植物组织培养 第3章 植物组织培养技术——灭菌方法、无菌操作技术(1)

(2)熏蒸灭菌
使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气 和物体表面的微生物。方法简便，空间关闭紧密即可。 常用熏蒸剂：高锰酸钾、甲醛。 常用方法：房间关闭紧密，按5—8ml／m3用量，将 甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸 时，房间可预先喷湿以加强效果。
6.喷雾灭菌（物体表面） 70%～75%的酒精 l%-2%的来苏儿溶液 0.25%—1%的新洁尔灭 涂擦、喷雾
消毒：
指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不 再发生危害作用的过程。
（二）常用的灭菌与消毒方法
灭菌方法：
物理方法：如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常 压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、 微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等灭 菌措施； 化学方法：使用升汞、甲醛、过氧化氢、 高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、 抗菌素、酒精化学药品处理，以达灭菌效 果。
渗透压(penetrating pressure)
1—2个大气压对植物生长有促进作用。
培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此， 影响到渗透压的变化。
2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用。 5—6个大气压植物生长就会完全停止。 6个大气压植物细胞就不能生存。
pH值 (pH value)
大多在5-6.5左右，一般培养基皆要求5.6-5.8。
包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的 塑料。 2、灭菌时应渐进升温，达到预定温度后记录时间。 3、烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对 流和穿透； 4、到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱， 以免因骤冷而使器皿破裂。 缺点：干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。
4.过滤灭菌（不耐热的物质 ）
注：接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳 嗽等；若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。
（二）接种技术
1. 消毒： 2. 取材：
（实验课）
将初步洗涤及切割的材料放人烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再 用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的4层纱布上或滤纸上。 材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切 割。如叶片切成0.5cm见方的小块；茎切成含有一个节的小段。在接种过程 中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。
2.酒精浸润消毒：
用70%酒精浸10～30s。70%酒精穿透力强，也 很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。
3. 化学灭菌剂处理
消毒剂消毒原理： 利用氯气、重金属、原子态氧来杀菌。 常用灭菌剂使用浓度及效果比较表 使用浓度 持续时间 去除的难 (%) 灭菌剂 （min） 易 次氯酸 钙 次氯酸 钠 氯化汞 9~10 2 0.1~1 5~30 5~30 5~8 易 易 较难 效果 很好 很好 最好
2．培养步骤
(2)继代培养——（扩繁培养）是继初
目的：繁殖出相当数量的无根苗，最后 能达到边繁殖边生根的目的。 扩繁的方法：切割茎段、分离芽丛、 分离胚状体、分离原球茎等。
代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。
2．培养步骤
（3）生根培养
生根培养目的： 使生出的不定根浓密而粗壮。 生根培养基： 可采用1／2或者1/4MS培养基，降 低全部去掉细胞分裂素，并加入适量的 生长素(NAA、IBA等)。
每个外植体形成不定芽分生组织的数目 外植体 部位 由培养基上增 殖苗中的叶片 由温室生长2年的完 整植株上的叶片
叶 柄 叶 片 总 数
6.7 8.0 14.7
6.7 50.3 57.0
外植体培养于WPM附加0.1mg/L NAA和2.5mg/L BA的培养基中，实验用外 植体数为70
二、灭菌与消毒
不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的。
4. 标记：
注明接种日期、培养基编号等。
第二节 外植体的接种和培养
二、培养：
指把培养材料放在培养室(适宜光照、温 度条件)里，使之生长，分裂和分化形成愈伤 组织或再生植株的过程。
1．培养方法
(1)固体培养法
——用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。 优点：设备简单，操作易行。 缺点：养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中 毒现象发生。
第三章 植物组织培养技术---灭 菌方法、无菌操作技术
内容：
灭菌 无菌操作 愈伤组织的分化与再分化、脱分化 形态发生
教学目的要求
1．掌握外植体的选择条件与消毒方法； 2．掌握外植体接种操作步骤及培养的环境 条件； 3．了解愈伤组织形成的条件及愈伤组织形 成过程、形态发生的调控方法，掌握愈伤组 织的形态发生方式和植物组织培养中愈伤组 织培养的基础技术。 4．一般掌握离体叶片和离体根培养基本过 程（选修）；掌握离体茎培养的种类和操作 步骤；
抗菌素 4~50mg/ L
30~60
中
较好
第三步.无菌水涮洗
——是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。
☆灭菌后用无菌水涮洗3～4次即可； ☆升汞残毒较难去除，所以应当用无菌水涮洗6～10次。
第二节 外植体的接种和培养
一、无菌操作：
经过必要消毒的操作者在严格灭菌 的操作空间(接种室、超净台等)使用消 过毒的器皿所进行的操作。
1.湿热灭菌（培养基）
高压灭菌的原理：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外
溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度 也随之增加。在o．1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在 此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽 孢。
常用方法：关闭放气阀，通电后，待压力上升到
O．05MPa时，关电源，打开放气阀，放出空气，待压力 表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上 升达到0．1MPa开始计时，压力0．1---0．15MPa，20min。
对象：不耐热又不能用高压灭菌处理的
制剂。如：一些生长调节剂，如赤霉素、 玉米素、脱落酸和某些维生素等。 滤膜网孔直径：0.45μm以下，当溶液通 过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等 因大于滤膜直径而被阻。
5.紫外线和熏蒸灭菌（空间）
(1)紫外线灭菌
紫外线的波长为200—300nm，其中以260nm的杀菌 能力最强，要求距照射物以不超过1.2m为宜。
（桌面、墙面、双手、植物材料表面等）
7.植物材料表面用消毒剂灭菌√
第一步：
1、将采来的植物材料除去不用的部分，仔细 洗干净。 2、切割成适当大小（即灭菌容器能放人为 宜）。 3、置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时 （可加入 洗衣粉）。
第二步：是对材料的表面浸润灭菌。
1.准备工作：
准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%～75%酒精、 消毒液、无菌水、手表等。
3.选取适宜的大小 ：一般0.5-1cm; 脱毒0.2-0.3mm
材料太大易污染，也不需要；材料太小，易受 伤害胁迫、多 形成愈伤组织， 甚至难于成活
外植体（叶）的各个部分其芽、苗再生能力也很不相同 胶皮枫香树（Liquidamnbar styraciflua “Variegata”）叶 片外植体的供体及叶的部位对其不定芽形成的影响
3. 接种：
用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。接种后， 将管口在火焰上再灼烧数秒钟，盖上瓶盖。 具体操作过程是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管囗靠近 酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。然后用 镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基。若是叶片直接 附在培养基上，以放1—3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放 (尖端向上)外，其他尚无统一要求。
(2)液体培养法
——用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。 优点：能均衡提供养分。 缺点：透气性较差。 通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧 气的供给；速度：一般为50-100r／min。 滤纸桥方法
2．培养步骤
(1)初代培养
——即接种某种外植体后，最初的 几代培养。 目 的：获得无菌材料和无性繁殖系。 培养基：常用诱导或分化培养基，即培 养基中含有较多的细胞分裂素和少量的 生长素。
光照(light)
主要表现在光强、光质、以及光照时间方面 1．光照强度(light intensity) 光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的 研究情况看，光照强度对外植体及细胞的最初分裂有明显的影响。 一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼 苗容易徒长。 2．光质(light wave) 光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显 的影响。如百合珠芽在红光下培养，8周后，分化出愈伤组织。 但在蓝光下培养，几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种 15d后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白 光下幼苗纤细。 3．光周期(light period) 最常用的周期是16h光照/8h的黑暗。研究表明，一些植物的愈 伤组织在暗下比在光下更好。如红花、乌饭树的愈伤组织。
3、培养过程中常出现的 wk.baidu.com题及解决方法
（第四章 植物组织培养中常见问题及解决办法）
A.培养外植体的污染
B.初代培养外植体的褐变
C.继代培养时材料的玻璃化初代
4.植物组织培养的环境条件
在植物组织培养中温度、光照、湿度 等各种环境条件，培养基组成、pH值、 渗透压等各种化学环境条件都会影响组 织培养育苗的生长和发育。
注意：1、培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。 2、完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸 气，灭菌才能彻底。
2.灼烧灭菌（用于无菌操作的器械 ）
镊子、剪子、解剖刀等： →浸入95%的酒精中 →酒精灯火焰上灼烧灭菌 →冷却后，立即使用。
3.干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具） ——利用烘箱加热到160-180°C的温度（持续 90min）来杀死微生物。 注意： 1、干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为
（一）有菌和无菌的范畴 有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，
它的表面都是有菌的。
无菌的范畴：
经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其 他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体。
菌类： 细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。 茵的特点：
☆极小，肉眼看不见； ☆无处不有，适应能力强； ☆繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。
温度(temperature)
一般采用25± 2℃。
低于15℃℃时培养，植物组织会表现生长停止，高 于35℃时对植物生长不利。 不同植物培养的适温不同。百合的最适温度是20℃、 月季足25-27℃、番茄是28℃。
温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度，也影 响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽 的形成以28℃为最好，在12℃以下，33℃以上形 成率皆最低。
湿度 (humidity)
☆实验室环境的相对湿度：
一般要求70%—80%的相对湿度，常用加 湿器或经常洒水的方法来调节湿度。
湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成
分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进 行。湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。
☆培养容器内的相对湿度：100%相对湿度
本节教学重点、难点：
重点：无菌操作技术；组培苗的培养 难点：无菌操作技术
第一节 外植体的选择和消毒
一、外植体的选择
选取性状优良的种质或特殊的基因型
1.选择健壮的植株 ： 健壮、无病虫 、发育正常
代谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功
2.选择最适的时期 ：旺盛生长期
注意植物的生长季节和生长发育阶段：茎尖、花蕾、嫩叶 生长时间较长的块茎、鳞茎、球茎等，往往由于携菌量较多， 不易消毒而难以培养成功。
（一）无菌操作步骤（实验课 ）
(1)接种室消毒：在接种前用甲醛熏蒸接种室，在接种前20min， 打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯 (2)摆放接种用具：将培养基、接种用具等分别防入小推车或超净 工作台上(无菌水.镊子.解剖刀.酒精棉.酒精灯.培养皿.小烧杯等) (3)进入接种室：接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服， 并换穿拖鞋等； (4)手及台面消毒：用70%酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然 后按一定顺序擦拭工作台面； (5)培养材料灭菌：将接种材料预先放入烧杯，置入超净台进行表 面消毒。 (6)接种用具灭菌：先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子 浸泡在95%酒精并取出从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端 处，对培养皿要过火烤干； (7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。