丹参种质资源遗传多样性的AFLP分析_温春秀

收稿日期:2007-05-30

基金项目:河北省科技攻关项目(06276409D)

作者简介:温春秀(1965-),女,河北藁城人,研究员,主要从事药用植物种质资源收集、品种选育研究通讯作者:谢晓亮(1962-),男,河北清苑人,研究员,主要从事药用植物栽培育种研究。

丹参种质资源遗传多样性的AFLP 分析

温春秀,吴志明,田 伟,刘 铭,周巧梅,谢晓亮

(河北省农林科学院经济作物所,河北石家庄050051)

摘要:对55份不同来源的丹参材料,采用扩增片段长度多态性(AFLP)标记,对丹参种质资源在DNA 水平上进行遗传多样性研究,利用NTSYSpc 2.1软件采用非加权配对算术平均法(UPGMA)方法进行聚类分析和计算遗传距离,构建遗传系统进化树。筛选得到的6对引物的扩增片段具有丰富的多态性,丹参种质资源存在很大的遗传变异,它们之间的相似系数为0123~0176,聚类分析将丹参种质资源分为4个主要类群。丹参种质资源存在丰富的遗传多态性,AFLP 聚类分析结果与表型特征不完全一致,可能是基因型和环境共同作用于表型的结果。

关键词:丹参;种质资源;扩增片段长度多态性(AFLP);遗传多样性

中图分类号:S567 文献标识码:A 文章编号:1000-7091(2007)增刊-0122-04

AFLP Analysis of Genetic Diversity of Salvia miltiorrhiza Bge

WEN Chun -xiu,WU Zh-i ming,TIAN Wei,LIU Ming,Z HO U Qiao -mei,XIE Xiao -liang

(Institute of Economic Crop Research,Hebei Academy of Agriculture and

Forestry Sciences,Shijiazhuang 050051,China)

Abstract:Amplified fragment length polymorphism (AFLP)was carried out to analyze genetic variation of 55Salvia miltiorrhiza Bge.collec ted in China,Unweighted pair -group method of with arithmetical avera ges (UPGMA)cluster ana-l

ysis using NTSYspc 2.1soft was used to construc ted a dendrogram to estimated the genetic distances among the popula -tions.All populations could be uniquely distinguished using 6selec ted primer combinations,similarity coefficients ranged from 0123to 0176among the populations,dendrogram revealed distinct segre gation of all the germplasms into four main groups.There is great genetic diversity within the tested 55collections in Salvia miltiorrhiza B ge,AFLP based phylogeny was not absolutely consistent with the based on morphological c haracters may be due to the interaction effect between genotype and environment.

Key words:Salvia miltiorrhiza B ge;Germplasm resourse;AFLP;Genetic diversity 丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)为唇形科(Labi -atae juss )鼠尾草属多年生草本药用植物,以根入药,具有活血调经、镇静安神、消肿止痛等功效[1]。近年来的研究发现,丹参在治疗心脑血管、降低/氧化疲劳0和抗病毒等方面均具有重要作用,能有效抑制体外肿瘤细胞的增值,能高效拮抗乙肝病毒核心抗原(HBe Ag),有较好的抗艾滋病毒(HI V)作用[2]

。丹参药材使用量越来越大,种植面积逐年增大,广泛分布于华北、华东、西南、西北等地,但是各地栽培的丹参种质资源混杂,而且不同地区的丹参种质资源药用成分含量差别很大,严重影响着丹参药材质量的稳定性,已经成为丹参规范化栽培(GAP)及优良丹参

品种(系)大面积推广的瓶颈。从分子水平上对全国的丹参种质资源进行遗传多样性分析,揭示这些丹参种质资源的遗传基础,对解决当前丹参种质资源混杂和指导丹参品种选育具有重要的意义。

1 材料和方法

1.1 材料

材料采自河北省农林科学院药用植物种质资源圃,根据植物形态特征初步确定了55个不同种质类型,其中C1-C5,C13,C16,C17,C25来自河北安国,C29来自河北井陉野生;C6,C10-C12,C14-C15,C26-C28,C40-C42,C45-C47,C49-C54来自山东;C7

-C9,

华北农学报#2007,22(增刊):122-125

C18来自甘肃;C19-C24,C43来自陕西;C30-C33来自河南卢氏,C34-C36,C44为河南灵宝;C37-C39,C48来自河南方城,C55来自四川中江。AFLP 分子

标记试剂盒购自鼎国生物技术有限公司。1.2 方法

1.2.1 丹参DNA 提取 采用C TAB 法进行丹参植物总DNA 的提取[8]。

1.2.2 AFLP 分析 采用Eco R I/Mse I 酶切组合进行试验,接头、引物序列以及试验方案按照鼎国公司AFLP 试剂盒的技术说明书进行。总DNA 以Eco R I 和Mse I 双酶切,然后加入Eco R I 和Mse I 接头和T4DNA 连接酶16e 连接过夜,其中所用的Eco R I 接头为:5c -C TC GTA GAC TGC GTA CC -3c ,Mse I 接头为:5c -GAC GAT GAG TCC TGA G -3c 。酶切连接产物稀释10倍后用于AFLP 预扩增反应模板,预扩增的引物为Eco R I 预扩引物序列:E1:5c -GAC TGC GTA CCA ATTCA -3c ,Mse I 预扩引物序列:5c -GAT GAG TCC TGA GTA AC -3c 。扩增反应条件:94e 4min;94e 1min,56e 1min,72e 1min;26个循环后,72e 再延伸10min 。预扩增产物稀释20倍后用于选择性扩增的模板。

选择性扩增引物序列为Eco R I 和Mse I 的核心引物序列加上3个选择性碱基。采用的引物组合为Eco R I/Mse I 引物组合。扩增反应条件:第一轮扩增参数:94e 30s,65e 30s,72e 80s;以后每轮循环温度递减017e ,扩增12轮;.接着按下列参数扩增23轮:94e 30min,55e 30s,72e 80s 。1.2.3 数据处理与分析 将电泳图谱的同一位置上的条带视为一个性状,有条带记为010,无条带记为/00。数据分析用GeneScan 和Genotyper

TM

软件分

析处理,峰值大于200的50~500bp 之间条带记为有效带。运用NTSYSpc 2.1软件分析计算Ne-i Li 遗

传距离和相似系数,聚类分析采用UPGMA 方法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

Eco R I+3/Mse I+3引物组合对5个差异表现大的丹参种质进行了多态性检测,选择扩增片段数较多和多态位点百分比较高的引物组合(表1)。结果选择的6对引物组合中,不同的引物组合所得到的扩增片段数在54~108条之间,平均为79条带,多态性扩增片段为45~96条带,平均为68条带,多态位点百分比在7411%~9113%之间,平均达到

8617%。可见,AFLP 检测丹参种质资源的遗传多样

性效率很高,也表明丹参种质资源的遗传多样性极为丰富(图1)。

2.2 55份丹参种质资源的聚类分析结果

依据55份丹参种质AFLP 分析由上述6套引物组合扩增的DNA 条带的统计数据,计算种质间的遗传相似系数而构建了系统树状图(图2)。从聚类分析证明丹参种质在遗传上表现出多态性极为丰富。在系统树状图中55份种质明显分为4组,第1组包括的种质最多,共有28个种质,主要包括了河北安国、甘肃、河南、山东和陕西等地的丹参种质,这个类群最多,种质在相似系数为0171时分为18个亚组。第2组包括3个种质为河北种质C3,C5和山东种质C6,分为2个亚组。第3组包括10个种质,按照相似系数为0165分为6个亚组,包括河南种质、陕西种质、山东种质和四川中江种质。第4组有13个种质,主要是山东种质和河南种质,分为6个亚组。丹参种质资源变异丰富,即使是同一地区的种质也表现极大的遗传变异,它们之间的相似系数仅为0123~0176,说明丹参的人工选择程度很低,且组内的遗传相似系数高于组间的遗传相似系数。

表1 6个筛选引物组合对5份丹参种质材料的

扩增多态性和多态率

Tab.1 The polymorphism amplified by 6selected primer combinations from 5Danshen germplasm

引物组合Pri mer crosses 扩增片段总数Total bands 多态性片段Polymorphic fragment 多态性位点百分率/%Percent

E+ACC/M+CAC7-2544583.3E+ACC/CTC7-6726387.5AAG/CAC 4-2856874.1AAG/CTA4-5585391.3AAG/CTG 4-71089688.8ACG/CA T 8-4998787.8总计/平均Total/Average

476/79

412/68

86.7

图1 55份丹参种质AFLP 分析图谱(选

择性引物E -AAG/M -CAC)

Fig.1 Banding patterns of Danshen materials amplified by the selected primer combination

E -AAG/M -CAC

3 讨论

AFLP 是一种广泛用于种质遗传多态性研究、作物品种的鉴定、基因定位种质鉴定和标记辅助育种

增刊温春秀等:丹参种质资源遗传多样性的AF LP 分析

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