Realtime PCR及产品介绍PPT课件
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最新实时荧光定量PCR技术的原理及应用RealtimePPT课件
1、SYBR Green 法
SYBR Green 熔解曲线分析
SYBR Green法优缺点
优点:
对DNA模板没有选择性
适用于任何DNA
使用方便--不必设计复杂探针
非常灵敏
便宜
2、TaqMan探针法
TaqMan作用机理
TaqMan法优缺点
Real-time PCR 方法应用
（如孔间、批间温度的波动）
Rn= Normalization = Reporter / Referenc
Rotor gene 6500HRM
特征：
36孔(普通透明0.2mlPCR管)或者72孔
(特殊0.1ml管)
离心式检测
可以做HRM。
MJ Opticon 2
特征：
可以素影响小
内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组
数量
相对定量：参照因子Calibrator
相对定量分析方法1 -ΔΔCt
前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏
差在 5％以内
1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test)
ΔCT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator)
2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率：
2 –ΔΔCT=表达量的比值
相对定量分析方法2：双标准曲线法
谢谢！
结束语
谢谢大家聆听！！！
38
PPT荧光定量PCR(共31张PPT)
➢ 3’端标记有荧光淬灭集团（Quencher，Q） ➢ 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发
荧光
➢ Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探针
荧光标记物的选择
绝对定量：指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本 的量，绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的 拷贝数或浓度
以不同稀释度的标准品为模板进行定量PCR并获得对应的CT，即可制作 标准曲线
25
y = -3.2461x + 26.443
20
R2 = 0.9976
15
E=103.2647%
10
5
0
0
2
4
6
8
以lg（CT）为纵坐标，lg（拷贝数）为横坐标，绘制标准曲线 扩增效率（E）= （10-1/斜率-1） × 100% 相关系数（R2）应大于0.99，越接近1越好 E应介于95%与105%，越接近100%越好
Ct值：每个反应管内的荧光信号达到荧光域值时所需的循环数。
✓ 每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，
CT值越小
✓ 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可 从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数
非特异性荧光标记 ➢ SYBR Green I
❖ 引物质量尽可能避免自身及上下游错配、发卡 结构
❖ 跨越内含子设计引物
❖ Primer-BLAST确认引物的特异性，避免扩增出 1000 bp以下的非目的产物
方法
优点
缺点
适用范围
绝对定量
定量准确
工作量较大， 需额外绘制目 标基因的标准 曲线
所有
相对定量
荧光
➢ Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探针
荧光标记物的选择
绝对定量：指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本 的量，绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的 拷贝数或浓度
以不同稀释度的标准品为模板进行定量PCR并获得对应的CT，即可制作 标准曲线
25
y = -3.2461x + 26.443
20
R2 = 0.9976
15
E=103.2647%
10
5
0
0
2
4
6
8
以lg（CT）为纵坐标，lg（拷贝数）为横坐标，绘制标准曲线 扩增效率（E）= （10-1/斜率-1） × 100% 相关系数（R2）应大于0.99，越接近1越好 E应介于95%与105%，越接近100%越好
Ct值：每个反应管内的荧光信号达到荧光域值时所需的循环数。
✓ 每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，
CT值越小
✓ 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可 从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数
非特异性荧光标记 ➢ SYBR Green I
❖ 引物质量尽可能避免自身及上下游错配、发卡 结构
❖ 跨越内含子设计引物
❖ Primer-BLAST确认引物的特异性，避免扩增出 1000 bp以下的非目的产物
方法
优点
缺点
适用范围
绝对定量
定量准确
工作量较大， 需额外绘制目 标基因的标准 曲线
所有
相对定量
Real-time PCRppt课件
特点： 高灵敏：至少可检出20pg DNA，高于 EB染色法25-100倍。 信噪比高：样品荧光信号强，背景信 号低。 操作简单：无须脱色或冲洗。 适用范围广：可适用于多种电泳分析 。 使用方便：不影响其它修饰酶作用。 经济：价格比银染便宜。
DNA交联荧光染料技术的评价
优点：成本较低，操作简单，无需对引物 或探针进行预先特殊的荧光标记，适用于 任何反应体系 缺点：特异性弱，因为染料也会结合到非 特异性扩增产生的双链分子和引物二聚体 中，使反应体系中的荧光本底较高。
R F Q Intact probe - reporter quenched by FRET R Reporter Q Quencher
R
Q R
Q
During PCR, probe hybridizes to target sequence
Probe is partially displaced during extension Probe cleaved by 5’- 3’ nuclease activity of polymerase Free reporter exhibits unquenched fluorescence
原理：扩增过程中，探针 与模板杂交时两种染料互 相接近，两探针能够进行 荧光共振能量的转移；转 移过程中，外来光源首先 刺激供体荧光染料，供体 便发光刺激附近的受体荧 光染料，使后者再发射出 具另一种波长的信号而被 检测系统接收。由于受体 荧光染料只有在两个探针 都与模板杂交时才会被激 发而发射荧光信号，所以 对信号的检测室在退火后 进行。
供体荧 光基团 受体荧 光基团
靶DNA
靶DNA
分子信标 (moclecular beacon )技术
该技术事一种基于荧光能量转移基础和碱基互补原则建立的技 术。分子信标实际是一段荧光素标记的寡核苷酸，结构是有环 状区和柄区组成，5’ 端标记报告基团R，3’ 端标记淬灭基 团Q在自由状态下，分子信标的结构呈发夹状
DNA交联荧光染料技术的评价
优点：成本较低，操作简单，无需对引物 或探针进行预先特殊的荧光标记，适用于 任何反应体系 缺点：特异性弱，因为染料也会结合到非 特异性扩增产生的双链分子和引物二聚体 中，使反应体系中的荧光本底较高。
R F Q Intact probe - reporter quenched by FRET R Reporter Q Quencher
R
Q R
Q
During PCR, probe hybridizes to target sequence
Probe is partially displaced during extension Probe cleaved by 5’- 3’ nuclease activity of polymerase Free reporter exhibits unquenched fluorescence
原理：扩增过程中，探针 与模板杂交时两种染料互 相接近，两探针能够进行 荧光共振能量的转移；转 移过程中，外来光源首先 刺激供体荧光染料，供体 便发光刺激附近的受体荧 光染料，使后者再发射出 具另一种波长的信号而被 检测系统接收。由于受体 荧光染料只有在两个探针 都与模板杂交时才会被激 发而发射荧光信号，所以 对信号的检测室在退火后 进行。
供体荧 光基团 受体荧 光基团
靶DNA
靶DNA
分子信标 (moclecular beacon )技术
该技术事一种基于荧光能量转移基础和碱基互补原则建立的技 术。分子信标实际是一段荧光素标记的寡核苷酸，结构是有环 状区和柄区组成，5’ 端标记报告基团R，3’ 端标记淬灭基 团Q在自由状态下，分子信标的结构呈发夹状
Real-time-PCR及产品介绍PPT课件
SYBR Green Ⅰ
SYBR Green染料法的特点
Taqman探针
Taqman MGB探针
HPV Real-time PCR产品主要厂家
市场主要荧光PCR HPV检测产品
凯普 12+2 High-risk HPV
适用的主要荧光PCR仪：LineGene 9660、ABI 7500、RotorGene 6000、Mx3005P、LightCycler 480、ABI ViiA 7
荧光超过本底时的临界数值。 荧光域值的默认设置是3～15个循 环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光 背景值和阴性对照的荧光最高值，同 时要保证在指数增长期。
Ct值
Ct值的定义：
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过 的扩增循环次数
C(t) value
Real-time PCR
PCR发展历程
❖ 第一代PCR——终点PCR ❖ 第二代PCR——实时PCR（Real-time PCR） ❖ 第三代PCR——数字PCR（Digital PCR）
实时荧光PCR的基本原理
❖ 通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实 时检测从而实现对起始模板定量（标准曲线）及定性 的分析。
PCR中常见问题分析
❖ 标本的采集与储存 ❖ 标本的制备——核酸纯化 ❖ 试剂准备、加样 ❖ 扩增、检测 ❖ 结果分析 ❖ 报告解释
标本的采集与储存
❖ 1、标本的采集 ❖ 严格按照要求采样，尽可能减少粘液和血液，采
集到尽可能多的宫颈脱落细胞
标本的采集与储存
❖ 2、储存条件
❖ ①提取前的原始标本
❖
一周内提取 4℃
❖
Real-time PCR技术介绍ppt课件
两类染料法的差异
在进行 HRM 分析时，由于饱和染料占据了 DNA 双链上每一对碱基 上的空位，所以在双链解链时，染料立即与双链脱离，使得荧光信号 发生较大的变化，而非饱和染料常发生位置上的迁移，从而对荧光信 号没有大的影响。除了LCGreen 染料外，常用的染料还有ResoLight、 EverGreen等，这些都是绿色荧光染料，最佳激发波长范围440-470nm， 发射荧光波长470-520nm。下图显示了饱和荧光染料 LCGreen 和非饱 和荧光染料 Sybr Green 的区别 ：
Real-time qPCR和常规PCR的区别
• 实时检测（在对数扩增时期）而不是 终点检测 • 敏感性高 • 需要样品少 • 特异性高 • 精确定量
Real-time PCR概述
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出， 该技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监 测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
荧光阈值（threshold）的设定
PCR反应的前15个循 环的荧光信号作为荧 光本底信号，荧光域 值的缺省设置是3~15 个循环的荧光信号的 标准偏差的10倍，即： threshold = 10 • SDcycle 3-15 。
同一模板在96孔PCR仪上做的96次重复实验
Ct值与起始模板的关系
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的 起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝 数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的 标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起 始拷贝数的对数， 纵坐标代Ct值。因此，只要 获得未知样品的Ct值，即可 从标准曲线上计算出该样品 的起始拷贝数。
荧光化学
实时荧光定量PCR (realtime PCR) 技术原理(Roche公司 PPT)
实时荧光定量PCR (realtime PCR) 技术原理(Roche公司PPT)Real Real--time time PCRPCR Principle 罗氏诊断产品罗氏诊断产品((上海上海广州办事处应用科学部实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR PCR技术原理技术原理普通 PCR 技术原理基于嵌入式染料的荧光定量 PCR 原理基于探针的荧光定量 PCR 原理荧光定量 PCR 技术平台的功能开发实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR PCR技术原理技术原理普通 PCR 技术原理基于嵌入式染料的荧光定量 PCR 原理基于探针的荧光定量 PCR 原理荧光定量 PCR 技术平台的功能开发PCR 原理信号放大原理PCR 产物的电泳检测和分析SYBR Green IHybProbe TaqMan Real-time PCR原理实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR PCR技术原理技术原理普通 PCR 技术原理基于嵌入式染料的荧光定量 PCR 原理基于探针的荧光定量 PCR 原理荧光定量 PCR 技术平台的功能开发Green ICp(Crossingpoint or Ct (Cyclerthreshold实时荧光定量 PCR 的原理公式N =N 02n =N0(1+En logN= log(1+En +logN0 logN 0= -nlog(1+E+logN Cp =n= -logN 0/log(1+E +logN/log(1+E(Y=kX+b结论:Cp 值与模板起始浓度的负对数成线性关系N :扩增产物量 ;N 0:启始模板量 ; N :循环数 ; E :扩增效率(0 ≤E ≤1实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR PCR技术原理技术原理普通 PCR 技术原理基于嵌入式染料的荧光定量 PCR 原理基于探针的荧光定量 PCR 原理荧光定量 PCR 技术平台的功能开发FRET 现象 (Fluorescence resonanceenergy transferTaqMan probeTaqMan probe principle Roche Applied Science 16杂交探针HybProbe－罗氏专利性技术－杂交探针 for sequence specific detection of DNA Fluorescein LC Red Denaturation Annealing Elongation End of Elongation Roche Applied Science 17实时荧光PCR检测结果 Roche Applied Science 18New Probe Format : SimpleProbe Format -高效低成本的新型探针 Denaturation phase: SimpleProbe free in solution; emission of reporter dye is quenched R Q R = Reporter (Fluorescein Q = Quencher 5‘ 3‘-p Annealing phase: Fluorescence from reporter dye increases when probe is annealed to it‘s complementary target R primer 3‘ Q 3‘-p 5‘ 5‘ Roche Applied Science 19实时荧光PCR技术的优势实时荧光PCR技术的优势 PCR 特异性强：引物和探针“双”，避免检测的假阳特异性强性。
最新实时荧光定量PCR介绍PPT课件
Probe设计要求高 Probe合成费用高
常用于mRNA表达量分析等
实时荧光定量PCR介绍
常用于SNP解析，病毒、病源菌检测
3/12/2024 • 11
主要内容
2
Real Time PCR实验方法
反转录反应
Real Time PCR反应
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 12
RT Primer的选择
体外转录RNA标准品构建流程
目的基因
RT
目的基因
Total RNA cDNA
T7 Promoter
PCR
目的基因
TTTT•••T
PCR产物
T7 RNA polymerase
AAAA•••A
体外转录RNA
AAAA•••A
RNA纯化后，测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。
• Random Primer • Oligo dT Primer • Gene Specific Primer
Random 6mer Primer Gene Specific Primer
Oligo dT Primer
PCR F-Primer PCR R-Primer
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 13
进行相对表达量分析。
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 32
相对定量解析方法
管家基因
维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、β-actin等。
筛选方法
• 根据文献提供 • 通过具体实验筛选
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 33
主要内容
《RTPCR技术原理》课件
缺点
对操作人员要求较高
RTPCR技术的操作较为复杂，需要经过专 业培训的操作人员才能保证结果的准确性
。
成本较高
RTPCR技术需要昂贵的仪器和试剂 ，导致检测成本较高，可能限制其
在资源有限地区的普及。
A
B
C
D
可能出现交叉污染
在操作过程中，如果样品或试剂受到污染 ，可能会导致交叉污染，影响检测结果的 准确性。
《rtpcr技术原理》ppt课 件
目录 CONTENT
• RTPCR技术概述 • RTPCR技术原理 • RTPCR实验操作流程 • RTPCR技术的优缺点 • RTPCR技术的应用实例
01
RTPCR技术概述
RTPCR技术定义
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号 检测DNA片段的扩增情况，并实时监测其变化的技术。
2000年
ABI公司推出高分辨率熔解曲线分析 技术，提高了SNP分型和突变检测的 准确性。
2004年
基于焦磷酸测序原理的实时荧光定量 PCR技术问世，提高了检测通量和灵 敏度。
RTPCR技术的应用领域
基因表达分析
突变检测
通过比较不同组织或不同处理条件下基因 的表达水平，研究基因的表达调控机制。
用于检测DNA序列中的点突变、插入和缺 失等变异，用于遗传病、肿瘤等疾病的诊 断和监测。
基因突变检测
总结词
RTPCR技术能够高效地检测基因突变，为遗传性疾病的诊断和治疗提供依据。
详细描述
基因突变是许多遗传性疾病的诱因，RTPCR技术通过对特定基因的扩增和荧光 检测，能够快速、准确地检测出基因突变位点及类型。这有助于遗传性疾病的 早期诊断和针对性治疗，为患者提供更好的医疗方案。
实时荧光定量PCR的原理操作及其应用PPT课件
Ct= -log X0 + log M (5)
log(1+Ex)
Log（x0的初始模板量）与到达阈值时的循环数（Ct值） 呈 线 性 关 系 ， 根 据 样 品 扩第1增3页达/共4到2页域 值 的 循 环 数 即 C t 值 就 可
一、原理概述 8.荧光定量PCR的数学原理
模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线， 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
段，并且保证回归系数大于0.99。
(3).CT值： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩 增循环
次数。
C(t) value
第4页/共42页
一、原理概述
3.荧光定量PCR所用的荧光报告 基团
(1).非特异性荧光标记： SYBR Green
(2).特异性荧光标记： TaqMan探针
一、原理概述
1.Real-Time PCR 概论
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由 于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特 异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。
实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时 监测整
第5页/共42页
一、原理概述
4.非特异性荧光染料---SYBR Green的特性
(1).SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟 部位
(2).SYBR Green 只有和双链DNA结合受激 后才发 荧光
SYBR Green
(3).变性时，DNA双链分开，无荧光
log(1+Ex)
Log（x0的初始模板量）与到达阈值时的循环数（Ct值） 呈 线 性 关 系 ， 根 据 样 品 扩第1增3页达/共4到2页域 值 的 循 环 数 即 C t 值 就 可
一、原理概述 8.荧光定量PCR的数学原理
模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线， 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
段，并且保证回归系数大于0.99。
(3).CT值： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩 增循环
次数。
C(t) value
第4页/共42页
一、原理概述
3.荧光定量PCR所用的荧光报告 基团
(1).非特异性荧光标记： SYBR Green
(2).特异性荧光标记： TaqMan探针
一、原理概述
1.Real-Time PCR 概论
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由 于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特 异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。
实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时 监测整
第5页/共42页
一、原理概述
4.非特异性荧光染料---SYBR Green的特性
(1).SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟 部位
(2).SYBR Green 只有和双链DNA结合受激 后才发 荧光
SYBR Green
(3).变性时，DNA双链分开，无荧光
实时荧光定量PCR技术原理ppt课件
样本处理与RNA提取
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
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荧光超过本底时的临界数值。 荧光域值的默认设置是3～15个循 环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光 背景值和阴性对照的荧光最高值，同 时要保证在指数增长期。
Ct值
Ct值的定义：
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过 的扩增循环次数
C(t) value
Real-time PCR
PCR发展历程
❖ 第一代PCR——终点PCR ❖ 第二代PCR——实时PCR（Real-time PCR） ❖ 第三代PCR——数字PCR（Digital PCR）
实时荧光PCR的基本原理
❖ 通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实 时检测从而实现对起始模板定量（标准曲线）及定性 的分析。
SYBR Green Ⅰ
man探针
Taqman MGB探针
HPV Real-time PCR产品主要厂家
市场主要荧光PCR HPV检测产品
凯普 12+2 High-risk HPV
适用的主要荧光PCR仪：LineGene 9660、ABI 7500、RotorGene 6000、Mx3005P、LightCycler 480、ABI ViiA 7
❖
一周内提取 4℃
❖
一周后提取 -20℃
❖ ② 提取后的HPV DNA
❖
检测前 一周内检测 4℃
❖
一周后检测 -20℃
❖
检测后 -20℃
标本的制备——核酸纯化
❖ 原理：
❖ 煮沸法：表面活性剂（如Triton X-100、SDS等） ＋煮沸
❖ 1、优点
❖
简单、快捷、方便
❖ 2、缺点
❖
HPV DNA纯度较差，含有血红素、蛋白、
2、设置阈值线： 基线和阴性对照的上方，同时保证在指数增长期。
结果分析
❖ 1、整体扩增曲线的观察 ❖ 2、阴性对照分析 ❖ 3、阳性对照分析
报告解释
❖ 结果可能出现： ❖ 1、假阳性：交叉污染、扩增子污染 ❖ 2、假阴性：低于检测下限、抑制物未去除、检测
体系有缺陷
写在最后
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
PCR动力学曲线和四个阶段
三个重要的概念
❖基线（Baseline) ❖阈值(Threshold) ❖Ct
基线（Baseline)
❖ 是背景曲线的一段，从反应开始不久荧光值开始变得 稳定，直到所有反应管的荧光都将要，但是还未超出 背景。
阈值(Threshold)
阈值 （threshold ）：
PCR中常见问题分析
❖ 标本的采集与储存 ❖ 标本的制备——核酸纯化 ❖ 试剂准备、加样 ❖ 扩增、检测 ❖ 结果分析 ❖ 报告解释
标本的采集与储存
❖ 1、标本的采集 ❖ 严格按照要求采样，尽可能减少粘液和血液，采
集到尽可能多的宫颈脱落细胞
标本的采集与储存
❖ 2、储存条件
❖ ①提取前的原始标本
PCR扩增的数学模型
荧光定量PCR技术的主要优点
各种荧光PCR仪器
Real-time PCR过程检测模式
❖ SYBR Green Ⅰ ❖ 水解探针
❖ ① Taqman探针（最常见） ❖ ② Taqman MGB探针（凯普）
❖ 杂交探针
❖ ①分子信标（Molecular Beacon） ❖ ②双杂交探针（FRET探针） ❖
脂类等PCR抑制剂。
试剂准备、加样
❖ 1、试剂配制的均一性、分装的均一性 ❖ 2、常用试剂的分装和储存 ❖ -20℃，避免反复冻融 ❖ 3、加样的准确性和重复性
扩增、检测
❖ 影响因素：引物、探针、仪器设备状态 ❖ 阳性对照——监控系统故障 ❖ 阴性对照——监控污染
结果分析
❖ ABI 仪器 ❖ 1、设置基线：
You Know, The More Powerful You Will Be
Thank You
在别人的演说中思考，在自己的故事里成长
Thinking In Other People‘S Speeches，Growing Up In Your Own Story
讲师：XXXXXX XX年XX月XX日