叶绿素荧光分析技术在植物生物学研究中的应用

.3
(C)
.2 0 50 100 150 200 250 NaCl (mmol/L)
.9 (A) .8 .7 qP .6 (C)
.7 .6 .5 ΦPSII .4 .3
.5 .4 .8 .7 Fv'/Fm' .6 .5 .4 .3 .2 27 30 33 36 39 42 45 48 27 30 33 36 39 42 45 48 Tem perature ( o C) (B) (D)
一切影响CO2同化的外接界因 素如低温、高温、水分亏缺、 矿质元素亏缺等都会减少对光 能的利用，、导致过剩光能增 加，进而加重光破坏。
光破坏防御机制
热耗散
激发能
光化学反应 形成同化力 荧光
CO2固定 光呼吸 Mehler 反应 N代谢
活性氧 高能电子
光破坏
热耗散过程虽然能耗散过剩光能,保护 植物不被强光破坏,但却不可避免地降低 了光化学效率,按传统的观点凡是导致光 化学效率降低的过程都称为光抑制。 由此可见,光破坏的防御机制也是光抑 制的一种形式,实际上在自然条件下,大多 数的光抑制都是由光破坏防御机制造成的。 那么如何区分光破坏与热耗散？
Fd－ + O2
Fd +
O2·－
O2。－启动类囊体膜的脂质过氧化，破坏光合色素、类囊体系 统以及膜结合酶使电子传递效率下降，严重时使电子传递系统 失活。CO2供应不足时易产生这种破坏。
P680+ + β-Car
P680 + β-Car+
PSⅡ供体侧 H2O的光解受阻时易产生此种破坏。P680+还能氧 化D1蛋白肽链中酪氨酸残基和叶绿素等色素。
.2 .1 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 .5 0.0 NPQ
○，对照；
●，200 mmol/L Naห้องสมุดไป่ตู้l
不同温度处理对照叶片和盐胁迫叶片光化学猝灭系数（qP）、 PSII光能捕获效率（Fv’/Fm’）、PSII量子效率(ФPSII，)、非光 化学猝灭(NPQ，D)的影响。示NaCl处理增加叶片的抗高温能力
这类荧光仪有： FMS-1、FMS-2、PAM-2000等
2. 连续激发式荧光仪
连续激发式荧光仪具有相当高的分辨 率，初始记录速度为每秒钟10万次，从 10μs 到最长300s内不同时间的荧光信号 都能被定量地记录。所以能够从荧光O-P 上升过程中捕捉到更多荧光信息的变化， 能够准确记录O-P变化过程中的O点、K点、 J点和 I点的变化。
注意： quench 是淬灭，不是猝灭
反映PSII光化学效率的荧光参数：
Fv/Fm：暗适应下PSⅡ反应中心完全开放时的最大 光化学效率，反映PSⅡ反应中心最大光能 转换效率。
Fv’/Fm’：光适应下PSⅡ最大光化学效率，它反映有 热耗散存在时PSⅡ反应中心完全开放时的 光化学效率，也称为最大天线转换效率。
Fm Fm’
＝Fm’-Fs
Fs
Fs为照光条件下产生 的稳态叶绿素荧光， 因为照光下，部分反 应中心关闭，所以荧 光发射较高。
t
Fo
M -脉冲调制光 S- 饱和脉冲光
叶绿素荧光诱导动力学曲线
Fm’： 光适应下最大荧光（在作用光下用饱和脉冲光测定）。 Fo’： 光适应下最小荧光（在作用光下用脉冲调整光测定）。 Fs : 为照光条件下产生的稳态叶绿素荧光。
透射光下
反射光下
685
在生理温度下，叶绿素荧光的波长 峰值大约为685nm的红光，并且一致延 伸到800nm的远红光处
当叶绿素分子吸收光能后，叶绿素分子中的电子被激发，激发态电子的 寿命非常短，当带电子从激发态回到到基态的去激过程中，一小部分激发 能（3-9%）以红色的荧光形式耗散。 活体叶片为什么看不到荧光现象？光反应、热耗散和荧光竞争激发能。
暗 反 应
光活化过程 光活化过程
连续光下荧光产量瞬间上升，这是因为照光后某些碳同化酶需要 光活化，因此碳同化途径产生延迟。这使得照光初期相当多的QA处 于还原状态，从而导致了荧光产量的瞬态上升。这之后，由于光化 学过程和热耗散过程的发生，荧光产量产生淬灭到一个稳态数值 （Ft）。
X Pheo Q PQ Cytf H2O Z P680 PC 光量子 P700 Fd NADP O2 光量子
光抑制: photoihibition 光氧化: photooxidation 光失活: photoinactivation 光破坏: photodamage 光破坏: solarigation 光漂白: photobleaching
光抑制的基本特征
AQY及Fv/Fm下降. 说明叶片吸收的光能不能有效地转化为化学能。 光抑制的机理： 1. 光破坏；2 光破坏防御机制 PSII是光抑制损伤的主要场所，破坏也可能发生在反应中 心也可能发生在与次级电子受体结合的蛋白上。发生光破坏 后的结果：电子传递受阻，光合效率下降。 产生光破坏的原因： 过剩光能产生的高能电子无法利用， 产生如 chl*, 单线态氧、超氧阴离子等氧化性很强的分子破 坏光合机构。
CK - Mn
PSII
光是绿色植物光合作用的唯一能量来源，是 植物赖以生存的基础。 然而，当植物吸收的光 能超过其利用能力时，将出现光能过剩，会导 致活性氧的产生，引起光合作用的光抑制，甚 至光氧化、光破坏。 光抑制概念: 强光造成光合功能下降的过程称为光抑制特 征：光合效率下降；Fv/Fm 及AQY 下降 过去人们把光抑制与光破坏等同起来，认为发 生了光抑制就意味着光合机构遭到破坏。甚至 把光抑制 、光破坏、光漂白、光氧化等概念通 用。
暗 反 应
光活化过程
光合电子传递链
PSII氧化还原 快速叶绿素荧光
PSI氧化还原
卡尔文循环
将时间标尺放大后的叶绿素荧光动力学曲线
叶绿素荧光诱导动力学曲线的意义
从O点到P点的荧光上升过程称为快速叶绿素 荧光诱导动力学曲线，主要反映了PSⅡ的原初光 化学反应及光合机构电子传递状态等过程的变化。 从P点到T点的下降阶段主要反映了PSI的还 原和光合碳代谢的变化，随着光合碳代谢速率的 上升，荧光强度逐渐下降。
Handy PEA
PEA
常用荧光参数及其意义
Fo： 初始荧光，是PSⅡ反应中心处于完全开放状态时
（经过 充分暗适应以后）的初始荧光产量。
当反应中心失活或者遭到破坏时，Fo上 升。因此，可以用Fo变化来反映PSII反应 中心的失活状态
Fm ：最大荧光，是PSⅡ反应中心完全关闭时
（强光照射后）的荧光产量。
作用（自然光） 作用（自然光）
检 测 测 器 器 及 及 放 放 大 大 （5） 器 器 ； ； 检
脉冲光
脉冲荧光 脉冲荧光 滤光片 7） 滤光片
8 植物叶片 植物叶片 脉冲调整式荧光仪能排除自然光中的红光信号和自然光诱导的荧 光信号，只监测脉冲光调制光诱导的荧光信号的变化。这样便可以直 接在特定的光照条件下测定叶绿素荧光。
Fv= Fm - Fo：可变荧光，最大荧光和初始荧光的差
值。
反应 中心
X Pheo Q PQ Cytf H2O Z P680 PC 光量子 P700 Fd NADP O2 光量子
光 合 电 子 传 递 链 （解释作用中心关闭和开放）
Fv/Fm（最大光化学效率） =(Fm-Fo)/Fm ； ΦPSII （实际光化学效率）=(F’m-Fs )/F’m ； NPQ （非光化学淬灭）= (Fm-F’m)/F’m
ФPSⅡ=(Fm’-Fs)/Fm’ ： PSⅡ实际光化学效率，它反
映在照光下PSⅡ反应中心部分关闭的情况下的 实际光化学效率。
ETR = 0.5 ×光能吸收系数× ФPSⅡ ×PFD PSII电子传递速率
荧光参数是研究植物光化学效率、 光抑制与光破坏防御的有效的工具
该技术被广泛的使用在植物生态、植物抗 逆性、筛选高光效或抗逆品种、转基因植物 的功能分析、光抑制和光破坏的防御机制等 方面的研究。
光破坏的概念 • 当过剩的光能不能及时有效地排散 时，对光合机构造成不可逆的伤害， 如对光合色素造成光漂白、光合作用 中心D1蛋白的降解及光合机构的光氧 化等。
光破坏现象
3P
680 + O2
P680 + 1O2
氧化性极强的1O2首先攻击反应中心色素P680，使PSⅡ反应中 心失去电荷分离能力，最终引起D1蛋白降解.PSⅡ受体侧电子传 递受阻时易产生此种破坏。
.9 .8 .7 qP .6 .5 .8 .7 Fv'/Fm' .6 .5 .4 .5 ΦPSII .4
NaCl胁迫对杂交酸模叶片光化 学淬灭系数（qP）、PSII反应 中心光能捕获效率（Fv’/Fm’）、 和PSII量子效率(ФPSII)的影响
(A)
(B)
A：光化学猝灭系数（qP） B：光能捕获效率（Fv’/Fm’） C：PSII量子效率(ФPSII)
叶绿素荧光分析技术在植物 生物学研究中的应用 高辉远
山东农业大学生命科学学院
农业生产中的一且措施都是围绕改 善光合性能进行的。 所以光合作用的研究几乎涉及到植 物生物学的各个领域。 而叶绿素荧光的检测和分析在光合 作用研究中所起的作用越来越突出。
叶绿素荧光现象
Kautsky 等（1931）发现，将暗适应的绿色植物 突然暴露在可见光下后，植物绿色组织发出一种暗 红色，强度不断变化的荧光, 称为Kautsky效应。
1.0 .8 .6 .4 .2 0.0 0 2 4 6 8 10 12 Time (h)
Fv/Fm
说明什么问题？
●，21 % O2 ○，2 % O2 光呼吸 Mehler反应
强光下氧浓度对植物叶片PSII光抑制及其恢复的影响
0.8 0.6
ΦPSII
CK - Mn
200 150 ETR 100 50 0
用连线激发式荧光仪测定的荧光诱导曲线
Relative fluorescence intensity 1 .2 1 .0 .8 .6 .4 .2 0 .0 100 101 102
b' c'
O
K
J
c a ( a ')
I
P
b
103
104
105
106
107
T im e ( μ s )
连续激发式荧光仪有：Handy PEA， PEA，Pocket PEA， PEA Senior, M-PEA 等
叶绿体中激发能的去向
热耗散
CO2固定 光呼吸 Mehler 反应 N代谢
激发能
光化学反应 形成同化力 荧光
活性氧 高能电子
光破坏
叶绿素荧光动力学曲线包含着 光合作用过程丰富的信息
● ● ● ● ● 光能的吸收与转换 ● 能量的传递与分配 反应中心的状态 ● 过剩光能及其耗散 PSII供体侧和受体的活性 电子传递体PQ库的大小以及活性 光合作用光抑制与光破坏……等等
●
荧光淬灭参数：
qP =(Fm’ -Fs)/(Fm’-Fo’) ： photochemical quenching 光化学淬灭系数，它反 映了PSⅡ反应中心的开放程度。 1- qP 用来表示PSⅡ反应中心的关闭程度。 NPQ = (Fm-F’m)/F’m ＝Fm/Fm’-1 ：非光化学淬灭 non-photochemical quenching NPQ反映了热耗散的程度
荧光随时间变化的曲线称为 叶绿素荧光诱导动力学曲线
5000 Fluorescence intensity 4000 3000 2000 T 1000 0 0 100 200 300 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102 Time (s) Time (s) O O T P A P B 4000 3000 2000 1000 0 103 Fluorescence intensity 5000
如何区分光破坏与热耗散 ?
叶绿素荧光是研究光能分配的探针 热耗散
激发能
光化学反应 形成同化力
荧光
CO2固定 光呼吸 Mehler 反应 N代谢
NPQ 增加、Fm下降是热耗散增加的标志； Fo升高是作用中心破坏的标志 （解释）
叶绿素荧光分析应用实例
不同温度 下、强光 对玉米叶 片最大光 化学效率 的影响
如何测定叶绿素荧光？
现有两类荧光仪：
1. 脉冲调制式荧光荧光仪：
如何避免自然光干扰叶绿素荧光的测定？脉冲调制荧 光仪测定时能供一种脉冲调制光，它能诱导出脉冲式荧 光。当有自然光线同时存在时，仪器可以同时检测到以 下三种光信号： 1.自然光中具有的荧光波长的红光信号 2.自然光诱导叶片产生的非脉冲荧光信号 3.脉冲调制光诱导叶片产生的脉冲荧光信号