌的镊子、刀 片、剪子等，回收氯化汞的容器。 沥干（或者用灭菌的滤纸吸干）植物材料上的水→70％ 乙醇溶液中灭菌15-30sec→无菌水冲洗3次→放入无菌三 角瓶→加入0.1%氯化汞溶液，计时3-6min→无菌水洗涤 6～10次。注意用过的氯化汞溶液以及前3次洗涤植物材料 使用的有污染的水回收到一个的三角瓶中，待处理。
六、注意事项 1、实验安全及实验室使用规则； 2、实验设备使用方法及损坏赔偿条例； 3、本次实验注意事项。 （1）材料消毒要掌握好时间、浓度，避免消毒不够或 过头； （2）酒精用70%-75%效果最好，外植体用酒精消毒时 间一般不超过半分钟； （3）植物激素用过滤灭菌法，不能高温消毒； （4）各种消毒剂处理后，要用无菌水冲洗干净； （5）高温高压灭菌时，注意锅底水位，压力上升至5磅 时要放气，灭菌结束，必须等锅内压力回到零时才能 打开锅盖，灭菌时须有人看守，注意异常情况；
6、整理及清洗； 将污染的培养瓶挑出，灭菌，清洗。 五、作业 1.实验报告（包括实验目的、设备、步骤、结果与 现象分析）； 2.课后思考 （1）什么叫外植体体表灭菌，常用消毒剂有哪些， 各有什么特点，要掌握什么原则？ （2）植物激素一般用什么方法消毒？为什么？ （3）无菌操作要注意哪些问题。 （4）如何区分细菌性污染和真菌性污染？
植物组织培养的基本方法
首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分 仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗，硬的材料用刮刀刮。
第二步是对材料的表面浸润灭菌。 第三步是用灭菌剂处理。 最后一步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3分钟左右，视采用
(二）培养步骤：
1．初代培养：即接种某种外 植体后，最初的几代培养。初 代培养旨在获得无菌材料和无 性繁殖系。初代培养时，常用 诱导或分化培养基，即培养基 中含有较多的细胞分裂素和少 量的生长素。初代培养建立的 无性繁殖系包括茎梢、芽丛、 胚状体和原球茎等。
的方法 。该法设备简单，易行。但养分分布不均，生长速 度不均衡。并常有褐化中毒现象发生。
2．液体培养法 即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液
体中氧气含量较少，常需要通过搅动或振动培养液的方法以 确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养， 其速度一般为50～100转／分，这种定期浸没的方法，既能 使培养基均一，又能保证氧气的供给。 静止培养：滤纸桥培养 振荡培养：磁力搅拌器、摇床、自旋式培养架
7. 植物材料表面用消毒剂灭菌
外植体的选择:
外植体部位：不同植物以及同一植物的不同器官对诱导条件 的反应不一样；
取材季节：大多数植物应该在生长开始的时候采集； 器官的生理状态和发育年龄：幼年组织比老年组织具有较高
的形态发生能力； 外植体大小：茎尖培养中，外植体越小成活率越低。
外植体的灭菌方法:
常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类。 物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常
压或高压蒸煮）、射线处理（超声波、微 波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施。
植物组织培养技术(一)
应用领域
• 1、快速繁殖 运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几 万到几百万个植株。例如一株葡萄一年繁殖到3万多株，一株兰 花一年繁殖到400万株。 2、种苗脱毒 针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织 培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。已经取得成功的有马 铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。 3、远缘杂交 利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得 成功，从而育成一些罕见的新物种。比如辽宁果树研究所利用这 种方法获得苹果与梨的杂交种。 4、突变育种 采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、 抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。象中国林科院用逐 步加大培养基中盐的浓度，直接获得耐盐的杨树株系。 5、基因工程 基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后 必须通过组织培养途径才能实现植株再生。 6、生物制品 有些极其昂贵的生物制品，如抗癌首选药物--紫 杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。近年国内在红 豆杉组织培养中获得生长量高达0.49gFW/（gFW· d）的细胞系， 每升细胞培养物中紫杉醇的产量可达0.25mg。
第二章 组织培养实验技术
第一节 实 验 室
在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需 要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地 制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室 的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目 的，实验室规模太小，则会限制生产，影响效率。在 设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来没计， 避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培 养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件， 需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制 温度、光照、湿度等培养条件。
培养基的种类
• 培养基有许多种类，根据不同的植物和培养部位及不同的 培养目的需选用不同的培养基。 • 培养基的产生最早是Sacks(1680)和Knop(1681)，他们对绿 色植物的成分进行了分析研究，根据植物从土中主要是吸收 无机盐营养，设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液， 至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。以后根据 不同目的进行改良产生了多种培养基，White培养基在40年 代用得较多，现在还常用。而到60和70年代则大多采用MS 等高浓度培养基，可以保证培养材料对营养的需要，并能生 长快、分化快，且由于浓度高，在配制、消毒过程中某些成 分有些出入，也不致影响培养基的离子平衡。 • 培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字 来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基(简称MS 培养基)，也有对某些成分进行改良称作改良培养基。
植物组织培养实验(1)
实验报告内容
实验名称 实验目的 实验原理 实验材料和用具 实验步骤 实验结果与分析
2. 分装。将培养基分装到8个50ml三角瓶中，培养 三角瓶中， 分装。将培养基分装到8 50ml三角瓶中 基厚度约为5mm。做好标记。 基厚度约为5mm。做好标记。 3. 灭菌。用高压蒸汽灭菌锅在121℃、 0.1MPa条件 灭菌。用高压蒸汽灭菌锅在121℃ 0.1MPa条件 下灭菌15～20min。操作按仪器操作步骤进行。 下灭菌15～20min。操作按仪器操作步骤进行。 灭菌后待压力下降到0Pa时取出 凝固后待用。 时取出， 灭菌后待压力下降到0Pa时取出，凝固后待用。
（三）实验材料和用具
实验材料： 实验材料：黄瓜种子 实验药品：灯用酒精、 70％酒精、 95％酒精、 实验药品：灯用酒精、 70％酒精、 95％酒精、 0.1％氯化汞，吐温-80，无菌水。 0.1％氯化汞，吐温-80，无菌水。 灭菌培养基： 灭菌培养基：MS 实验用具：无菌室、无菌滤纸、无菌培养皿、 实验用具：无菌室、无菌滤纸、无菌培养皿、烧 解剖刀、镊子、剪刀、酒精灯、酒精棉花、 杯、解剖刀、镊子、剪刀、酒精灯、酒精棉花、 滴管、记号笔、废液罐、火柴、光照培养箱。 滴管、记号笔、废液罐、火柴、光照培养箱。
当植株的其他部位难以消毒时，可以选用 当植株的其他部位难以消毒时， 种子， 种子，消毒后的种子在无菌条件下播种到 含有水－琼脂培养基上或1/10 MS培养基上 含有水－琼脂培养基上或1/10 MS培养基上 使其发芽。将无菌培养的幼苗切成小片， 使其发芽。将无菌培养的幼苗切成小片， 作为外植体。 作为外植体。
作业
1. 1 周后观察灭菌培养基有无污染 ， 计算污 周后观察灭菌培养基有无污染， 染率（染菌瓶数/总瓶数×100％ 染率（染菌瓶数 /总瓶数 ×100％ ），分析 染菌原因。 染菌原因。 2. 1 周后观察初代培养体系有无污染 ， 计算 周后观察初代培养体系有无污染， 每一瓶内染菌外植体数和外植体外的菌落 分析染菌原因。 数，分析染菌原因。 3. 1 周 后 观 察 种 子 发 芽 情 况 ， 计 算 发 芽 率 （发芽种子数/种子总数×100％）。 发芽种子数/种子总数×100％
植物组织培养技术
植物组织培养技术植物组织培养（Plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官（根、茎、叶、花等）、组织（如形成层、花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞），以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株，统称为植物组织培养。
植物组织培养的过程可概括为：外植体脱分化或完整植株胚状体茎尖、胚及子房等器官做外植体可不经脱分化直接形成试管苗。
植物组织培养技术是生物技术的重要组成部分，在生产实践及基因工程、遗传转化等研究中有重要应用前景。
植物脱毒及离体快繁，花药培养与单倍体育种、幼胚培养与试管受精，抗性突变体的筛选与体细胞无性系变异，植物产品的工厂化生产等方面的研究和应用，均必须借助植物组织培养技术的基本程序和方法。
通过本实验，要求同学掌握植物组织培养操作技术；了解外植体脱分化及再生的过程；理解植物细胞全能性。
一、试材与用具1．植物材料：花生、烟草、苹果、大白菜、玉米等。
2．实验室：准备室、接种室、培养室等。
3．仪器设备：高压灭菌锅（器）、光照培养箱、振荡培养箱、天秤、酸度计、超净工作台等。
4．器械及用具：镊子、手术刀、接种针、细菌过滤器、记号笔等。
5．玻动器皿：三角瓶、培养瓶、培养皿、量筒、容量瓶等。
二、方法步骤（一）培养基的制备1．母液的配制在植物组织培养中，不同的植物，不同的器官和组织，不同的研究目的，使用不同的培养基，培养基尽管千差万别，按其性质和含量来分主要由以下几部分组成：①无机营养，包括大量元素和微量元素；②有机物质；③铁盐；④碳水化合物；⑤天然复合物；⑥激素；⑦琼脂（固体培养基）；⑧其他添加物。
在培养基的配制中，对各组分的成分，常先要按其需用量扩大一定倍数，配制成母液（表2－1）。
配制母液时应注意以下两个方面：（1）配制大量元素母液时，为了避免产生沉淀，各种化学物质必须充分溶解后才能混合，同时混合时要注意先后顺序，把钙离子（Ca2+）、锰离子（Mn2+）、钡离子（Ba2+）和硫酸根（SO42-）、磷酸根（PO43-）错开，以免形成硫酸钙、磷酸钙等沉淀，并且各种成分要慢慢混合，边混合边搅拌。
植物组织培养灭菌方法
植物组织培养灭菌方法
植物组织培养是一项重要的生物技术,培养基和植物组织在进行培养过程中需要保持清洁卫生。
以下是常见的灭菌方法:
1. 高压灭菌(High压力灭菌):这种方法使用高压蒸汽系统对培养基或植物组织进行灭菌,通常需要121-152摄氏度高压灭菌10-15分钟,杀死所有微生物和病原体。
这种方法适用于各种类型和形状的培养基和植物组织。
2. 低温灭菌(Low温度灭菌):这种方法使用低温系统对培养基或植物组织进行灭菌,通常需要130-160摄氏度低温灭菌60-90分钟,杀死所有微生物和病原体。
这种方法适用于杀死一些难以发现或难以繁殖的病原体,但需要注意避免损坏植物组织或培养基。
3. 化学灭菌(化学消毒):这种方法使用化学物质对培养基或植物组织进行消毒,通常使用氯气、氢氧化钠、过氧化氢等消毒剂。
这种方法需要谨慎使用,以免产生毒性气体或损害植物组织。
无论使用哪种灭菌方法,都需要注意保持适当的压力和时间,以确保杀死所有微生物和病原体。
同时,还需要注意消毒程序和储存方式,以确保培养基和植物组织的质量和安全。
第三章 植物组织培养基本技术
第三章植物组织培养基本技术植物组织培养是一项技术性和实践性强、无菌条件要求高的一项工作。
掌握组织培养的工作程序和基本操作技术，是做好组织培养工作的基本要求。
因此，我们在组织培养的学习和实践中应不断提升操作水平，掌握技术要领和相关理论知识，这样才能更好地按照工作程序的要求，高质量开展组织培养的试验研究和苗木生产。
第一节组培的一般工作程序植物组织培养的完整过程一般分为制定培养方案、外植体选择与处理、接种、初代培养、继代培养、壮苗与生根培养、试管苗的驯化移栽等几个技术环节(图3-1)，各技术环节的具体要求见本章第2～6节内容。
第二节培养基及其配制培养基是提供植物生长发育所需各种养分的介质。
在离体培养条件下，不同植物以及同种植物不同部位的组织细胞对营养要求不同，只有满足了它们各自的特殊要求，才能更好地生长发育。
因此，理解培养基的组成及其作用，掌握培养基的配制及筛选方法是取得组培成功的关键环节之一。
一、培养基配制的目的完整植株具根、茎、叶等器官，它们彼此分工协作，通过新陈代谢从环境中吸收营养，以自养方式建造自身。
离体培养材料缺乏完整植株那样的自养机能，需要以异养方式从外界直接获得其生长发育所需的各种养分。
配制培养基的目的就是人为提供离体培养材料的营养源，包括碳水化合物、矿质营养、维生素等，以满足离体材料的生长发育。
按照不同配方配制的培养基，是为满足不同类型离体材料的营养需要。
二、培养基的成分培养基的成分主要包括水、无机盐、有机物、植物激素、培养物的支持材料五大类。
(一)水分水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。
配制培养基时选用蒸馏水或去离子水，不但可以保持培养基配制的准确性。
另外，也有利于减少发霉变质，延长培养基母液的贮藏时间。
大规模生产时，配制培养基可用自来水代替蒸馏水。
(二)无机盐根据植物对无机盐需求量的多少，可分为大量元素和微量元素。
1.大量元素大量元素是指植物生长发育所需的浓度小于0.5 mmol/L的营养元素，主要有N、P、K、Ca、Mg、S等。
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渗透压(penetrating pressure)
1—2个大气压对植物生长有促进作用。
培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此， 影响到渗透压的变化。
2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用。 5—6个大气压植物生长就会完全停止。 6个大气压植物细胞就不能生存。
pH值 (pH value)
大多在5-6.5左右，一般培养基皆要求5.6-5.8。
注意：1、培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。 2、完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸 气，灭菌才能彻底。
2.灼烧灭菌（用于无菌操作的器械 ）
镊子、剪子、解剖刀等： →浸入95%的酒精中 →酒精灯火焰上灼烧灭菌 →冷却后，立即使用。
3.干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具） ——利用烘箱加热到160-180°C的温度（持续 90min）来杀死微生物。 注意： 1、干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为
消毒：
指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不 再发生危害作用的过程。
（二）常用的灭菌与消毒方法
灭菌方法：
物理方法：如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常 压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、 微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等灭 菌措施； 化学方法：使用升汞、甲醛、过氧化氢、 高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、 抗菌素、酒精化学药品处理，以达灭菌效 果。
2.酒精浸润消毒：
用70%酒精浸10～30s。70%酒精穿透力强，也 很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。
3. 化学灭菌剂处理
消毒剂消毒原理： 利用氯气、重金属、原子态氧来杀菌。 常用灭菌剂使用浓度及效果比较表 使用浓度 持续时间 去除的难 (%) 灭菌剂 （min） 易 次氯酸 钙 次氯酸 钠 氯化汞 9~10 2 0.1~1 5~30 5~30 5~8 易 易 较难 效果 很好 很好 最好
本节教学重点、难点：
重点：无菌操作技术；组培苗的培养 难点：无菌操作技术
第一节 外植体的选择和消毒
一、外植体的选择
选取性状优良的种质或特殊的基因型
1.选择健壮的植株 ： 健壮、无病虫 、发育正常
代谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功
2.选择最适的时期 ：旺盛生长期
注意植物的生长季节和生长发育阶段：茎尖、花蕾、嫩叶 生长时间较长的块茎、鳞茎、球茎等，往往由于携菌量较多， 不易消毒而难以培养成功。
(2)液体培养法
——用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。 优点：能均衡提供养分。 缺点：透气性较差。 通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧 气的供给；速度：一般为50-100r／min。 滤纸桥方法
2．培养步骤
(1)初代培养
——即接种某种外植体后，最初的 几代培养。 目 的：获得无菌材料和无性繁殖系。 培养基：常用诱导或分化培养基，即培 养基中含有较多的细胞分裂素和少量的 生长素。
注：接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳 嗽等；若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。
（二）接种技术
1. 消毒： 2. 取材：
（实验课）
将初步洗涤及切割的材料放人烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再 用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的4层纱布上或滤纸上。 材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切 割。如叶片切成0.5cm见方的小块；茎切成含有一个节的小段。在接种过程 中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。
（一）有菌和无菌的范畴 有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，
它的表面都是有菌的。
无菌的范畴：
经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其 他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体。
菌类： 细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。 茵的特点：
☆极小，肉眼看不见； ☆无处不有，适应能力强； ☆繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。
湿度 (humidity)
☆实验室环境的相对湿度：
一般要求70%—80%的相对湿度，常用加 湿器或经常洒水的方法来调节湿度。
湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成
分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进 行。湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。
☆培养容器内的相对湿度：100%相对湿度
3、培养过程中常出现的 问题及解决方法
（第四章 植物组织培养中常见问题及解决办法）
A.培养外植体的污染
B.初代培养外植体的褐变
C.继代培养时材料的玻璃化初代
4.植物组织培养的环境条件
在植物组织培养中温度、光照、湿度 等各种环境条件，培养基组成、pH值、 渗透压等各种化学环境条件都会影响组 织培养育苗的生长和发育。
第三章 植物组织培养技术---灭 菌方法、无菌操作技术
内容：
灭菌 无菌操作 愈伤组织的分化与再分化、脱分化 形态发生
教学目的要求
1．掌握外植体的选择条件与消毒方法； 2．掌握外植体接种操作步骤及培养的环境 条件； 3．了解愈伤组织形成的条件及愈伤组织形 成过程、形态发生的调控方法，掌握愈伤组 织的形态发生方式和植物组织培养中愈伤组 织培养的基础技术。 4．一般掌握离体叶片和离体根培养基本过 程（选修）；掌握离体茎培养的种类和操作 步骤；
温度(temperature)
一般采用25± 2℃。
低于15℃℃时培养，植物组织会表现生长停止，高 于35℃时对植物生长不利。 不同植物培养的适温不同。百合的最适温度是20℃、 月季足25-27℃、番茄是28℃。
温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度，也影 响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽 的形成以28℃为最好，在12℃以下，33℃以上形 成率皆最低。
每个外植体形成不定芽分生组织的数目 外植体 部位 由培养基上增 殖苗中的叶片 由温室生长2年的完 整植株上的叶片
叶 柄 叶 片 总 数
6.7 8.0 14.7
6.7 50.3 57.0
外植体培养于WPM附加0.1mg/L NAA和2.5mg/L BA的培养基中，实验用外 植体数为70
二、灭菌与消毒
不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的。
抗菌素 4~50mg/ L
30~60
中
较好
第三步.无菌水涮洗
——是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。
☆灭菌后用无菌水涮洗3～4次即可； ☆升汞残毒较难去除，所以应当用无菌水涮洗6～10次。
第二节 外植体的接种和培养
一、无菌操作：
经过必要消毒的操作者在严格灭菌 的操作空间(接种室、超净台等)使用消 过毒的器皿所进行的操作。
3. 接种：
用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。接种后， 将管口在火焰上再灼烧数秒钟，盖上瓶盖。 具体操作过程是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管囗靠近 酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。然后用 镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基。若是叶片直接 附在培养基上，以放1—3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放 (尖端向上)外，其他尚无统一要求。
包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的 塑料。 2、灭菌时应渐进升温，达到预定温度后记录时间。 3、烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对 流和穿透； 4、到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱， 以免因骤冷而使器皿破裂。 缺点：干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。
4.过滤灭菌（不耐热的物质 ）
4. 标记：
注明接种日期、培养基编号等。
第二节 外植体的接种和培养
二、培养：
指把培养材料放在培养室(适宜光照、温 度条件)里，使之生长，分裂和分化形成愈伤 组织或再生植株的过程。
1．培养方法
(1)固体培养法
——用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。 优点：设备简单，操作易行。 缺点：养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中 毒现象发生。
1.湿热灭菌（培养基）
高压灭菌的原理：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外
溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度 也随之增加。在o．1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在 此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽 孢。
常用方法：关闭放气阀，通电后，待压力上升到
O．05MPa时，关电源，打开放气阀，放出空气，待压力 表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上 升达到0．1MPa开始计时，压力0．1---0．15MPa，20min。
（桌面、墙面、双手、植物材料表面等）
7.植物材料表面用消毒剂灭菌√
第一步：
1、将采来的植物材料除去不用的部分，仔细 洗干净。 2、切割成适当大小（即灭菌容器能放人为 宜）。 3、置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时 （可加入 洗衣粉）。
第二步：是对材料的表面浸润灭菌。
1.准备工作：
准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%～75%酒精、 消毒液、无菌பைடு நூலகம்、手表等。
（一）无菌操作步骤（实验课 ）
(1)接种室消毒：在接种前用甲醛熏蒸接种室，在接种前20min， 打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯 (2)摆放接种用具：将培养基、接种用具等分别防入小推车或超净 工作台上(无菌水.镊子.解剖刀.酒精棉.酒精灯.培养皿.小烧杯等) (3)进入接种室：接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服， 并换穿拖鞋等； (4)手及台面消毒：用70%酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然 后按一定顺序擦拭工作台面； (5)培养材料灭菌：将接种材料预先放入烧杯，置入超净台进行表 面消毒。 (6)接种用具灭菌：先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子 浸泡在95%酒精并取出从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端 处，对培养皿要过火烤干； (7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。
对象：不耐热又不能用高压灭菌处理的
制剂。如：一些生长调节剂，如赤霉素、 玉米素、脱落酸和某些维生素等。 滤膜网孔直径：0.45μm以下，当溶液通 过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等 因大于滤膜直径而被阻。