Western blot ,帮你理解
western blot原理
western blot原理
Western blot是一种常用的蛋白质分析技术，用于检测目标蛋
白质在样品中的存在和定量。
其原理基于蛋白质的分子量以及特异性抗体的结合能力。
首先，将待测样品经过蛋白质电泳分离，根据蛋白质的分子量大小在凝胶中形成条带。
然后，将凝胶中的蛋白质转移到固定在膜上的尼龙或聚vinylidene fluoride(PVDF)膜上，这个过程
称为电转印。
转移完成后，将膜进行封闭以防止非特异性结合，并将膜与特异性的抗体经过孵育。
接着，使用次级抗体与被检测蛋白质特异性抗体进行结合。
这些次级抗体通常是将小鼠或兔抗体注入到其他动物中产生的。
并且，次级抗体通常标记有一种酵素，如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)。
通过这种方式，当次级抗体与特异
性抗体结合并与目标蛋白质形成复合物时，可以通过化学反应产生可见的信号。
最后，通过一系列实验步骤，利用比色法或化学发光方法检测蛋白质与特异性抗体的结合情况，从而确定待测样品中目标蛋白质的存在和定量。
综上所述，Western blot利用蛋白质电泳和特异性抗体的结合
原理来检测目标蛋白质在样品中的存在和定量。
通过将蛋白质从凝胶转移到膜上，并使用特异性抗体和次级抗体进行结合，然后通过化学反应产生可见信号，最终确定目标蛋白质的存在。
westernblot
封闭
在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封 闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。封闭一 般采用异源性蛋白质，常用的有2%BSA，5% 脱脂牛奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应 考虑与检测试剂相适应，其次是尽可能使非特 异着色背景浅。
蛋白浓度测定：BCA法
测定原理：利用碱性溶液中的铜试剂与 供试样品中的蛋白质形成铜-蛋白质复合 物来还原磷钼酸-磷钨酸试剂，得到的反 应液为深蓝色的溶液。根据比色测得的 吸光值，即从标准曲线推算出样品中蛋 白质的含量。
BCA法操作步骤
配制蛋白标准 加样 ：标准蛋白、待检测样品 加显色工作液，混匀，孵育显色 酶标仪检测 作出标准曲线，计算浓度
Western Blot 技术简介
珠江医院神经外科实验室
概述
Western Blot 中文意思为蛋白质印迹， 它是分子生物学、生物化学和免疫遗传 学中常用的一种实验方法。
Western Blot原理
通过电泳分离不同分子量大小的蛋白组 分，然后将凝胶上的蛋白转移至固相支 持物如(PVDF膜)上，再使用特异性抗体 作为探针，与蛋白质抗原发生免疫反应， 最后通过底物显色或放射自显影对靶蛋 白进行检测。
37℃封闭2h，也可在4℃过夜。
抗体杂交
主要采用间接法。即先加入未标记特异 性第一抗体（兔抗Neurocan）与膜上抗原 （Neurocan蛋白）结合，再加入标记的第二 抗体（羊抗兔- HRP ）进行杂交检测，标记 二抗的物质有放射性核素、酶、以及生 物素等。
一抗
１）膜放入杂交袋中，加入一抗，封口， 37℃孵育2h或4℃孵育过夜。
转膜注意事项
每层之间不能有气泡，可以用10ml吸管 轻轻在上一层滚动去除气泡。
western blot 显示原理
western blot 显示原理题目：西方印迹技术的显示原理导言：西方印迹（Western blot）是一种常用的生物化学分析技术，用于检测蛋白质的存在并确定其相对数量。
本文将深入探讨西方印迹技术的显示原理，并分享我对该技术的观点和理解。
一、西方印迹技术简介西方印迹技术是通过将复杂的生物样本中的蛋白质分离、转移至固体介质上，并通过特异性的抗体结合来检测目标蛋白质的存在。
该技术可用于检测蛋白质的表达水平、翻译后修饰、蛋白质交互作用等。
二、西方印迹技术的显示原理1. 分离蛋白质西方印迹技术通常从细胞或组织样本中提取蛋白质。
提取后的蛋白质需要通过电泳技术进行分离，常用的方法有SDS-PAGE和PAGE两种。
这些分离方法通过根据蛋白质的大小和电荷将其分离成不同的带状条带。
2. 转移蛋白质分离出的蛋白质需要被转移到固体介质上以进行后续的抗体结合和检测。
最常见的转移方法是将带状蛋白质移至聚丙烯酰胺凝胶膜（PVDF）或硝酸纤维素膜中。
转移过程可以通过电泳法进行，将带状蛋白质从凝胶中迁移到固体介质上。
3. 特异性抗体结合转移完成后，膜上的蛋白质需要与特异性抗体结合。
这些抗体可以与目标蛋白质上的特定抗原位点结合，形成抗原-抗体复合物。
抗原-抗体的特异性结合使得我们能够检测和定量感兴趣的蛋白质。
4. 蛋白质检测为了检测蛋白质的存在，通常使用荧光或酶促反应来产生信号。
最常用的方法是使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等酶来催化荧光素底物或染色底物的反应，产生可见的信号。
这些信号可以通过相机或仪器来捕获和分析，从而确定目标蛋白质的存在与相对数量。
三、我的观点和理解西方印迹技术作为一种常用的蛋白质分析技术，在生命科学研究领域发挥着重要作用。
通过该技术，我们可以了解蛋白质在细胞或组织中的表达变化、参与的信号通路、蛋白质的修饰以及蛋白质之间的相互作用等信息。
然而，西方印迹技术也存在一些局限性。
该技术需要大量步骤和耗时的操作，对实验人员的技术要求较高，存在一定的操作风险。
western blot技术
百泰派克生物科技
western blot技术
蛋白印迹（Western Blot，WB）也称免疫印迹，是一种基于抗体的蛋白质分析技术。
利用抗体-抗原的特异性相互作用可以在复杂的蛋白质混合物中识别感兴趣蛋白
（目标蛋白质），以实现感兴趣蛋白的定性和半定量分析，在蛋白质表达水平、抗
体活性、蛋白质相互作用以及蛋白质翻译后修饰分析中广泛应用。
WB主要包括以下步骤：
（1）样品分离：利用SDS-PAGE分离蛋白混合物；
（2）转膜：将蛋白条带从凝胶转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。
固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的蛋白质生物学活性不变。
转移后的
NC膜就称为一个印迹（blot）；
（3）标记鉴定：用目标蛋白的抗体（一抗）处理NC膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。
用一抗处理过的NC膜再用二抗处理，二抗是指一抗
的抗体。
通常，第二抗体带有特殊标记，当与合适的底物结合时，会产生可检测的荧光信号，信号强度与膜上的目标蛋白的丰度相关。
通过以上步骤，可以捕获与一抗相互结合的感兴趣蛋白，用于判断感兴趣蛋白的存在与否以及一抗与感兴趣蛋白的相互作用分析；此外，还可根据荧光信号强度对目标蛋白进行半定量鉴定，用于蛋白质白表达水平分析。
百泰派克生物科技基于蛋白印迹WB以及Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC提供蛋白质分析服务技术包裹，包括蛋白质定性定量
鉴定、蛋白质相互作用分析以及蛋白质翻译后修饰分析等，还可根据需求提供其他定制化检测方案，欢迎免费咨询。
westen blot原理
westen blot原理Western blot（又称为蛋白质印迹）是一种重要的蛋白质检测方法，它可以用于检测蛋白质的相对分子质量、数量和抗原特异性。
Western blot是通过将蛋白质样品经SDS-PAGE电泳分离后，将其迁移至膜上，然后使用特异性抗体对目标蛋白进行检测的技术。
Western blot 能够检测样品中可能存在于微量的蛋白质，并且能够区分具有不同结构或特征的不同蛋白质。
Western blot 的原理是：将蛋白质样品经SDS-PAGE电泳分离后，将其转移到聚丙烯酰胺或聚乙烯膜上，然后使用荧光素或辐射的能量使膜上的蛋白质变得容易检测。
Western blot 检测使用的抗体通常是标记有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素的二抗或其他特异性抗体。
其中辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶可以清晰地显示特异信号，并且可以通过开发和显色识别来显示相对定量。
Western blot 主要用于检测特定蛋白质，如抗体和结构蛋白，但是与其他定量蛋白质方法相比，Western blot 需要相应的蛋白质特异性抗体。
尽管Western blot已成为一种常见的蛋白质分析方法，但是它的应用也因其灵敏性、帮助诊断某些疾病和进行药学研究而备受欢迎。
Western blot 的优点包括：1. 可检测特定蛋白质，能够区分不同的蛋白质。
2. 可在单个实验中同时检测多个蛋白质。
3. 可定量检测蛋白质。
4. 可在不同样品中比较蛋白质表达水平。
Western blot 检测的主要步骤包括制备蛋白质样品、SDS-PAGE电泳、转膜和检测。
下面我们就将分别介绍这些步骤。
1. 制备蛋白质样品Western blot 检测的首要步骤是样品的制备。
样品的制备是决定Western blot检测结果是否准确的关键。
在制备样品时，鼓励使用相同的样品制备方法和提取技术，包括细胞溶解、组织破碎和蛋白质提取等技术。
样品的制备要求能够尽可能避免蛋白质的失活和降解。
westernblot详解PPT课件
蛋白质Marker
➢主要目的是确定靶蛋白的分子量大小； 使用预染的Marker还可以实时检测电泳 分离情况，并可以转移到膜上。
Fermentas
Prestained protein ladders Unstained protein ladders
第29页/共53页
上样缓冲液 Loading buffer
第6页/共53页
第7页/共53页
一 配分离胶
准备物品： 玻璃板 洗衣粉 灌胶架 移液枪 两个烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（ PH=8.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度 ） ，SDS（常温） 1 清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻擦 洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2O冲洗干净后立在 通风处或烘箱中 2 配制分离胶： 玻璃板对齐后放入夹中加紧，注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡 在架子上准备灌胶。 先配制分离胶。配方如下：
1.将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（
5ml离心管）。
2.匀浆器进行匀浆，注意冰上操作，匀浆后置于
冰上。
3.10，000g ,4℃,10min,（5ml管）离心
4.取上清至1.5ml管，12，000g ,4℃,60min,
离心
5.取上清至新1.5ml管,-80℃储存
第22页/共53页
3·1·2 蛋白样品浓度的测定方法
第18页/共53页
3·1 固定
①用ddH2O水冲洗一下玻璃板，将其放入电 泳槽中。注意，小玻璃板面向内，大玻璃板 面向外。
②向电泳槽中加入1x电泳液
• 5X电泳液缓冲液 ③Tr拔is（掉M梳W子1，2注1.1意4动）作轻柔。
Western Blot详解
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLiii.底物荧光ECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题5.Marker的相关疑问6.染色的选择7.参照的疑问8.缓冲液配方的常见问题9.条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类现常用的得有第五化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
Westernblot,帮你理解
3.SDS-PAGE电泳 原理：
Western Blot 的具体步骤
SDS 是一种离子性的界面活性剂, 它有强离子性的硫酸根离子也带有 疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质 混合时,它会以其碳链与蛋白质之 疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来, 而以硫酸根离子外露与水分子作用. 大多数蛋白质和 SDS 的平均结合 量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白 质结合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带 电价微不足道,且每单位重量之蛋 白质带电价一致 (charge density), 所以决定不同蛋白的泳动速率就只 剩下分子大小一项因素
• 4. 10％过硫酸胺（AP）
• 过硫酸胺 0.1g • 蒸馏水 1ml • （现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管 中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后， 4℃保存，保存时间为1周）
• 5．
•
四甲基乙二胺原液 （TEMED）： 4 C保存。 6． 30%丙稀酰胺： 4 C保存。
Western Blot 的具体步骤
5.转膜后检测：（立春红染色）
为检测转膜是否成功，可用相关染料对膜进行染色。
1x立春红 5min
染色前
染色后
Western Blot 的具体步骤
6.封闭
为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜 的封闭，常用的封闭液： 不能用于磷酸化蛋白！ 脱脂奶粉（ 5％） BSA（5％） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司 提供） 封闭条件： 4°C摇动，封闭1 hour，再用 TBST洗5秒，进入下一步抗体的孵育。
Western Blot 的具体步骤
4.转膜
表5 PVDF膜、NC膜、尼龙膜特点比较
(最新整理)westernblot详解
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至
2021/7/26
36
20%
（2）夹子黑的一面：海绵-3张滤纸-胶-NC膜-3张滤纸海绵
①将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵 垫。在垫子上垫三层滤纸，固定滤纸,擀去其中的气泡。
②刮去玻璃板上的浓缩胶，小心剥下下层胶，用手调整 使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将NC膜盖于 胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除 去气泡。膜盖下后不可再移动。最后盖上另一个海绵垫， 擀几下就可合起夹子。
2021/7/26
10
具体情况依照说明书
2021/7/26
11
灌分离胶： 用1ml的移液枪吸取1ml胶沿玻璃放出，溶液缓 慢加入到装配好的玻璃板中至凝胶高度为6cm左 右，预留1.5cm高度配制浓缩胶。 用1ml的移液枪吸取1ml左右的异丙醇，压平。 沿玻璃放出，注意速度要慢，否则胶会被冲变形 。 温箱放置0.5-1h左右至聚合完全。
注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌胶， 灌胶速度须缓慢，避免产生气泡 灌胶之上轻轻加一层异丙醇，用来压平
2021/7/26
12
灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%
2021/7/26
13
二 配制浓缩胶
准备物品： 移液枪 烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） Tips： 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（PH=6.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度） ，SDS（常温）
制作标准曲线 （插入表格）
检 测 样 品 蛋 白 含 量 ： 取 一 管 考 马 斯 亮 蓝 +95 l
western blot检测细胞凋亡蛋白原理
一、前言在细胞生物学和分子生物学研究中，western blot（蛋白免疫印迹）是一种常用的技术，用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的表达水平。
其中，检测凋亡蛋白是western blot中的重要应用之一。
本文将介绍western blot检测细胞凋亡蛋白的原理，以帮助读者更深入地理解该技术的工作机制。
二、细胞凋亡概述1.细胞凋亡的概念细胞凋亡是一种程序性逝去过程，又称为细胞自我杀死，是机体内原有的一种生理性消亡方式。
在凋亡过程中，受损或老化的细胞通过一系列分子信号通路最终导致细胞逝去，而不会引起周围组织的炎症或损伤。
2.凋亡与细胞凋亡蛋白细胞凋亡是由一系列蛋白质调控的复杂过程，其中包括凋亡抑制蛋白和凋亡诱导蛋白。
检测这些蛋白的表达水平有助于了解细胞凋亡的调控机制和相关疾病的发生。
三、western blot的基本原理1.western blot的步骤western blot技术主要分为蛋白样本制备、SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白、转膜、免疫印迹和膜显色等步骤。
其中，免疫印迹是最关键的步骤，用于检测目标蛋白的存在和表达水平。
2.细胞凋亡蛋白的western blot检测通过western blot技术可以检测凋亡相关蛋白，如Bcl-2家族、caspase家族和PARP等蛋白的表达水平。
主要流程包括：a) 细胞裂解并提取蛋白样本b) SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白c) 将分离的蛋白转膜到聚丙烯酸膜上d) 使用特异性抗体结合目标蛋白e) 使用辅助抗体结合一定的酶标记物f) 基于酶标记物的光学信号检测蛋白带四、western blot检测细胞凋亡蛋白的原理1.选择特异性抗体western blot的关键是选择特异性抗体，以保证目标蛋白的特异性检测。
通常可以通过文献资料或商业抗体公司获取针对目标蛋白的特异性抗体。
2.抗原和抗体结合在免疫印迹过程中，特异性抗体与其结合的抗原蛋白发生反应形成复合物。
这一步骤是确保检测凋亡蛋白的关键步骤，需要保证抗体的特异性和蛋白的完整性。
westernblot原理及步骤
1.western blot即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
2.原理简单来说就是原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。
通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗.经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变.以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
3.分类Western Blot显色的方法主要有以下几种：i.放射自显影ii.底物化学发光ECL iii.底物荧光ECF iv.底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL.只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带.4.其他值得一提的是,western blot 这个名称的由来很有意思.最开始做印迹工作的是一个叫做Southern的科学家,但印迹的对象是DNA 链,他把这种技术称为Southern blot,后来类似的出现了两个过程相似,但是对象不同的印迹方法,一个针对RNA,一个对蛋白质,人们分别把这两种技术的称为Northern和Western,与这两个技术的发明人没有关系了.。
Western-Blot-原理和操作方法(全)要点
Western Blot 原理和操作方法（全）工作原理蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用.SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS 与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基.样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳.另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.重要参数①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算:T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100%其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml)②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度:蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%)<10420-301×104-4×10415-204×104-1×10510-151×105-5×1055-10>5×1052-5蛋白分子量 (kDa)凝胶浓度 (%)4-40 20 12-45 15 10-70 12.5 15-100 10 25-2008③分离胶（5ml 体积）:5%的积层胶的配置：蛋白质的样品制备：蛋白质的样品制备是Western Blotting 的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
Western_Blot详解及问题分析
Western BlotFra bibliotekSDS：
阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电 荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线 性化。
Western Blot
Western Blot
Staking gel Separating gel
注意事项： 1.抗原样品与缓冲液混合水浴加热时不要进水！最好采用空气浴； 2.电泳Buffer最好不要重复利用，因为样品比较珍贵，而电泳液相对廉价； 3.Buffer一定要漫过梳子孔，否则就会发现蛋白跑不动； 4.电泳时先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度， 慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白。
蛋白质-SDS胶束的特点：
（1）具有相同的形状，形状 像一个长椭圆棒
（2）平均1g 蛋白质结合
1.4g SDS （3）短轴对不同的蛋白质亚 基-SDS胶束基本上是相同的 （4）长轴的长度则与亚基分
子量的大小成正比
Western Blot
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
不连续的电泳缓冲体系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电 荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。
Western Blot
Western Blot 流程
蛋白样品的制备
•SDS-PAGE •转膜 •封闭 •一抗杂交 •二抗杂交 •底物显色
Western Blot
蛋白样品的提取
通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白
水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系 统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质 最常用的溶剂 。
Western Blot概述及步骤
W estern Blot概述及步骤Western Blot概述及步骤Western Blot（WB）是通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。
WB进行蛋白质分析最流行和作成熟的技术之一，超过60% 的生命科学工作者使用该方法。
根据凝胶电泳的类型，WB可分为：*还原（变性）WB：最常用的一类，使用SDS-PAGE电泳。
主要是来检测蛋白质的特性、存在与否、蛋白质的同源性以及估计蛋白质的分子量等*非还原（非变性）WB：主要用来分析蛋白质的结构、保持蛋白的活性的。
一般不使用SDS、DTT等变性剂。
成功完成Western Blot检测，必须满足4个条件：*凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析* 吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析*处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上*处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测成功进行WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：*阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率*阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性*二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性*内参对照：检测标本的质量和二抗系统*空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果Western Blot概述及步骤Western Blot（WB）是通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。
WB进行蛋白质分析最流行和作成熟的技术之一，超过60% 的生命科学工作者使用该方法。
westernblot实验原理
westernblot实验原理
Western blot实验是一种常用的蛋白质分析技术，其原理涉及蛋白质的分离、转移和检测。
首先，样品中的蛋白质会被电泳分离成不同大小的片段，然后将这些片段转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接着，膜上的蛋白质会与特定的抗体结合，形成蛋白质-抗体复合物。
最后，通过添加特定底物，可以观察到这些复合物的位置和强度，从而定量分析蛋白质的表达水平。
这项技术在生物医学研究和临床诊断中被广泛应用，可以帮助科研人员和医生了解蛋白质的表达及其在疾病发生发展中的作用。
western blot 实验原理
western blot 实验原理Western blot是一种常用的蛋白质分析技术，通过将待检测样品中的蛋白质分离并转移到膜上，然后使用特异性的抗体探针进行特定蛋白质的检测。
Western blot实验主要包括以下步骤：1. 样品制备：待检测样品通常经过细胞裂解或组织研磨，提取蛋白质。
蛋白质溶液经过蛋白浓度测定后，可进行下一步实验。
2. SDS-PAGE电泳：蛋白质溶液经过加入含有SDS（十二烷基硫酸钠）的样品缓冲液，并在电泳条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel）分离蛋白质。
在电泳过程中，SDS会使蛋白质变成带负电荷的线性结构，相同大小的蛋白质在凝胶中的迁移速度也相似。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素（nitrocellulose）膜上。
转移通常通过将膜和凝胶在电流作用下接触，使蛋白质通过电场转移到膜上。
4. 阻断：将转移后的膜放入含有蛋白质的牛乳或鸡蛋清中，使未特异性结合位点被占据，阻断非特异性结合。
通过此步骤可以减少假阳性的可能性。
5. 抗体探针结合：将特异性抗体溶解在牛乳或鸡蛋清中，并将膜与抗体溶液接触。
抗体将与目标蛋白质特异性结合。
6. 信号检测：使用染色剂或酶标记的抗体来检测抗体-目标蛋白质结合的位置。
这些检测方法可以根据被标记物的类型而有所不同，如酶方法、放射性方法和荧光方法等。
7. 结果分析：使用成像系统（如X射线胶片或数码成像设备）捕捉膜上的信号，并在计算机软件中进行定量和定性分析。
Western blot技术可以用于检测蛋白质的表达水平、翻译后修饰以及蛋白质相互作用等，广泛应用于生物医学研究、生物制药和临床诊断等领域。
Western blot 详解
Western Blot详解Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
1、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
2、分类western显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
3、主要试剂（1）、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
实验室购买配置好的液体，无需重新配置。
4℃避光保存，用前20min放于室温。
（2）、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)10gSDS，100mlH2O去离子水配制，室温保存。
western blot 显影原理
western blot 显影原理Western blot 显影原理Western blot是一种常用的蛋白质检测技术，通过该技术可以检测特定蛋白质在混合样品中的存在和表达水平。
Western blot显影是Western blot技术中最为关键和重要的步骤之一，它使得被检测的蛋白质能够以可见的形式显示出来。
Western blot显影的原理基于免疫检测和酶促反应。
在Western blot 实验中，首先将待检测的蛋白质样品经过SDS-PAGE电泳分离，然后将分离出的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接下来，将膜与特异性抗体进行孵育，使其与目标蛋白质发生特异性结合。
随后，通过洗涤去除未结合的抗体，并加入与抗体结合的二抗。
这些二抗通常是与酶结合的抗体，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）结合的抗体。
在第二次孵育后，通过洗涤去除未结合的二抗。
在Western blot显影过程中，添加了一种特定的底物。
例如，在使用HRP的情况下，常用的底物是3,3'-二氨基苯基丙烷（DAB）或4-氨基乙基噻唑（ABTS）。
在添加底物后，酶催化底物发生氧化还原反应，生成可见的沉淀物或颜色反应。
这些沉淀物或颜色反应可以在光学显微镜下观察到，从而确定目标蛋白质的存在和表达水平。
Western blot显影原理的关键在于特异性抗体与目标蛋白质的结合，以及酶催化底物的氧化还原反应。
特异性抗体与目标蛋白质结合后，通过洗涤去除未结合的抗体，避免了非特异性信号的产生。
酶催化底物的添加使得目标蛋白质以可见的形式呈现，从而实现对蛋白质的定量和定性分析。
Western blot显影原理是通过特异性抗体与目标蛋白质的结合，再经过酶催化底物的氧化还原反应，使得目标蛋白质以可见的形式显示出来。
这一步骤是Western blot技术中至关重要的一步，为研究人员提供了一种直观和可靠的方法来检测蛋白质的存在和表达水平。
通过Western blot显影，我们可以进一步了解蛋白质的功能和作用机制，为相关研究提供有力的支持。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Western Blot
（3） 电泳
电泳时间一般4～5 h，电压为40V 较好， 也可用 60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终 止电泳，进行转膜。
Western Blot
Western Blot
Western Blot
（四） 转膜
（1） 转一张膜需准备 6 张7.0～8.3cm 的滤纸和1 张7.3～8.6cm 的硝酸纤维素膜。 切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的 蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置 于水上浸2 h 才可使用。（用镊子捏住膜 的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使 膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样 由于毛细管作用可使整个膜浸湿。 若膜沉 入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这 样会阻止膜吸水。
PBST(TBST)洗涤3 次，每次10分钟。
Western Blot 的具体步骤
7.免疫反应
不同二抗稀释浓度的效果图
Western Blot 的具体步骤
8.显色（结果检测）
显色方法 酶促底物发光法 代表类型 DAB显色法 特点 稳定性好，灵敏度 较高（250pg）， 背景一般，成像性 较差，药品疑有一 定致癌性。 稳定性好，灵敏度 高（10-12g），背 景可以很低，成像 性好，且可以重复 标记，
Western Blot 的具体步骤
4.转膜
表5 PVDF膜、NC膜、尼龙膜特点比较
Western Blot 的具体步骤
4.转膜
转膜准备
Western Blot 的具体步骤
4.转膜
制作“三明治”
Western Blot 的具体步骤
4.转膜
转膜条件： 推荐：100V ，1——2小时；根据蛋白大小以及胶厚度的不同而不同。
Western Blot 的具体步骤
5.转膜后检测：（立春红染色）
为检测转膜是否成功，可用相关染料对膜进行染色。
1x立春红 5min
染色前
染色后
Western Blot 的具体步骤
6.封闭
为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜 的封闭，常用的封闭液： 不能用于磷酸化蛋白！ 脱脂奶粉（5％） BSA（5％） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司 提供） 封闭条件： 4°C摇动，封闭1 hour，再用 TBST洗5秒，进入下一步抗体的孵育。
• 2. 1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8）
• Tris (MW121.14) 18.671g • 蒸馏水 100ml • 溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。
• 3. 10％SDS
• • • • SDS 10g 蒸馏水至 100ml 如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。 如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
Western Blot 的具体步骤
7.免疫反应
1.按照抗体说明书建议的稀释倍数，用TBST稀释抗体； 2.抗体孵育时间：室温下孵育1～2h或4℃过夜（一般不超过18小 时）； 3. 保持适当的摇动使抗体与膜的结合均匀；
Western Blot 的具体步骤
7.免疫反应
上二抗
摆床上，二抗杂交，室 温（25℃左右）1h， 或4℃过夜。
仪器： 凝胶成份：
丙烯酰胺 N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 过硫酸铵 TEMED H 2O
电泳缓冲液：
Tris-甘氨酸溶液
Western Blot 的具体步骤
3.SDS-PAGE电泳
1.制胶 需紧密固 定！！
Western Blot 的具体步骤
3.SDS-PAGE电泳
2.上样 每孔上样量为 20-50 μg蛋白；根 据目的蛋白的表达 情况的不同而有所 变化。
3.SDS-PAGE电泳 原理：
Western Blot 的具体步骤
SDS 是一种离子性的界面活性剂, 它有强离子性的硫酸根离子也带有 疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质 混合时,它会以其碳链与蛋白质之 疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来, 而以硫酸根离子外露与水分子作用. 大多数蛋白质和 SDS 的平均结合 量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白 质结合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带 电价微不足道,且每单位重量之蛋 白质带电价一致 (charge density), 所以决定不同蛋白的泳动速率就只 剩下分子大小一项因素
DNA重组技术
siRNA的转染技术
表观遗传学（甲基 化，miRNA） 凡是涉及蛋白水平检测的研究，均可运用到western blot技术
为什么要作蛋白质印迹实验？
研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存 在样品当中
蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样 品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。
• 下层胶
• 依次加入
• • • • • 去离子水 30%丙烯酰胺 5ml 1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml 10%SDS 150μl 10%AP 150μl TEMED 6μl5% 5.9ml
• 上层胶
• 依次加入
• • • • • 去离子水 4.1ml 30%丙烯酰胺 1ml 1M Tris-HCl（pH6.8） 0.75ml 10%SDS 60μl 10%AP 60μl TEMED 6μl
Western blot
是什么？
Western Blot
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应 的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝 酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－DNA 杂交检测特定的DNA片段的方法，称为 Southern印迹法。
• 9．
• • • •
10XTBS缓冲液
Tris（MW121.14） 24.2g NaCl 80.0g 蒸馏水至 1000ml （浓盐酸调pH至7.6），溶解后室温保存。
• 10．1XTBST缓冲液
• • • •
10XTBS缓冲液 100ml 蒸馏水 900ml Tween-20 1 ml 因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产 生气泡。 • 溶解后室温保存。
• 11．封闭液/抗体稀释液（5%脱
脂牛奶)：
• 1XTBST缓冲液 95-100 ml • 脱脂奶粉 5g • 溶解后4℃保存，可于一周内使用。
• 其他试剂
• 一抗、二抗、显影液、定影液、ECL化 学发光试剂 • A 和 B 两种试剂
Western Blot 的具体步骤
3.SDS-PAGE电泳
• 4. 10％过硫酸胺（AP）
• 过硫酸胺 0.1g • 蒸馏水 1ml • （现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管 中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后， 4℃保存，保存时间为1周）
• 5．
•
四甲基乙二胺原液 （TEMED）： 4C保存。 6． 30%丙稀酰胺： 4C保存。
Western Blot 的具体步骤
4.转膜 原理：
蛋白因结合SDS而带电 荷，转膜即在电场作用 下从胶中转至膜上的过 程。
Western Blot 的具体步骤
4.转膜
方法 仪器 特点
半干转
半干式转膜速度快，适 合与小分子量蛋白 两种方法的转 膜液不同！！
湿 转
湿式成功率高并特别适合用 于分子量大于 100KD的蛋白
• 7．
• • • • •
5X电泳液缓冲液
Tris（MW121.14） 15.1g 甘氨酸（MW75.07） 94g SDS 5.00g 蒸馏水至 100制成800ml即可。
• 8．
10X转膜缓冲液
• 甘氨酸（MW75.07） 151.1g • Tris（MW121.14） 30.3g • 蒸馏水至 1000ml • 溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。 • 通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最加160ml甲醇，配制成800ml即 可。（先加甲醇易产生沉淀）
埃德温· 迈勒· 萨瑟恩 （Edwin Mellor Southern）
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印 迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分 析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为 Eastern印迹法。
能做什么？
Western Blot
2、按前面方法配 10％分离胶，加入TEMED 后立即 摇匀即可灌胶。灌胶时， 可用 10ml 枪吸取 5ml 胶 沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。 然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶 时开始可快一些，胶快到所需高度时要放慢速度。 操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有 气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
Western Blot
3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已 凝了。再等 3min 使胶充分凝固就可倒去胶上 层水并用吸水纸将水吸干。
Western Blot
4、配4 ％的浓缩胶,加入TEMED 后立即摇匀即可灌 胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶 中。灌胶时也要使胶沿玻璃板以免胶中有气泡产生。 插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会 收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在 浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩 胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻 将其拔出。
Western Blot 的具体步骤
3.SDS-PAGE电泳
3.电泳
电泳条件： 推荐：浓缩胶 80V 35——45min 分离胶 120V 45——75min
Western Blot 的具体步骤
3.SDS-PAGE电泳