滤膜法测定总大肠菌群
过滤膜法测粪大肠菌群数-国标方法
滤膜法-粪大肠菌群的测定1、适用范围本标准适用于地表水、地下水、及水中粪大肠菌群的测定。
用于检验加氯消毒的水样时，在滤膜法之前，先做试验，证实它所得的数据资料与多管发酵试验所得的数据资料具有可比性。
2、原理滤膜是一种微孔性薄膜。
将水样注入已灭菌的放有滤膜（孔径0.45微米）的滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于M-FC培养基上，44.5℃温度下进行培养，计数滤膜上生长的此特性的菌落数，计算出每1L水样中含有粪大肠菌群数。
3仪器：滤膜（孔径0.45微米）、滤器、接液瓶、垫圈、无菌镊子夹3、培养基和试剂本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂，实验室用水为新制备的去离子水。
M-FC培养基：胰胨10g蛋白胨5g酵母浸膏 3.0g氯化钠 5.0g乳糖12.5g胆盐三号 1.5g1%苯胺蓝水溶10ml1%玫瑰色酸溶液（溶于0.2mol/L氢氧化钠液中）10ml蒸馏水1000ml制法：将上述培养基中的成分（除苯胺蓝和玫瑰色酸外），置于蒸馏水中加热溶解，调节PH为7.4，分装于小烧瓶内，每瓶100ml，于115℃灭菌20min。
储存于冰箱中备用，临用前，按上述配比，用灭菌吸管分别加入已煮沸灭菌的1%苯胺蓝溶液1ml及新配制的1%玫瑰色酸溶液（溶于氢氧化钠溶液）1ml，混合均匀。
加热溶解前，加入1.2%～1.5%琼脂制成固体培养基。
如培养物中杂菌不多，则培养基中不加玫瑰色酸亦可。
4、步骤水样的选择：水样量的选择根据细菌受检验的特征和水样中预测的细菌密度而定。
理想的水样体积是一片滤膜上生长20～60个粪大肠群菌落，总菌落数不超过200个。
滤膜及滤膜灭菌：将滤膜放入高压蒸汽灭菌锅里在121℃灭菌10min，滤器、接液瓶、垫圈分别用纸包好，在使用前经121℃灭菌20min，滤器也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌。
过滤：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，稳妥的固定好滤器。
滤膜法检验步骤
1 准备工作1.1 滤膜灭菌:将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15min。
前两次煮沸后需更换水洗涤2~3次，以除去残留溶剂。
1.2 滤器灭菌: 用点燃的酒精棉球，火焰灭菌。
也可用121℃高压灭菌20min。
2 过滤水样用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，帖放在已灭菌的滤床上、，固定好滤器，将100mL水浴(如水样含菌数较多，可减少过滤水样量，或将水样稀释)注入滤器中，打开滤器阀门，在负0.5大气压下抽滤。
3 培养水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入37℃恒温箱内培养24h±2h。
4 观察结果4.1 挑出符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检。
紫红色，具有金属光泽的菌落。
深红色，不带或略带金属光泽的菌落。
淡红色，中心色较深的菌落。
4.1.1凡革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养基液，于37℃培养24h，有产酸产气者，则判定为总大肠菌群阳性。
4.1.2 计算滤膜上生长的总大肠菌群数，以每100mL 水样中的总大肠菌群数报告之(CFU/100mL)数出的总大肠菌群菌落数*100总大肠菌群菌落数(CFU/100mL)＝─────────────────────── (1)过滤的水样体积(ml)1 准备工作1.1 滤膜灭菌:将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15min。
前两次煮沸后需更换水洗涤2~3次，以除去残留溶剂。
1.2 滤器灭菌: 用点燃的酒精棉球，火焰灭菌。
也可用121℃高压灭菌20min。
2 过滤水样用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，帖放在已灭菌的滤床上、，固定好滤器，将100mL水浴(如水样含菌数较多，可减少过滤水样量，或将水样稀释)注入滤器中，打开滤器阀门，在负0.5大气压下抽滤。
滤膜法与酶底物法检测污水中粪大肠菌群的比较分析
滤膜法与酶底物法检测污水中粪大肠菌群的比较分析滤膜法与酶底物法检测污水中粪大肠菌群的比较分析摘要粪大肠菌群是污水中常见的指标菌，其检测与评价对于污水处理过程的监测和卫生保障非常重要。
本研究采用滤膜法和酶底物法两种方法对污水中的粪大肠菌群进行了比较分析。
结果表明，滤膜法具有操作简单、准确性高的优点，适用于对粪大肠菌群进行定量检测；而酶底物法快速、便捷，适用于快速筛查和初步评价。
两种方法在不同场景和实际应用中具有各自的优缺点，应根据具体需求选取合适的检测方法。
1. 引言粪大肠菌群是一类常见的从属于大肠杆菌科的细菌，广泛存在于土壤和水体中，为评估环境水质状况提供了一种重要的指标。
粪大肠菌群来源于人体和动物的消化系统，其存在与污水中表明该水源可能受到了粪便污染。
因此，对于污水处理厂和水源地的管理和监测，粪大肠菌群的检测是必不可少的。
2. 滤膜法检测粪大肠菌群滤膜法是一种常用的粪大肠菌群定量检测方法。
其基本原理是通过滤膜将样品中的粪大肠菌群分离并聚集，然后用染色剂进行着色，并在显微镜下进行计数。
滤膜法的优点是操作简单、准确性高，可以快速定量检测粪大肠菌群的数量。
其缺点是耗时较长，需要使用显微镜进行观察和计数，有一定的操作难度。
3. 酶底物法检测粪大肠菌群酶底物法是一种基于粪大肠菌群特定酶的检测方法，通过检测粪大肠菌群特异酶的活性来间接反映其存在量。
常用的酶底物法是利用3-苯基-六胺葡萄糖（X-GAL）和X-α-半乳糖苷酶（β-galactosidase）进行检测。
该方法操作简单、迅速，只需在特定培养基中添加相应底物，通过观察底物转化后的色素变化来判断是否存在粪大肠菌群。
酶底物法的优点是快速、便捷，适用于大规模样品的筛查和初步评价。
然而，酶底物法只能定性判断粪大肠菌群的存在与否，无法精确定量。
4. 比较分析滤膜法和酶底物法是常用的粪大肠菌群检测方法，两种方法在检测原理、操作步骤、检测结果及适用范围等方面存在一定差异。
滤膜法与酶底物法检测污水中粪大肠菌群的比较分析
滤膜法与酶底物法检测污水中粪大肠菌群的比较分析滤膜法与酶底物法检测污水中粪大肠菌群的比较分析一、引言随着城市化进程的加速和人口的不断增长，污水处理成为一项重要的环保任务。
污水中的粪大肠菌群是评估水质和卫生水平的重要指标之一。
为了准确快速地检测污水中的粪大肠菌群，科学家们发展了各种检测方法。
其中，滤膜法和酶底物法是常用的两种方法，本文将对这两种方法进行比较分析。
二、滤膜法滤膜法是通过将粪大肠菌群附着在滤膜上，再通过计数形状与颜色进行检测。
其操作包括取样、滤膜萃取、滤膜染色和计数四个步骤。
滤膜法具有简单、直观、操作便捷等优势，被广泛应用于实际工作中。
然而，滤膜法的检测结果容易受到环境因素的干扰，例如水质的浑浊度、背景物质的影响等，这可能导致结果的不准确。
三、酶底物法酶底物法是通过检测粪大肠菌群特有的酶活性来间接测定其存在。
常用的指示剂是3-indoxyl-β-D-glucuronide（X-Gluc），它能与酶β-D-葡萄糖苷酸酶反应产生可见的蓝色产物。
这种方法的优势在于结果的准确性较高，而且不受环境因素的影响。
但是，酶底物法需要较长的检测时间，操作较为复杂，并且对仪器设备要求较高。
四、比较分析（1）准确性方面：滤膜法和酶底物法在检测粪大肠菌群方面均有较高的准确性，但是酶底物法的结果更为精确。
滤膜法容易受到环境因素的影响，导致结果的偏差。
（2）操作方面：滤膜法操作简便，流程清晰，不需要特殊的仪器设备，适用于现场快速检测。
酶底物法的操作较为复杂，需要仪器设备支持，所需时间较长。
（3）受环境因素影响方面：滤膜法受环境因素影响较大，如水质浑浊度、背景物质等因素会干扰检测结果。
酶底物法不受环境因素的影响，结果更为稳定。
（4）适用范围方面：滤膜法适用于对大量样品进行快速筛查，特别是现场检测。
酶底物法适用于对粪大肠菌群的高灵敏度检测，尤其适合于研究或实验室内的检测。
五、结论综上所述，滤膜法和酶底物法是常用于检测污水中粪大肠菌群的两种方法。
总大肠菌群说明
滤膜上，然后将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，直接计数滤膜上生长的典型大肠菌群
菌落，算出每升水样中含有的总大肠菌群数。
3 仪器
3.1 滤器
3.2 滤膜，孔径 0.45~0.65μm。直径根据滤器规格，目前常用的有 3.5cm 和 4.7cm 两种。
3.3 抽滤设备。
3.4 无齿镊子。
3.5 高压蒸汽灭菌器。
4.2 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液
按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。
4.3 品红亚硫酸钠培养基（供多管发酵法用）
4.3.1 成分
蛋白胨
10g
乳糖
10g
磷酸氢二钾
3.5g
0ml
无水亚硫酸钠
5g 左右
5%碱性品红乙醇溶液
20ml
4.3.2 储备培养基的制备
先将琼脂加至 900 蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，
每 100ml 水样中总大肠 菌群近似数
5 7 9 12 14 16 7 9 12 14 17 19 9 12 14 17 19 22 12 14 17 20 22 25 15 17 20 23 25 28 21 24 28 32 36 40 25 29 32 37 41 45
接种量，ml 10 1 0.1 2 50 2 51 2 52 2 53 2 54 2 55 3 00 3 01 3 02 3 03 3 04 3 05 3 10 3 11 3 12 3 13 3 14 3 15 3 20 3 21 3 22 3 23 3 24 3 25 3 30 3 31 3 32 3 33 3 34 3 35 4 30 4 31 4 32 4 33 4 34 4 35 4 40 4 41 4 42 4 43 4 44 4 45
滤膜法在测定水中大肠菌群中的应用
滤膜法在测定水中大肠菌群中的应用社会快速发展，各个行业也随之发展，加大了对水污染程度，特别是对生活饮用水的安全性及可靠性越来越重视，为了保证生活饮用水更加安全可靠，人们寻找更快速、更灵敏的饮用水监测方法。
而大肠菌群作为评价饮用水卫生质量重要评价指标，可将水污染程度予以反映，对人们饮用水安全做以支撑，滤膜法作为检测水中大肠菌群方法之一，其具有操作便捷、结果可靠等特点，被人们所普遍应用。
那么什么是滤膜法？测定水中大肠菌群有什么意义？滤膜法测定水中大肠菌群的原理是什么？滤膜法测定水中大肠菌群的过程及注意事项有哪些？滤膜法检测水中大肠菌群有哪些优势？下面将详细介绍。
1.什么是滤膜法？滤膜法作为检测水样中大肠菌群的常用方法，具体而言，将一定水量注入已经灭菌的微孔薄膜滤器中，通过对其进行抽滤，细菌被保留在滤膜之上，再将滤膜放置于贴满品红亚硫酸的培养基上，经过一定时间培养，对滤膜上的大肠菌群菌落数量予以计算及鉴定，以每升或每100毫克水样作为基础，计算其大肠菌群数量，此方法具有操作简单、速度快、结果可靠等特点，通常适用于杂质较少的水样。
1.测定水中大肠菌群的意义是什么？通过检查水中是否存在病原菌，从而可判断水质的安全性及可靠性，但是因为病原菌种具有种类繁多、培养困难等特点，使直接从水中进行对病原菌检测难以实现，因人类肠道病原菌主要来源为粪便污染水，与水体中病原菌相比较，其粪便中病原菌数量较少，所以通过检测水中是否存在肠道正常细菌种类，从而判定水质质量安全性及可靠性。
若检测水中存在大肠菌群，表明水样受到粪便污染，存在病原菌被污染的可能。
1.滤膜法测定水中大肠菌群原理？滤膜法检测水中大肠菌群原理，采取过滤器将水样予以过滤，使其中细菌存留在过滤膜上，然后将滤膜存放在特定培养基上予以培养，大肠菌群通过在滤膜上不断生长，从而直接对其数量予以计算，所用滤膜通常使用乙酸纤维膜。
1.滤膜法测定水中大肠菌群的过程及注意事项？滤膜法测定水中大肠菌群的过程重要为四个方面：4.1准备工作将滤膜放入烧杯中，在烧杯中注入一定量蒸馏水，将其放置于沸水中煮沸灭菌三次，每次保持在15分钟左右。
★水中大肠杆菌群检测方法-滤膜法
附件水中大腸桿菌群檢測方法－濾膜法NIEA E202.53B一、方法概要本方法係用濾膜檢測水中好氧或兼性厭氧、革蘭氏染色陰性、不產芽孢之大腸桿菌群（Coliform group）細菌。
該群細菌在含有乳糖的Endo培養基上，於35 ± 1℃ 培養24 ± 2小時會產生紅色色系具金屬光澤菌落。
所有缺乏金屬光澤的菌落，均判定為非大腸桿菌群。
二、適用範圍本方法適用於地面水體、地下水體、廢水、污水及海域水質及水源水質水樣中大腸桿菌群之檢測。
三、干擾(一) 水樣中含有抑制或促進大腸桿菌群細菌生長之物質。
(二) 檢測使用的玻璃器皿及設備含有抑制或促進大腸桿菌群細菌生長的物質。
(三) 濁度過高之水樣易造成濾膜孔隙阻塞，或造成細菌菌落瀰漫生長（spreading）而影響水樣檢驗的觀察及結果的判讀。
四、設備(一) 量筒：100至1000 mL之量筒。
(二) 吸管：有0.1 mL刻度之10 mL之無菌玻璃吸管或無菌塑膠製吸管，或無菌微量吸管（micropipet）。
(三) 稀釋瓶：100至1000 mL可滅菌、具螺旋蓋之硼矽玻璃製品。
(四) 錐形瓶：200至1000 mL可滅菌之硼矽玻璃製品。
(五) 採樣容器：容量100 mL以上無菌之硼矽玻璃或塑膠製有蓋容器，使用市售無菌袋亦可。
(六) 培養皿：硼矽玻璃製或可拋棄式塑膠製培養皿，大小為60 × 15 mm、50 × 12 mm 或其他適當大小。
(七) 過濾裝置：能耐高溫高壓滅菌的玻璃、塑膠、陶瓷或不鏽鋼等材質構成之無縫隙漏斗，以鎖定裝置、磁力或重力固定於底部。
(八) 抽氣幫浦：水壓式或吸氣式，壓力差最好在138至207 kPa者。
(九) 濾膜：使用材質為混合纖維素酯（mixed cellulose esters），直徑47 mm、孔徑0.45 μm且有格子記號的無菌濾膜。
(十) 鑷子：前端平滑、內側無波紋，使用前浸泡於95% 酒精再以火燄燃燒滅菌。
地下水总大肠菌群的测定方法
地下水总大肠菌群的测定方法
地下水中总大肠菌群的测定是非常重要的，因为它可以反映出
水质的卫生状况。
以下是一些常用的测定方法：
1. 膜过滤法，这是一种常用的测定方法，通过将地下水样品通
过0.45微米的膜过滤器，然后将膜放置在含有大肠菌群特异培养基
的琼脂平板上进行培养。
培养后，通过计数形成的菌落来确定水样
中大肠菌群的数量。
2. 荧光素基因定量PCR法，这是一种分子生物学方法，通过提
取地下水中的DNA，使用荧光素基因特异引物进行PCR扩增，然后
使用荧光素探针进行定量检测。
这种方法可以快速准确地测定大肠
菌群的数量。
3. 色素培养基法，使用含有某种特定底物的琼脂平板进行培养，通过大肠菌群对底物的特异反应产生的颜色变化来测定其数量。
4. 流式细胞术，这是一种高通量的测定方法，通过将水样中的
微生物染色标记，然后通过流式细胞仪进行快速准确地测定大肠菌
群的数量。
总的来说，测定地下水中总大肠菌群的方法有多种，可以从不同的角度对水质进行评估。
在实际应用中，可以根据实际情况选择合适的方法进行测定。
食品中大肠菌群的检测及分离纯化
实验8: 食品（饮用水）中大肠菌群的检测（滤膜法）及分离纯化（6学时）一、目的要求1.利用滤膜法测定食品中大肠菌群。
2.掌握分离微生物的基本操作。
二、基本原理1.滤膜法是采用过滤器过滤水样，使其中的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜放在适当的培养基上进行培养，大肠菌群可直接在膜上生长，从而可直接计数。
所用滤膜是一种多孔硝化纤维膜或乙酸纤维膜，用水系过滤膜即可，其孔径约0.45μm。
2.在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。
得到纯培养的过程称为分离纯化。
三、试验原料及器材实验原料：伊红美蓝琼脂平板或远藤氏琼脂平板，乳糖蛋，蛋白胨，灭菌水，饮用水等；器材：镊子；夹钳；烧杯；真空泵；滤膜；过滤器等。
四、操作步骤1.大肠菌群的检测（1）滤膜灭菌将滤膜放入装有蒸馏水的烧杯中，加热煮沸15分钟，共煮沸三次，前两次煮沸后换水洗涤2—3次再煮，以洗去滤膜上残留的溶剂。
（2）过滤器装置用无菌手续将已灭菌的过滤器基座、滤膜、漏斗和抽滤瓶安装好，其中滤膜用灭菌镊子(浸在95%酒精内，用时通过火焰灭菌)移至过滤器的基座上。
其他可直接用手或夹钳操作，但不要碰到伸入抽滤瓶的橡皮塞部分，以免染菌。
（3）将抽滤瓶接上真空泵。
（4）加水样过滤直径50mm的滤膜，所过滤的水量以培养后长出的菌落数一般需要较多过滤器装置，多于50个为适宜，所以采用多联过滤器最好，可以减少误差。
一般清洁的深井水或经处理过的河水与湖水等可取样 300—500 ml；对比较清洁的河水或湖水，可取样1-100ml；严重污染的水样可先进行稀释；未知的水样可做三个稀释度，选择菌落数合适的稀释度进行计算。
本次实验于过滤器漏斗内加入比较河水或湖水100ml，加盖。
（5）开动真空泵进行油滤。
（6）抽完后，加入等量的灭菌水继续抽滤，目的是冲洗漏斗壁。
（7）滤毕，关上真空泵，用灭菌镊子取滤膜边缘，将没有细菌的一面紧贴在伊红美蓝琼脂平板上。
滤膜与培养基之间不得有气泡。
生活饮用水中总大肠菌群三种不同检测方法比较
生活饮用水中总大肠菌群三种不同检测方法比较在生活饮用水中，大肠菌群是一种重要的指标，用来评价水源的卫生状况。
常见的三种大肠菌群检测方法包括MPN法（Most Probable Number）、膜过滤法和PCR法（聚合酶链式反应法）。
本文将对这三种方法进行比较，分析其特点和适用场景。
首先，MPN法是一种常用的大肠菌群检测方法。
该方法通过对一系列稀释液进行培养，根据培养液中菌落的种类和数量来评估大肠菌群的含量。
这种方法的优点是操作简单、成本较低，可适用于大批量的水样检测。
但是，MPN法的缺点是需要较长时间的培养过程，通常需要3-5天的时间才能得到结果。
此外，该方法对生活饮用水中的非培养大肠菌群无法进行检测。
其次，膜过滤法是一种较为常用的大肠菌群检测方法。
该方法通过将水样通过特殊大小的膜过滤器，使大肠菌群滞留在膜上，然后将膜转移到培养基上进行培养。
该方法的优点是操作相对简单，需要的时间较短，通常在24小时内可以得到结果。
此外，该方法可以对生活饮用水中的非培养大肠菌群进行检测。
但是，膜过滤法的缺点是需要较多的培养器材和耗材，成本较高。
最后，PCR法是一种较为先进的大肠菌群检测方法。
该方法通过扩增水样中大肠菌群的DNA片段，然后利用荧光技术进行检测。
PCR法的优点是快速、灵敏，可以在短时间内得到准确的结果。
此外，该方法可以对生活饮用水中的非培养大肠菌群进行检测，并可以进行定量分析。
但是，PCR法的缺点是需要较复杂的实验设置和专业的设备，操作要求较高，成本较高。
综上所述，生活饮用水中总大肠菌群的检测方法包括MPN法、膜过滤法和PCR法。
这三种方法各有特点，在不同的场景中适用。
MPN法适用于大批量的水样检测，操作简单、成本较低，但需要较长时间。
膜过滤法适用于一般的大肠菌群检测，操作相对简单、时间较短，但成本较高。
PCR 法适用于准确和快速的大肠菌群检测，可以进行定量分析，但需要较复杂的实验设置和专业设备。
在实际应用中，可以根据需求和实际条件选择合适的检测方法来评估生活饮用水的卫生状况。
滤膜法检验水中总大肠菌群方法有关问题
浅议滤膜法检验水中总大肠菌群方法有关问题[摘要]水质细菌学检测是水质分析中的重要指标，其对于保障居民饮用水安全具有关键指导意义。
本文作者基于多年水质检验的实践工作经验，从理论依据、操作步骤及注意事项等方面对滤膜法检验水中总大肠菌群方法有关问题进行探讨，以期在实践工作中具有借鉴作用。
[关键词]滤膜法水质检验总大肠菌群中图分类号：r123.1 文献标识码：a 文章编号：1009-914x（2013）13-0210-01前言总大肠菌群作为环境水质日常检测的指标之一，对于反映水污染程度、保障居民饮用水安全具有重要指导意义。
滤膜法作为水中总大肠菌群传统的检测方法，因操作简单、检测快速、结果可靠而得到广泛应用。
随着生物科学技术的不断发展，一些诸如pcr分子生物学方法、试剂盒法、免疫学方法、酶活性检测法等新兴检测方法也逐渐发展起来，虽然新的检测体系在特异性、敏感性、准确性上均有不用程度的提高，但因其技术复杂性、操作专业性、成本昂贵等条件制约了它们广泛应用。
作为检验水中总大肠菌群经典的检测方法，滤膜法也在技术上不断改进，本文就滤膜法在实践应用中的相关问题进行探讨。
1.总大肠菌群检测的意义1.1 总大肠菌群大肠菌群指一群需氧、兼性厌氧的革兰氏阴性无芽抱杆菌，其特征为在37±1℃条件下，反应24h能分解乳糖，产酸、产气，包括大肠杆菌、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯菌属等，其中大肠杆菌为主要菌种，其余各菌为次要菌种，也称为非典型大肠杆菌。
总大肠菌群主要来源于人畜粪便，作为环境水质被粪便污染的标志，因其检测应用面广，使用频率高而成为一项卫生细菌学检验的必检项目。
1.2 总大肠菌群检测的意义检查水中有无病原菌是判断水质安全性的最直接、有效的标准，然而，由于病原菌种类众多及水体环境相对复杂，要针对某一种细菌进行分离、培养是比较困难的，所以目前直接从水中进行病原菌的检测是无法普及实现的。
由于人类肠道传染病病原菌主要来自于粪便污水，相对水体中病原菌种类繁多，粪便中病原菌数量较少。
总大肠菌群数量测定
总大肠菌群在饮用水的微生物安全监测中，普遍采用正常的肠道细菌作为粪便污染指标，而不是直接测定肠道致病菌。
总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革氏阴性无芽胞杆菌。
总大肠菌群系指每升水样中所含有的总大肠菌群的数目。
总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。
一多管发酵法1应用范围1.1本法适用于饮用水、水源水，特别是浑浊度含量高的水质中总大肠菌群的测定。
1.2水样中总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在。
2原理根据总大肠菌群应具有的生物特性，产气，能在选择性培养基上产生典型菌落。
3仪器3.1xx3.2革兰氏染色用有关器材。
3.3高压蒸汽灭菌器。
3.4干热灭菌箱。
3.5恒温箱。
3.6冰箱。
3.7放大镜。
3.8试管、平皿（直径4培养基4.1乳糖蛋白胨培养液4.1."1成分蛋白胨10g牛肉膏3g乳糖5g氯化钠5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液蒸馏水1000ml4.1."2制法将蛋白胨、牛肉膏、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
4.2三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。
4.3品红亚硫酸钠培养基（供多管发酵法用）4.3."1成分蛋白胨10g乳糖10g磷酸氢二钾3."5gxx15~30g蒸馏水1000ml无水亚硫酸钠5g左右5%碱性品红乙醇溶液4.3."2储备培养基的制备如革兰氏阴性无芽胞杆菌，9cm）、刻度吸管等，置于干热灭菌箱中1ml1000ml蒸馏水中加热溶解，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，在37℃24h内能发酵乳糖并产酸160℃灭菌2h调整pH为7."2~7."4，再加入1ml置高压蒸汽灭菌器中，以115℃乳糖及氯化钠置于20ml先将琼脂加至900蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整PH值为7."2~7."4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌中以115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
饮用水中的总大肠菌群检测-精品文档资料
饮用水中的总大肠菌群检测引言饮水水质的好坏直接关系到人民的身体健康，也是反映一个国家文明程度的重要指标之一[2]。
《生活饮用水卫生标准》（TJ20-76）和《生活饮用水卫生标准》（GB5749-85）中规定细菌总数不超过100个/mL，总大肠菌群不超过3个/L；而2001年《生活饮用水水质卫生规范》要求更加严格，规定饮用水中总大肠菌群每100mL水样不得检出。
国内检测总大肠菌群的方法主要是多管发酵法和滤膜法。
多管发酵法可适用于各种水样，但操作繁琐，所需时间较长，而滤膜法主要适用于杂质较少的水样，操作简单快捷。
本论文即采用滤膜法检验自来水中总大肠菌群数，用滤膜过滤器过滤水样，将水中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜放在品红亚硫酸钠培养基上进行培养，计数大肠菌群菌落数，算出每100mL水样中含有的大肠菌群数。
从而判定自来水中的大肠菌群数是否符合国家标准。
1.材料与方法1.1该实验于2013年7月2日、3日在大连经济技术开发区自来水公司水质管理中心微生物室完成。
1.2材料1.2.1实验材料自来水（湾里高区水、湾里低区水）及其原水1.2.2实验试剂品红亚硫酸钠培养基1.2.3实验仪器培养箱：36℃±1℃、冰箱0℃-4℃、天平、药匙、平皿：直径90mm、刻度吸管、锥形瓶、量筒、玻璃棒、酒精灯、滤器、孔径0.45μm滤膜、抽滤设备、无齿镊子。
1.3检验步骤（1）将酒精棉球点燃，用其火焰灭菌抽滤器，用已在酒精灯上灼烧过并降至室温的镊子夹取已灭菌滤膜的边缘部分，放在已用点燃的酒精棉火焰灭菌过，并已降至室温的滤床上，将滤器固定好，并向滤器中注入100mL水样，打开抽滤阀门，在-5.07×104Pa（负0.5大气压）下抽滤水样。
（2）水样滤完后，再继续抽气约5秒钟，关上滤器阀门，将滤器取下来，用在酒精灯上灼烧过且温度已降至室温的镊子夹取滤膜边缘部分，移放到品红亚硫酸钠培养基上，使滤膜截留细菌面朝上，滤膜与培养基完全贴紧，中间没有气泡，然后倒置平皿，放入37℃恒温箱内培养24h±2h。
滤膜法检验水中总大肠菌群方法中一些问题的探讨
滤膜法检验水中总大肠菌群方法中一些问题的探讨作者：王淑梅来源：《硅谷》2011年第16期摘要：建立滤膜法在检测总大肠菌群的关键步骤。
要使大肠杆菌的检验结果比较能正确反映被检水中的大肠杆菌群得数量，应选取适量水量，并应作两份平行检验关键词：滤膜法；总大肠菌群；菌落数中图分类号：R117 文献标识码：A 文章编号：1671－7597（2011）0820172－01我国制定的生活饮用水细菌总数和总大肠菌群的检验方法中，把总大肠菌群定义为：系一群需氧及兼性厌氧，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24小时内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
滤膜法的检验步骤分为三步，第一步将水中所含细菌过滤截留在滤膜上，在37℃的恒温箱中进行24小时鉴别培养；第二步，挑选鉴别培养基上所生成的各种色泽的菌落进行涂片革兰氏染色，观察形态及染色反应；第三步再挑取革兰氏染色阴性无芽胞的杆菌菌落进行发酵试验观察对乳糖的发酵情况。
通过这三种步骤来确定滤膜上所生长的各种色泽菌落是否是总大肠菌群。
对于这一检验操作步骤能否简化，进行一步操作或二步操作就可确定和计算水中总大肠菌群数。
即单作第一步；或作第一步和第二步；或作第一步和第三步，不作第二步。
针对这一问题，我们进行了一些试验，现将结果整理如下。
试验中所用的培养基品红亚硫酸钠培养基。
发酵是用液体乳糖发酵培养基。
1 试验结果从表1看出：在品红亚硫酸钠鉴别培养基上所生长的各种不同色泽的菌落中，紫红色有金属光泽的菌落中，有94%是典型大肠杆菌形态及革兰氏染色反应阴性的菌种，只有6%是非典型大肠杆菌形态（即短小杆菌）及革兰氏染色反应阴性（色介于红与紫之间的）菌种。
在深红色的菌种中，典型大肠杆菌形态及革兰氏染色反应阴性的菌种所占百分比就比紫红色有金属光泽菌落的低，只有33.4%。
而非典型大肠杆菌形态及革兰氏染色反应阴性的菌种所占百分数增加，高达66.6%。
在淡红色的菌落中典型和非典型大肠杆菌形态及革兰氏染色反应阴性菌种所占百分比不但低于深红色菌落，而且还有球菌菌种。
水中总大肠菌群检测方法
水中总大肠菌群检测方法水中总大肠菌群检测方法【摘要】俗话说：人可以七天不吃饭，但绝不可以三天不喝水。
这虽然是个俗语，但其意在说明水的珍贵。
水是人类赖以生存和发展的重要自然资源，它与人们的生活息息相关。
然而，在人们的日常用水中，饮用水的卫生质量是否达标，以及如何消除人们生活用水中存在的安全隐患等一系列问题已经成为我国社会民众广泛关注的话题。
【关键词】总大肠菌群；检测；检测方法随着社会经济的高速发展以及工业化、城市化进程的推进，水资源污染问题越来越严重，与此同时，人们对于生活饮用水的水质要求也越来越高。
目前，我国的饮用水中存在大量的微生物，其中，部分微生物对人们的身体健康有一定的威胁，因此，饮用水必须严格地进行消毒杀菌处理，并应经过严格的微生物检测，检测达标后方可输配给终端用户。
目前常采用的微生物检测方法主要有多管发酵法、滤膜法等。
笔者结合实际工作经验分析了相关的检验方法及步骤。
一、总大肠菌群饮用水中的总大肠菌群主要是指大肠杆菌、大肠菌群和粪大肠菌群三大类型细菌共同组成的大肠菌群。
总大肠菌群是指在37℃条件下培养时，能够使乳糖进行发酵，并且在全天24小时之内都产酸、产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
主要包括埃希氏菌属、柠檬酸细菌属肠杆菌属及克雷伯氏菌属四种细菌。
由于其数量大，在体外存活时间与肠道致病菌相近，且检验方法比较简便，故被作为检验肠道致病菌的指示菌。
水中大肠菌群数的多少，表明水体被粪便污染的程度，并间接地表明有肠道致病菌存在的可能性。
因此，总大肠菌群是评价饮用水水质的重要指标，具有广泛的卫生学意义。
目前，检测总大肠菌群的方法主要有两种，分别是多管发酵法和滤膜法。
二、多管发酵法多管发酵法是做早被用作水质检测的技术，至今应用已超过80年，在水样大肠菌群的检测中一直在应用。
其核心是将水样进行10倍系列稀释，分别接种到乳糖蛋白胨培养液中，在35℃培养48小时，观察细菌生长情况。
将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美篮琼脂平板上进行分离培养，并通过革兰染色、镜检和进行证实试验。
滤膜法测定总大肠菌群
滤膜法测定总大肠菌群滤膜法测定总大肠菌群1 主题内容与适用范围本方法规定了生活饮用水中总大肠菌群的滤膜测定方法。
本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中总大肠菌群数的测定。
2 方法提要用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数。
3 培养基与试剂3.1 品红亚硫酸钠培养基3.1.1 成份A 蛋白胨10gB 酵母浸膏5gC 牛肉膏5gD 乳糖10gE 琼脂15~20gF 硫酸氢二钾3.5gG 无水亚硫酸钠5g左右H 碱性品红乙醇溶液(50g/L) 20mLI 蒸馏水1000mL3.1.2 储存培养基的制备先将琼脂加到500mL蒸馏水中，煮沸溶解，于另500mL蒸馏水中加入硫酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，补充蒸馏水至1000mL，混匀后调pH为7.2~7.4，再加入乳糖，分装，115℃高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。
3.1.3 平皿培养基的配制将上法制备的储存培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5％碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水硫酸钠置于另一灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭菌。
用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储存培养基内，并充分混匀(防止产生气泡)，立即将此种培养基15mL倾入已灭菌的空平皿中。
待冷却凝固后置冰箱内备用。
此种以制成的培养基于冰箱内保存不宜超过二周。
如培养基已由淡粉色变为深红色，则不能再用。
3.2 乳糖蛋白胨培养基3.2.1 成份A 蛋白胨10gB 牛肉膏3gC 乳糖5gD 氯化钠5gE 溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mLF 蒸馏水1000mL3.2.2 制法将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2~7.4，再加入1mL1.6％溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，115℃高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定 多管发酵法
水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定多管发酵法1. 原理总大肠菌群和粪大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。
多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。
试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN表示。
2. 仪器(1)高压蒸气灭菌器。
(2)恒温培养箱、冰箱。
(3)生物显微镜、载玻片。
(4)酒精灯、3mm接种环。
(5)培养皿（直径100mm）、试管（5×150mm），吸管（1、5、10mL）、烧杯（200、500、2000mL）、锥形瓶（500、1000mL）、采样瓶、移液枪。
3. 培养基及染色剂的制备3.1 乳糖蛋白胨培养液：将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节溶液pH为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，贮存于冷暗处备用。
3.2 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。
除蒸馏水外，各组份用量增加至三倍。
3.3伊红美蓝培养基：①贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解。
再加2.0g邻酸二氢钾及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至1000mL，调节溶液pH值为7.2～7.4。
趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀后定量分装于250mL或500mL锥形瓶内，于121℃高压灭菌15min，贮于冷暗处备用。
②平皿培养基的制备：将上述制备的贮备培养基融化。
根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液（0.4g伊红溶于20mL水中）和一定量已灭菌的0.5%美蓝水溶液（0.065g美蓝溶于13mL 水中），加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此培养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用。
9132总大肠杆菌(滤膜技术)
方法9 1 32总大肠杆菌（滤膜技术）1.0适用范围1.1本方法用于测定废水和地下水中存在的一系列大肠杆菌类细菌。
1.2按本方法分析的大肠杆菌类细菌，包括：所有能在24h培养期内产生具有金绿金属光泽的菌落的生物2.0方法摘要。
2.1将预定量的水样经滤膜过滤。
水样中的细菌被保留在滤腆上。
2.2分两步添加营养：先将保留有细菌的滤膜放在吸满月桂酰胰蛋白液态培养基的吸收垫上，于35℃±0.5℃培养2h。
然后将滤膜转移到吸满M—Endo液态培养基的平皿上。
于35℃±0.5℃继续培养2l±lh。
在显微镜底下对带有光泽的菌落计数，按每100ml 原水样报告计数结果。
2.3在《水和废水标准检验法》和《环境监测的微生物学方法》二书（见本章参考文献）中，对本方法有更详细的介绍。
3.0干扰3.1存在余氯或其它卤素可妨碍细菌活动的持续.为防止出现这种问题，应加入硫代硫酸钠。
3.2水样中含有高浓度铜、锌或其它重金属可使细菌中毒。
只有在怀疑水样中存在重金属时才应加入赘合剂，例如乙二胺四醋酸（EDTA）。
3.3存在藻类或其它干扰物质会使水样混浊，致使试验的水样体积不足以获得有效的结果。
存在大量的非大肠杆菌类细菌或有毒物质会使大肠杆菌估计值偏低。
3.4水样中含有大量悬浮固体会干扰茵落生长，还会干扰随后的滤膜上菌落的汁数。
遇有这种情况，应改用方法9131。
4.0仪器和设备4.1稀释瓶或试管。
4.1.1使用耐热玻璃。
最好是硼硅酸盐玻璃瓶或试管，其密封玻璃塞或螺帽应配带有在灭菌当中不会产生有毒或抑菌化合物的衬垫。
4.1.2不可用棉塞作塞子。
在稀释瓶或试管壁上面，画上擦不掉的刻度线。
可以用尺寸适当的无毒塑料瓶代替玻璃瓶，但要保证这种瓶在灭菌时不会发生问题。
4.2吸管和刻度量筒。
使用尺寸合适。
能够准确、快速移取所需液量的吸管。
同一批产品的校准误差不得大于2.5%。
使用符合国家标准的刻度量筒。
4.3培养基容器。
滤膜法测定固体废物中总大肠菌群的条件选择
滤膜法测定固体废物中总大肠菌群的条件选择付友生【摘要】本文对滤膜法测定固体废物中总大肠菌群的条件进行了研究.找出了最佳浸提时间和样品的保存时间,最佳浸提时间为20min,样品保存时间不能超过6小时同时研究了试验培养温度对结果的影响.对固体废物大肠菌群的测定滤膜法与平板法进行比对,验证了方法的准确性.【期刊名称】《农业与技术》【年(卷),期】2012(032)007【总页数】2页(P11-12)【关键词】滤膜法;总大肠菌群;固体废物【作者】付友生【作者单位】辽宁省环境监测实验中心,辽宁沈阳110031【正文语种】中文【中图分类】Q939.1固体废物主要包括城市生活固体废物、工业固体废物和农业废弃物。
为避免对环境造成污染和疾病的转播,固体废物大肠菌群的检验是十分重要的一项,目前普遍采用多管发酵法进行检验。
即取一定量的固体废物,加入无菌蒸馏水,均质混匀后待检[1]。
多管发酵法长期以来在我国使用较为广泛,但因操作烦琐,很难适应监督检测要求。
滤膜法具有高度的再现性,可用于检验体积较大的浸提液,能比多管发酵技术更快地获得肯定的结果,为此滤膜法越来越多地被使用[2]。
1 材料与方法1.1 试剂和材料(1)品红亚硫酸钠培养基。
(2)标准菌株:大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)1.2 仪器与设备主要的仪器设备有:高压灭菌器、恒温培养箱、滤器和抽滤设备、平皿、吸管等。
1.3 方法原理用无菌水侵提固体废物,静置后分层,取上层浸提液并作适当稀释后通过孔径为0.45p～m的滤膜过滤,细菌被阻留在膜上,将滤膜贴在品红亚硫酸钠培养基上,放入37℃恒温箱内培养24h,计数典型菌落。
1.4 样品分析1.4.1 材料的灭菌对操作中使用的所有材料及器具均需要灭菌,灭菌的方法采用干燥箱160-170℃干热灭菌2h,或用高压蒸汽灭菌器121℃经15分钟灭菌。
1.4.2 试验步骤实验过程需在无菌室内进行。
(1)滤膜灭菌:将滤膜放入沸水浴中煮沸灭菌3次,15min/次。
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滤膜法测定总大肠菌群
1 主题内容与适用范围
本方法规定了生活饮用水中总大肠菌群的滤膜测定方法。
本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中总大肠菌群数的测定。
2 方法提要
用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数。
3 培养基与试剂
3.1 品红亚硫酸钠培养基
3.1.1 成份
A 蛋白胨10g
B 酵母浸膏5g
C 牛肉膏5g
D 乳糖10g
E 琼脂15~20g
F 硫酸氢二钾3.5g
G 无水亚硫酸钠5g左右
H 碱性品红乙醇溶液(50g/L) 20mL
I 蒸馏水1000mL
3.1.2 储存培养基的制备
先将琼脂加到500mL蒸馏水中，煮沸溶解，于另500mL蒸馏水中加入硫酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，补充蒸馏水至1000mL，混匀后调pH为7.2~7.4，再加入乳糖，分装，115℃高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。
3.1.3 平皿培养基的配制
将上法制备的储存培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5％碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水硫酸钠置于另一灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭菌。
用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储存培养基内，并充分混匀(防止产生气泡)，立即将此种培养基15mL倾入已灭菌的空平皿中。
待冷却凝固后置冰箱内备
用。
此种以制成的培养基于冰箱内保存不宜超过二周。
如培养基已由淡粉色变为深红色，则不能再用。
3.2 乳糖蛋白胨培养基
3.2.1 成份
A 蛋白胨10g
B 牛肉膏3g
C 乳糖5g
D 氯化钠5g
E 溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL
F 蒸馏水1000mL
3.2.2 制法
将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2~7.4，再加入1mL1.6％溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，115℃高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
4 仪器
4.1 滤器。
4.2 滤膜，孔径0.45~0.65μm。
直经根据滤器规格，目前常用的有3.5cm和4.7cm两种。
4.3 抽滤设备。
4.4 无齿镊子。
4.5 培养箱: 36±1℃。
4.6 冰箱: 0~4℃。
4.7 天平。
4.8 显微镜。
4.9 平皿: 直径为9cm。
4.10 灭菌刻度吸管: 1mL,10mL。
5 检验步骤
5.1 准备工作
5.1.1 滤膜灭菌:
将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15min。
前两次煮沸后需更换水洗涤2~3次，以除去残留溶剂。
5.1.2 滤器灭菌: 用点燃的酒精棉球，火焰灭菌。
也可用121℃高压灭菌20min。
5.2 过滤水样
用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，帖放在已灭菌的滤床上、，固定好滤器，将100mL水浴(如水样含菌数较多，可减少过滤水样量，或将水样稀释)注入滤器中，打开滤器阀门，在负0.5大气压下抽滤。
5.3 培养
水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基(36.1.3.1)上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入37℃恒温箱内培养22~24h。
6 观察结果
6.1 挑出符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检。
紫红色，具有金属光泽的菌落。
深红色，不带或略带金属光泽的菌落。
淡红色，中心色较深的菌落。
6.1.1凡革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养基液，于37℃培养24h，有产酸产气者，则判定为总大肠菌群阳性。
6.1.2 计算滤膜上生长的总大肠菌群数，以每100mL 水样中的总大肠菌群数报告之(CFU/100mL)
总大肠菌群菌落数(CFU/100mL)＝───────────────────────………(36－1)。