单克隆抗体手册
单克隆抗体(McAb)制备注意事项
单克隆抗体(McAb)制备注意事项(一) 免疫动物的选择用于免疫的动物，应选择与亲本骨髓瘤细胞同一品系的动物，因为免疫动物品系和骨髓瘤细胞种系越远，融合的杂交瘤细胞越易发生免疫排斥反应，越不稳定。
目前使用的瘤细胞系，仍限于小鼠和大鼠的骨髓瘤细胞系，其中多来源于纯系BALB/c小鼠，所以要选择该系小鼠用作免疫动物，一般认为，为了减少盲目性，融合前，应测定免疫小鼠的抗体反应性，如果呈阳性，可供融合用，那些对特定抗原不产生血清抗体的小鼠，得不到特异的杂交瘤细胞。
一般选择8～12周龄，重约20g，健康无病的纯系小鼠，雌雄均可应用。
(二) 免疫方案1 抗原免疫用的抗原尽量设法提高其纯度，并保存其活性。
同样浓度的抗原，若含有较多的杂质，会明显影响抗体的产生，并为杂交瘤细胞分泌抗体的筛选带来麻烦，获得所需的分泌特异抗体的杂交瘤细胞的机率也低。
2 免疫小鼠一次免疫务必同时免疫几只小鼠，以免小鼠中途死亡。
每次注入抗原后，次日，小鼠会出现全身反应，体温升高、盗汗、耸毛等，此时对室温和饲养均需注意，以防小鼠死亡。
在融合前末次静注或腹腔注射时，谨防速发型过敏反应发生，而导致小鼠死亡。
3 不同抗原的免疫方法可溶性抗原，在初次免疫用明矾沉淀抗原100μg与2×109灭活百日咳杆菌混合皮下注射，间隔4～6周，用盐水抗原100～200μg 加强免疫，3天后取脾作融合；细胞抗原免疫，用2×107个细胞注入小鼠腹腔，间隔2～3周，再重复一次，3周后用同样数量细胞注入小鼠腹腔，3天后取脾作融合。
除上述常规免疫方法外，近年来还建立了脾内免疫法及体外细胞免疫法。
脾内免疫是将抗原直接注入小鼠的脾脏，具有抗原用量小及免疫周期短的优点；体外细胞免疫，是将抗原加入于体外培养的淋巴细胞中，使之形成免疫细胞。
(三) 融合剂PEG对细胞有毒性，一般采用分析纯规格。
浓度越高，对细胞的毒性越大。
以40%～50%的浓度为宜，pH值以80～82促融率最高。
抗人CD3单克隆抗体
人源化抗人CD3单克隆抗体说明书产品名称通用名称：人源化抗人CD3单克隆抗体英文名称：Humanized anti-human CD3 monoclonal antibody适用范围用于T淋巴细胞激活扩增，适用于直肠癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、恶性有传导TCR信号的功能，使T细胞活化。
CD3分子与TCR以非共价键结合形成TCR-CD3复合物，其主要功能是把TCR与抗原结合后产生的活化信号传递到细胞内，诱导T细胞活化。
从外周血、骨髓或脐血中分离出的单个核细胞在CD3单克隆抗体和多种细胞因子存在的条件下，经过一定时间培养可以获得具有肿瘤细胞杀伤活性的CIK（Cytokine-induced Killer）细胞。
功能参数使用说明可溶法：推荐使用浓度为400ng/ml，在该浓度条件下细胞可获得充分的活化和刺激，细胞扩增倍数和最终的CD3+CD56+双阳率有明显提高。
包被法：10mL PBS缓冲液（5ug/mL anti-human CD3）铺T75方瓶置于4℃过夜。
使用前去除PBS缓冲液，生理盐水洗涤三次。
参考文献1、YaoWang, Hanren Dai, Hong Li, Haiyan Lv,TaoWang, Xiaobing Fu,and WeidongHan. Growth of Human Colorectal CancerSW1116 Cells Is Inhibited by Cytokine-Induced Killer Cells Clinical and Developmental Immunology Volume 2011, Article ID621414, 9 pages doi:10.1155/2011/6214142、D Sangiolo†, G Mesiano, F Carnevale-Schianca, W Piacibello, M Aglietta & A Cignetti . Cytokine induced killer cells asadoptive immunotherapy strategy to augment graft versus tumor after hematopoietic cell transplantation. Expert Opin. Biol. Ther.(2009) 9(7):831-8403、RENATE SIEFKEN, ROLAND KURRLE, AND REINHARD SCHWINZER.CD28-Mediated Activation of Resting Human TCells without Costimulation of the CD3/TCR Complex. CELLULAR IMMUNOLOGY 176, 59–65 (1997)。
《单克隆抗体》课件
05
单克隆抗体的未来发展
新型单克隆抗体的研发
总结词
随着生物技术的不断发展，新型单克 隆抗体的研发将更加活跃，以满足更 多治疗需求。
详细描述
新型单克隆抗体将通过基因工程技术 、蛋白质工程技术等手段进行设计和 优化，以改善其疗效、降低副作用和 降低生产成本。
单克隆抗体与其他技术的结合应用
总结词
单克隆抗体将与其他治疗手段和技术相结合，以实现更有效的疾病治疗和诊断 。
03
类型
IgG、IgM、IgA等。
单克隆抗体的发现和发展历程
1901年
Ehrlich提出“侧链学说”，认为抗体是 由细胞产生的化学物质。
1986年
FDA批准第一个单克隆抗体药物上市， 用于治疗非霍奇金淋巴瘤。
1975年
Kohler和Milstein首次成功制备出单克隆 抗体。
2014年
FDA批准第一个全人源单克隆抗体药物 上市，用于治疗类风湿性关节炎。
生物治疗
总结词
单克隆抗体在生物治疗中具有显著疗效 ，可用于治疗癌症、自身免疫病等多种 疾病。
VS
详细描述
通过靶向肿瘤细胞表面抗原或免疫系统中 的特定分子，单克隆抗体能够发挥抗癌作 用。例如，针对某些癌症的单克隆抗体药 物能够抑制肿瘤生长、扩散和转移，提高 患者生存率和生活质量。此外，在自身免 疫病治疗中，单克隆抗体也具有良好疗效 ，能够调节免疫系统，缓解单克隆抗体的概述 • 单克隆抗体的制备 • 单克隆抗体的特性 • 单克隆抗体的应用实例 • 单克隆抗体的未来发展
01
单克隆抗体的概述
单克隆抗体的定义
01
单克隆抗体
由单一B细胞克隆产生的具有 高度特异性识别抗原表位的抗
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb）是指由单一B细胞克隆分离得到的抗体，其具有高特异性和高亲和力。
制备单克隆抗体的方法主要有杂交瘤技术和重组DNA技术。
以下是单克隆抗体制备的步骤及注意事项。
步骤一：抗原免疫1.选择合适的抗原：根据需要检测的分子或细胞表面标志物，选择合适的抗原。
2.免疫动物：常用的动物有小鼠、兔子等。
选择适合的动物后，根据抗原的种类和免疫动物对该抗原的敏感性，设计免疫方案。
3.免疫计划：免疫计划包括免疫剂量、免疫途径和免疫次数等。
通常先进行原位免疫，然后再以单体或混合抗原进行体内免疫。
步骤二：细胞融合1.收集脾细胞：在最佳时期，解剖免疫动物，取出脾脏。
2.细胞培养：将收集的脾细胞在无菌条件下分散成单个细胞，并在培养基中培养，以供细胞融合使用。
3.准备骨髓瘤细胞：选择合适的骨髓瘤细胞，例如NS0或SP2/0等。
将其培养至对数生长期。
4.细胞融合：在抗原刺激下，将脾细胞与骨髓瘤细胞以一定比例混合，用聚乙烯醇或其他化合物促进细胞融合。
步骤三：细胞筛选与扩展1. HT增重培养：用含有hprt缺陷的培养基筛选融合细胞，以选择杂交瘤细胞。
2. Limited Dilution扩展：以一细胞一孔的方式将杂交瘤细胞进行有限稀释，使其实现单克隆化。
3.细胞培养：将单克隆细胞株移植到培养瓶中，进行培养和扩增。
步骤四：单克隆抗体鉴定1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：用ELISA方法筛选单克隆细胞株，检测其抗原特异性。
2.免疫组织化学检测：将单克隆抗体应用于细胞和组织切片，检测其在特定细胞或组织中的反应。
3.流式细胞术：通过流式细胞仪检测单克隆抗体与特定细胞表面标志物的结合情况。
步骤五：单克隆抗体生产与纯化1.细胞培养：将单克隆细胞株培养扩增至一定程度。
2.抗体收集：将培养上清液进行抗体收集。
3.纯化与浓缩：利用亲和层析、离子交换、凝胶过滤等技术，对抗体进行纯化和浓缩。
实验技术手册(细胞免疫方面)
单克隆抗体的制备1975年，Köhler和Milstein创立了杂交瘤技术制备单克隆抗体，单克隆抗体具有特异性高，灵敏度高，重复性好，可供应量大，检测时间短以及能够查出混合物中的少量成分等优点。
1试验材料1.1试验动物和细胞雌性6～8周龄BALB/c小鼠SP2/0骨髓瘤细胞1.2主要实验试剂HRP标记羊抗小鼠IgG、福氏完全佐剂（FCA）、福氏不完全佐剂（FIA）、聚乙二醇（PEG）、二甲基亚砜（DMSO）、降植烷、TMB底物、HAT(50×)、HT(50×)、三抗溶液（100×）小鼠单抗Ig类和亚类鉴定用ELISA试剂盒均为SIGMA公司；DMEM粉、特级胎牛血清（FBS）均为GIBCO公司；牛血清白蛋白（BSA）1.3主要实验仪器和耗材CO2细胞培养箱（Thermo和上海新苗医疗器械制造有限公司WJ-160B-Ⅲ）酶联检测仪（BIO-RAD Model 680）血球计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司）pH计（Sartorius赛多利斯科学仪器）APL高压灭菌锅（CL-32L）生物安全柜(ESCO北京五州东方科技发展有限公司)三恒电泳仪（JY600C）数显恒温磁力搅拌器（78HW-1，杭州仪表电机有限公司）电子分析天平（Sartorius赛多利斯科学仪器）分光光度计（WPA Biowav eⅡ+）进口液氮罐（Thermo）Protein A柱恒温水浴锅（HH-2金坛市科兴仪器厂）微型台式真空泵（GL-80ZB型，海门市）电热恒温培养箱（DHP-9032上海天恒医疗器械）低速离心机 (L-550长沙湘仪离心机仪器有限公司)高速冷冻离心机（SIGMA 2-16PK）倒置显微镜（Nikon TS100）超低温冰箱(Thermo)96孔酶标板（）96孔、24孔细胞培养板、T25培养瓶、35mm培养皿、60mm培养皿、100mm培养皿、冻存管0.22μm过滤器(PALL)2主要试剂配制2.1常规试剂配制PBS（或PB）（0.02mol/L，pH7.4）：A液（0.2 mol/L Na2HPO4）：Na2HPO4·12H2O 71.64g,加蒸馏水至1000ml；B液（0.2 mol/L NaH2PO4）：NaH2PO4·2H2O 3.12g,加蒸馏水至1000ml；取A液81ml加B液19ml混合，再用生理盐水（或蒸馏水）做10倍稀释即成。
MSDS(单克隆抗体)
MATERIAL SAFETY DATA SHEET快件声明物安全特性报告MSDS Name（报告物名称）：Monoclonal antibodies Diagnostic RegentSECTION 1---CHEMICAL PRODUCT AND COMPANY IDENTIFICATIO第一部分化工产品及发件单位MSDS Name（报告物名称）：Monoclonal antibodies Diagnostic Regent（单克隆抗体诊断试剂）Catalog Numbers(化工品分类号):N/ASynonyms（又名）：N/ACompany Identification（发件公司名称）：For information, call（一般联系电话）：For emergencies, call（应急联系电话）：SECTION 2---COMPOSITION, INFORMA TION ON INGREDIENTS成分特点Risk Phrases（危险条件）：0SECTION 3---HAZARDS INDENTIFITION危险特征Emergency Overview（概述）Hmis RatingHealth: 0Flammability: 0Reactivity: 0NFPA RatingHealth: 0Flammability: 0Reactivity: 0SECTION 4---FIRST AID MEASURES应急医疗救治Eyes（眼睛）：In case of contact with eyes, flush with copious amounts of water for at least 15minutes. Assure adequate flushing by separating the eyelids with fingers. Call aphysician.Skin（皮肤）：In case of contact, immediately wash skin with soap and copious amounts of water. Ingestion（误食）：If swallowed, wash out mouth with water provided person is conscious. Call a physician.Inhalation（吸入）：If inhaled, remove to fresh air. If breathing becomes difficult, call a physician. Chronic（可否引起慢性病）：N/ASECTION 5---FIRE FIGHTING MEASURES消防扑救方法Extinguishine Media（灭火物质）：Water spray. Carbon dioxide, dry chemical powder, orappropriate foam.Firefighting（防护措施）：Wear self-contained breathing apparatus and protective clothing toprevent contact with skin and eyes.SECTION 6---ACCIDENTAL RELEASE MEASURES事故处理General Information（一般信息）：Exercise appropriate precautions to minimize direct contact with skin or eyes and prevent inhalation of dust.Sweep up, place in a bag and hold for waste disposal.Avoid raising dust.Ventilate area and wash spill site after material pickup is complete.SECTION 7---HANDLING AND STORAGE处理和存放Handling（处理）：Avoid inhalation. Avoid contact with eyes, skin, and clothing. Avoid prolonged or repeated exposure.Storage（存放）：Keep tightly closed.SECTION 8---EXPOSURE CONTROLS, PERSONAL PROTECTION安全控制和人员保护Engineering Control（机械控制）：Safety shower and eye bath. Mechanical exhaust required. Personal Protective Equipment（人员保护）：Use respirators and components tested and approved under appropriate government standards such as NIOSH (US) or CEN (EU). Respiratory protection is not required. Where protection from nuisance levels of dusts are desired, use typeN95 (US) or type P1 (EN 143) dust masks.Hand: Protective gloves.Eye: Chemical safety goggles.General hygiene measures：Wash thoroughly after handling.SECTION 9---PHYSICAL AND CHEMICAL PROPERTIES物理和化学特性Physical State（物理状态）：Liquid Color(颜色)：Red transparentOdor (气味)：Weak Ph: 6.4Vapor Pressure(蒸汽压力)：N/A Viscosity（黏度）：N/ABoiling Point（沸点）：N/A Freezing/Melting Point（冰点）：N/A Autoignition Temperature（自燃温度）：N/A Flash Point（闪点）：N/AExplosion Limits,lower（爆炸极限，低）：N/A Explosion Limits,upper（爆炸极限，高）：N/A Decomposition temperature(分解温度): N/A Solubility in water(溶解度): N/ASpecific Gravity/Density(特定浓度):N/A Molecular Formula(分子式):N/AMolecular Weight(分子量): N/ASECTION 10---STABILITY AND REACTIVTY稳定性和活性Chemical Stability(化学稳定性):StableConditions to Avoid(应避免的环境): Strong oxidizing agents.SECTION 11---TOXICOLOGICAL INFORMA TION毒性信息RTECS#(毒性数据符号): N/ASECTION 12---ECOLOGICAL INFORMATION生态学信息N/ASECTION 13---DISPOSAL CONSIDERATIONS销毁建议Contact a licensed professional waste disposal service to dispose of this material. Dissolve or mix the material with a combustible solvent and burn in a chemical incinerator equipped with an Afterburner and scrubber. Observe all federal, state, and local environmental regulations.SECTION 14---TRANSPORT INFORMA TION空运信息IATA: Non-hazardous for air transport.Reported byCompany Name: 湖南远泰生物技术有限公司Date; 2012-07-28Authorized Person: Jian Qiang Signature: 简强。
抗人CD3单克隆抗体(CloneOKT3)
抗人 CD3 单克隆抗体(Clone:OKT3)
背景 CD3 是由四条不同的链组成的蛋白质复合物。
在 哺
乳动物中，该复合物包含一条 CD3γ链，一条 CD3δ链和
两 条 CD3ε链。
这些链和T细胞受体（TCR）以及ζ链在T
淋巴细胞中产生一个活化信号。
CD3 抗体识别所有 T 细
胞，也就是说，它可以和70-80％的人外周血淋巴细胞以及
65-85％的胸腺细胞发生反应。
该抗体识别的抗原的表位位
于 CD3 复合体的ε链。
该 OKT3 抗体可用于激活和扩增
T 细胞。
应用 体外 T 细胞的激活和扩增。
成份 溶解在 PBS 中，经 0.2μm 过滤制成的冻干粉。
内毒素水平 鲎试验方法检测。
内毒素水平＜0.1EU/μg。
制剂 使用灭菌的ddH2O制备。
如果用0.5ml ddH2O溶解，
则抗体浓度为 1mg/ml。
贮存 -20℃~ -70℃贮存，避免反复冻融。
克隆:OKT3
货号: HYMAB-H003
包装大小:500ug
贮存: -20℃~ -70℃
制剂: 无菌ddH2O
特征: 人 CD3
Ig 类别: 鼠 IgG2a，kapa
使用建议:在体外人 T 细胞
活 化 时 建 议 使 用 浓 度
10-100ng/ml。
图 1. OKT3 激活 T 细胞对 CD28 蛋白
的表达
图 2. 抗-hCD3 抗体在刺激人 T 细胞增值能力
的生物学活性（4 天）
研究人员使用时需要对使用浓度进行优化。
单克隆抗体制备操作方法及注意事项JEN
单克隆抗体制备操作方法及注意事项JEN无菌室清洁要求：1、进入无菌间，须更换白大褂，口罩、鞋套必须戴上，最好戴上帽子、手套；2、进去后用酒精棉球擦洗手；3、生物安全柜常见酒精棉球擦洗，擦后棉球不显黑；柜内垃圾当日及时清理；柜内所有实验操作应在酒精灯前进行；经常紫外杀菌；4、无菌间物件传递，经窗口紫外照射方可；5、有关试剂使用后及时用封口膜封住；6、细胞培养盖子旋松，以便二氧化碳气体进入；拿瓶、加液体均需注意瓶口，避免污染瓶盖；7、出门后需要用钥匙锁上；8、整个无菌间两周清洁一次；免疫动物：选择与瘤细胞同一品系的动物做为免疫对象，现在常见的是Balbc/c小鼠，6-8周龄，一种抗原一次性注射2-3只小鼠，小鼠不宜过大，雌性相对较好；首次注射抗原100微克与等体积弗氏完全佐剂混匀，在背部两侧皮下与腹腔分别注射，形成几个小泡；间隔两周左右时间（14天）二次免疫注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，一般上次背部小泡依然存在；间隔两周左右时间（14天）三免小鼠注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，一般上次背部小泡依然存在；间隔7-10天左右时间尾部采血测定抗体效价：方法一：手拇指和食指从背部抓住小鼠颈部皮肤，将小鼠头朝下，小鼠保定后将其尾巴置于50°热水中浸泡数分钟，使尾部血管充盈。
擦干尾部，再用剪刀或刀片剪去尾尖1～2mm，用试管接流出的血液，同时自尾根部向尾尖按摩。
取血后用棉球压迫止血并用6%液体火棉胶涂在伤口处止血。
每次采血量0.1ml。
方法二：固定小鼠，一人捏住小鼠耳朵固定小鼠，同时抓住尾梢协助取血，另一个人左手捏住小鼠尾巴根部，右手用酒精棉球擦洗，使尾部血管充盈，食指抵住尾巴，用一次性1ml注射器穿刺血管，用10微升移液枪及时吸取全血2.5微升，加在盛有97.5微升的PBS缓冲液中稀释10倍，再稀释一百倍，之后做倍比稀释测定效价，读数到阴性血清值的 2.1倍，合理效价应高于12.8万倍。
单克隆抗体技术讲解
克隆化过程
单克隆抗体的制取
致敏淋巴细胞的准备
骨髓瘤细胞的准备
细胞融合
选择性培养
抗体分泌细胞的筛选
四、单克隆抗体制备过程
1.致敏淋巴细胞的准备 动物选择：品系、年龄、性别、健康状态 抗原接种：方式—体内、体外 剂量—0.5-100g 次数—视抗原而定 间隔—视抗原而定 佐剂—视抗原而定 收集时间：末次接种后72 h 2.骨髓瘤细胞的准备 细胞株处于良好的生长状态 细胞株保持HGPRT缺陷状态 HGPRT：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
没有单克隆抗体前人类所遇见的问题
银屑病 手口足病 癌症 亚急性湿疹
用于诊断鉴定人的血型类别 用于寻常型银屑病亚急性湿疹 用于复发或耐药的滤泡性中央型淋巴瘤 犬瘟热病毒单克隆抗体 单克隆抗体药物
一、单克隆抗体技术发展
Georges J.F. Kohler Cesar Milstein 1975年将产生抗体的淋巴细胞与肿瘤细胞融合, 成功建立了单克隆抗体技术。 1984年获得诺贝尔医学和生理学奖。
第四章 抗体工程制药 第三节 单克隆抗体的制备
Annual Work Summary Report
汇报人 | 小智
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2.单克隆抗体的概念和特点
3.单克隆抗体技术的应用
4.单克隆抗体的制备过程
01
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02
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03
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主要内容
固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围 反应强度不如多克隆抗体 制备技术复杂、费时费工、价格较高
1.检验医学诊断 （1）病原微生物抗原抗体的检测：乙肝表面抗原试纸 （2）肿瘤抗原的检测 （3）免疫细胞及其亚群的检测 （4）激素测定：早孕检测试纸、女性排卵检测试纸 （5）细胞因子的测定 （6）其他：吗啡类毒品检测试纸等 2.蛋白质的提纯 3.肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术
单克隆抗体
单克隆抗体技术【原理及意义】单克隆抗体技术(The technique of monoclonal antibody)是由Kǒhler与Milstein于1975年创立的。
他们发现将小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
单克隆抗体(monoclonal antibody,M cAb)具有结构均一、纯度高、特异性强、效价高、交叉反应少或无等优点,缺点是其鼠源性对人具有较强的免疫原性,反复人体使用后可诱导产生人抗鼠的免疫应答,从而削弱其作用,甚至导致免疫病理损伤。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产等一系列实验步骤。
下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前的准备(一)免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合的成功,获得高质量的M cAb 至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性而定。
1.颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例:免疫细胞数为每只小鼠1×107/0.5 m L生理盐水,腹腔注射。
1)初次免疫,间隔2～3周。
2)第二次免疫,间隔3周。
3)第三次免疫10天后,取血测效价。
4)加强免疫3天后,取脾融合。
2.可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂。
将抗原与佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状(放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态)。
1)初次免疫,Ag5～50微克/只,加弗氏完全佐剂皮下多点注射,一般0.2毫升/点,间隔3周。
2)第二次免疫,剂量途径同上,加弗氏不完全佐剂,间隔3周。
3)第三次免疫,剂量同上,不加佐剂,于生理盐水中腹腔注射,7～10天后采血测其效价,检测免疫效果,间隔2～3周。
4)加强免疫,剂量50μg为宜,腹腔或静脉注射。
单克隆抗体
克隆化方法
经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一 般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞 有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。克隆化的阳性杂交瘤 细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所 以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说，免疫性 强的抗原克隆次数可少一些，但至少要3～5次克隆才能稳定。克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、 软琼脂平板法及荧光激活分离法等。
周期第1天采血0.2ml（获得0.1ml免疫前血清） 第一次免疫（抗原加弗氏完全佐剂） 第14天第二次免疫（抗原加弗氏不完全佐剂） 第21天采血和ELISA检测 第35天第三次免疫（抗原加弗氏不完全佐剂） 第42天采血和ELISA检测 第56天第四次免疫（抗原溶于PBS或盐水） 第61天细胞融合
细胞融合
融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或 5:1最为常用。
1．试剂与材料 (1)供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。 (2)1640培养液100ml。 (3)完全1640液100ml。 (4)2.5%FCS－1640液50ml。 (5)HAT培养液100ml。 (6)50%PEG：取分子量4000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热 于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。 (7)10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。 (8)40孔塑料培养盘。
抗体纯化手册-
单抗表达量可达 1-2g/L。 类等等。Protein A Protein A 亲和层析如 MabSelect 做快速初纯，再配合疏水层析、分子筛
亲和层析脱落集团。 等多步纯化。
利用基因工程技术表达人源 宿主杂蛋白、核酸、 若以 E.coli 包涵体形式表达,可考虑用 Sepharose 4FF 先纯化包涵体，再
2. 癌症、心血管等疾病的导向治疗：以单抗荷载同位素、 毒素蛋白、抗生素等药物制成生物导弹。
3. 应用抗体 T 细胞、抗 IL-2R 的单抗防治器官移植排斥反 应等。
的结构域可以识别和结合特异性抗原。1987 年单抗技术被成 4. 以单抗制成避孕、传染病的预防药物。
功应用到诊断试剂当中，但由于 HAMA (人抗鼠抗体) 反应， 没能有效应用在人类疾病的治疗上。90 年代，随着基因工程 技术的迅速发展，治疗性单抗从早期 100% 的鼠源性单抗 (Mab)，到嵌合抗体，人源化抗体(Humanized Mab)，到近年 的全人源性抗体 (图1、2)，逐步消除了抗体的免疫源性问题， 在保持对抗原高亲和力的同时，改善了抗体的药动力学。
大多数 IgG 等电点高于一般血清蛋白，建议用阳离子交换层析 3 捕获浓缩抗体或分离纯化
大部分超过 pH6
除去大部分杂蛋白 (图 5)。注意：CHO 细胞表达的基因工程抗体 (Gab) 由于细胞培养过程
带来的糖基化的不均一，等电点往往较分散 (图 5)，选择离子交换层析条件时须注意。
疏水性
大多数 IgG 疏水性较强
抗体纯化手册
孙文改 陈昕·通用电气(中国)医疗集团 Bio-Sciences (原 Amersham Biosciences)
一、单抗技术的发展、应用和市场前景
Kohler 和 Milstein 于 1975 年发明了被称之为“魔弹”的单抗 技术，并在1984 年获得了诺贝尔奖。单抗是B淋巴细胞和骨 髓瘤细胞杂交形成的杂交瘤细胞产生，其重链和轻链所形成
单抗下游生产工艺手册
颇尔公司的Seize深层过滤的滤板由硅藻土、珍珠岩加 助滤剂混合而成，其中又分为P系列，HP系列和Bio系 列。
根据滤饼的形式又分为 Supra disc I, Supra disc II 和 Stax Capsules 三种，可分别与不锈钢的滤壳或Stax不 锈钢的底架整合一起使用。
先进的制药级 深层滤板
备注：具体产品选型和订购信息请直接联系颇尔公司当地销售。
6
（二）深层过滤技术——细胞培养液的澄清
细胞培养液的澄清是单抗分离纯化的首要步骤，用简单 的操作快速去除细胞和细胞碎片。吸附DNA和宿主细 胞蛋白质是这个阶段过滤分离的主要目的。通常CHO 培养的细胞培养液的细胞密度在2～7×106/ml，细胞存 活率在25～98%，浊度在500～1000NTU。如果培养 体积在1000L以内可以直接选择深层过滤技术来处理， 如果培养体积较大可以选择离心和深层过滤结合的方式 来处理料液。
HP 系列深层滤板
双层P级滤板组合 适合处理低存活率、高固液含量的细胞培养液 减少澄清处理工艺步骤 针对HP系列独立进行验证和发行《验证指南》
上层滤板：精度粗 底层滤板：精度细 导流盘 底层滤板：精度细 上层滤板：精度粗
深层滤板P级及HP级的精度选择
Bio 20 Bio 10 PDK5 PDH4 PDE2 PDD1 K900P K700P K250P K200P K100P S80P KS50P SEK1P EKMP EKSP
4
单抗生产中液体过滤器的选型
Supor® EKV ——缓冲液除菌过滤的首选
Ultipleat超级打褶 充分的除菌过滤验证 双层PES膜材，上游0.65um PES高度不对称膜， 下游0.2um对称PES膜 宽广的pH 兼容性 水通量12L/min @ 100mbar 107/cm2 缺陷型假单胞杆菌挑战，100%截留
人IgM(单克隆抗体) 说明书
小鼠抗人IgM（单克隆抗体）
本产品使用具有高效价抗体的小鼠腹水为原料，采用免疫亲和层析方法纯化，去除杂抗体，并采用免疫亲和层析方法纯化，制成高纯度（＞95%）高活性的抗人IgM（μ链特异）单克隆抗体。
纯度：≥95%
保存体系：10mM PBS、0.03%防腐剂、PH7.2
应用范围：Elisa、WB、IHC、金标、点膜、包被等科研、生产实验
稳定性：-20℃保存2年
产品规格：1mg、5mg、10mg、50mg
注意事项：
1.请根据实验需要选择最适工作效价，部分实验根据具体实验情况可在推荐工作效价
基础上进行增加或减小。
2.短期保存的抗体：如抗体几周内就会使用，收到后推荐在2-8℃保存，2-8℃短暂保
存数周对抗体活性没有影响。
3.长期保存的抗体：如抗体需超过1个月后才会使用，请酌情分装后于-20℃保存。
4.建议：将抗体保存在冰箱里层，避免温度变化造成反复冻融。
绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。
反复冻融过程中，冰晶会对抗体的空间结构造成破坏，导致蛋白变性形成多聚
体，从而降低抗体的结合能力，加快抗体降解速度。
单克隆抗体基础知识
1 .在肿瘤治疗方面的应用: 单抗药物抗肿瘤能有效地降低传统肿瘤药物治疗的不
良反应。如2005年我国开发出癌症治疗药——重组人 源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体(商品名：泰欣生)。泰欣生
联合放疗治疗鼻咽癌的完全缓解率比单纯放疗的患者提高
30%以上。
2 .在器官移植中的应用: 近年来 ,利用抗体药物作为实体器官移植的诱导治疗逐
人源化单克隆抗体：利用现有的无数已详细分析过的小鼠抗体，取其与抗原直接接触的那段抗体片段
（互补决定区，CDR）与人的抗体框架嫁接，经亲和力重塑，可维持其特异性和大部分的亲和力
，同时几乎去除免疫原性和毒副作用。
全人源单克隆抗体：其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用 。全人源抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、EBV 转化 B 淋巴细胞技术、噬 菌体显示技术（phage display）、转基因小鼠抗体制备技术（transgenic mouse）和单个B
——进行SDR移植改良
嵌合抗体
人源化抗体
3.SDR移植抗体(SDR grafted antibody)
在CDR移植抗体的基础上，将异源抗体中与抗原结合密 切相关的SDR等少数残基移植到人抗体相应位置上，进一 步降低了抗体的异源性。通过这种方法，使人源化的抗 体潜在的免疫原性降至最低。
4.全人单克隆抗体（Fully humaneantibody)
药物特异性很强，副作用大，现在已经渐渐退出市场。 不过由于其代谢比较快，目前在放射性元素标记的单克隆 抗体药物中使用。 第二代：人鼠嵌合性单抗
单克隆抗体
主要设备
组 织 培 养 材 料 的 准 备
• 液氮储存器
是细胞培养室的必要设备。杂交瘤细胞需要在液氮储 存器中保存。
主要设备
组 织 培 养 材 料 的 准 备
• 水浴恒温装臵
主要设备
组 织 培 养 材 料 的 准 备
• 冰箱
各种培养用的溶液，如培养液、 生理盐水、消化液、血清等都要储 存在0度或更低的温度条件下，普 通冰箱是单克隆抗体制备的必需设 备。血清、酶、消化液和配制好的 抗生素等溶液，需要低温保存以防 失去活性。不同生物制品要求保存 温度不同，有的在保鲜温度（4 度），有的则必须低温保存。因此， 尚须配臵-20度以下的低温冰箱。
培养基
组 织 培 养 材 料 的 准 备
• DMEM、RPMI-1640。
• 配制时干粉制剂搅拌全溶后，加水到需要 的体积。 • 除菌过滤分装。 • 使用前根据需要再加入适量的牛血清、抗 生素、碳酸氢钠、丙酮酸盐和谷氨酰胺等 成分。
血清
组 织 培 养 材 料 的 准 备
• 血清体外细胞培养中不可缺少的成分 。 • 牛血清分胎牛血清和小牛血清两种 。 • 实验前须对不同来源及批号的血清进行 筛选。 • 融合亲代细胞的培养一般采用含10％胎 牛血清培养基。但在融合、筛选及随后 的克隆中一般用含20％的胎牛血清培养 基。 • 根据需要在用前将胎牛血清灭活 。
B cell
-b -a
-c -d
脾 细 胞
传统抗体 (抗血清) 对 抗 原 的 反 应
细胞融合
PEG HAT -a -b Cell fusion
分株培养筛选
a b c d
+ + + +
-c
-d ELISA
单抗纯化手册
少 5 个柱体积的灭菌结合缓冲液洗涤。
Superdex 200能有效去除这些杂质。牛免疫球蛋白的污染
问题在单抗纯化中十分显著，一般来说用疏水层析和离
注意
子交换可能会除去此类杂质。白蛋白和转铁蛋白也可用
当使用 70% 乙醇时，需要有特定的规则 (防爆区域及设 离子交换和疏水的方法去除，有一些单抗比它们的疏水
涤步骤，以免过分减少产量。
4. 用脱盐柱对纯化的IgG片段进行去盐处理或者将其转移 实验条件
至适宜的缓冲液 (见 20 页)。
适宜的缓冲液 (举例)
5. G 蛋白琼脂糖介质的再利用：依样品的天然属性而定， 缓冲液A：0.05M硼酸，4.0M NaCl，pH=9.0
只可在前后样品相同的情况下实现，否则会产生交叉 缓冲液B: 0.05M磷酸钠，0.05M柠檬酸钠，0.3M NaCl，
亲和基质中配体脱落是一个问题，尤其是洗脱条件恶劣 时。A蛋白与琼脂糖介质的多位点结合保证其难以被洗下 脱离柱子，因而在广泛的洗脱条件下可以维持极低的配 体脱落水平。
-2-
rProtein A Sepharose 纯化单抗实例：
Protein G Sepharose 纯化单抗实例：
Column:
HiTrap Protein G HP, 1 ml and HiTrap Desalting
的结合能力。
即用至少5个柱体积的滤过灭菌的结合缓冲液 (pH=7 ~
4. * 在 BPGTM、FineLINETM、INdEXTM、ChromaflowTM 这
8) 洗柱，逆转流向。
些柱子中填充，其分离能力与所填体积成正比，易于线
性工艺放大。
注意：当使用高浓度有机溶剂时，应采用递增梯度避免气
单抗纯化手册
到片段的 pH 值最终近乎中性。
-3-
注意
10 mM HCl (pH 2)，10 mM NaOH (pH 12)，
1. 大多数免疫球蛋白在 pH 值高于 2.7 (或者更低) 时很难
0.1 M 20% 柠檬酸钠 /HCl (pH 3)，6M
被洗脱下来。因此洗脱条件往往比较恶劣，如果由此导
GuHCl，20% 乙醇，2% 苯甲醇；
它与琼脂糖介质有许多结合位点，如此紧密的结合力把
脱落水平减小到了最低。事实上在相当广泛的洗脱条件
下，该介质只有极低水平的配体脱落。
** 鉴于洗脱条件可能十分恶劣，建议将洗脱的单抗片段
收集于中和缓冲液中 (每毫升片段60-200µl 1M Tris-HCl，
pH=9.0) 或用 Sephadex G-25 进行缓冲液交换，以保证得
亲和基质中配体脱落是一个问题，尤其是洗脱条件恶劣 时。A蛋白与琼脂糖介质的多位点结合保证其难以被洗下 脱离柱子，因而在广泛的洗脱条件下可以维持极低的配 体脱落水平。
-2-
rProtein A Sepharose 纯化单抗实例：
Protein G Sepharose 纯化单抗实例：
Column:
HiTrap Protein G HP, 1 ml and HiTrap Desalting
充床层析中可以从大量的样品中分离出单克隆抗体。
* 沉淀或变性的物质：以 2 个柱体积的 6M 胍或者 10 mM
特点 1. 其设计保证一天内可以完成超过10000升高表达发酵样
NaOH or 0.1 M H PO 清洗后，立即以5 个柱体积滤过
2
34
灭菌的结合缓冲液 (pH=7 ~ 8) 洗柱，逆转流动方向
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单克隆抗体技术第一节单克隆抗体的研制一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。
常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。
一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。
即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。
因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。
由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学实验等使用中带来许多麻烦。
因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。
随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。
1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。
这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。
通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞地单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。
与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。
单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。
Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。
二、杂交瘤技术（一）、杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了技术贮备。
1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的着名论文。
他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。
融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。
在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT 培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。
实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。
用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。
生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。
这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。
最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。
随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。
再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。
（二）、基本程序和方法杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。
本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。
在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。
其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。
此外，杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备，依据检测单抗的方法不同而各异，请参阅本节有关部分。
淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等，图6-1概括了淋巴细胞杂交瘤技术研制单抗的主要过程。
1、动物免疫（1）抗原制备制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。
因此，免疫抗原是越纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。
一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。
检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。
（2）免疫动物的选择根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。
因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c 小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。
但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。
种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。
就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。
（3）免疫程序的确定免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。
因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。
没有一个免疫程序能使用于各种抗原。
现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。
表6-1列举了目前常用的免疫程序。
免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。
最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。
在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。
笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系，且多在血清抗体高峰之前。
因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞，这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。
已有人报道采用脾内免疫，可提高小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间，一般免疫3天后即可融合。
体内免疫法使用于免疫原性强、来源充分的抗原，对于免疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的抗原就不适用了。
如果制备人单克隆抗体几乎不大可能采用体内免疫法。
因此，针对这些情况，可采用体外免疫。
所谓体外免疫就是将脾细胞（或淋巴结细胞，或外周淋巴细胞）取出体外，在一定条件下与抗原共同培养，然后再与骨髓瘤细胞进行融合。
其基本方法是取4-8周龄BALB/c小鼠的脾脏，制成单细胞悬液，用无血清培养液洗涤2-3次，然后悬浮于含10%小牛血清的培养液中，再加入适量抗原（可溶性抗原ml，细胞抗原105-106个细胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺细胞培养上清液；在37℃，6%CO2浓度下培养3-5天，再分离脾细胞与骨髓瘤细胞融合。
表6-1 不同免疫抗原的免疫程序2、细胞融合（1）主要试剂的配制A、细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，具体配制方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌（），分装，4℃保存。
不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液96ml，100×.溶液1ml，双抗溶液1ml，% NaHCO3溶液1-2ml，HEPES溶液1ml。
不完全DMEM培养基：DMEM ，超纯水或四蒸水980ml，NaHCO3，双抗溶液10ml，100×.溶液10ml，用1N HCl调试PH至，过滤除菌，分装4℃保存。
完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml，小牛血清15-20ml。
用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后的杂交瘤细胞培养。
HT培养基：完全RPMI-1640或DMEM培养基99ml，HT贮存液1ml。
HAT培养基：完全RPMI-1640或DMEM培养基98ml，HT贮存液1ml，A贮存液1ml。
a、氨基喋呤（A）贮存液（100×，4×10-5mol/L）称取氨基喋呤（Aminopterin MW ），溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。
过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。
b、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液(100×,H:10-2mol/L，T：×10-3mol/L）称取次黄嘌呤(Hypoxanthine,MW 和胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW ，加超纯水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃冻存。