大肠菌群测定ppt课件
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大肠菌群测定演示文稿
中国采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制定的行业标准。两个 标准方法在检测程序上略有不同。
国家标准
国家标准采用三步法，即乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。 乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发 酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。 分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，
菌量、其他方法不能检测的食品，如水、乳制品及其其他食品中大 肠菌群的计数。
当前8页，总共14页。
材料
• 3.1食品样品：乳、肉、果汁、糕点、发酵调味品及其他食品。 • 3.2 菌种 阳性对照菌
– 大肠杆菌 3.3除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
– 恒温培养箱、恒温水浴箱、 均质器、振荡器、无菌吸管或微量移液器及吸头、无 菌锥形瓶、无菌培养皿、菌落计数器等。
当前11页，总共14页。
当前12页，总共14页。
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第二法大肠菌群平板计数
8、 操作步骤 8.1、 样品的稀释 按6.1 进行。 8.2、 平板计数 、 选取2 个～3 个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1ml。同时分别取1ml生 理盐水加人两个无菌平皿作空白对照。 、 及时将15 mL-20ml冷至46℃ 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA ）约倾注于每个平皿中。小心旋 转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL-4mlVRBA 覆盖平板表层。翻转平板 ，置于36℃±l℃ 培养18h-24h 。
、 固体和半固体样品：称取25g 样品，放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8
00or/min-10 000r/min 均质1 min-2 min ，或放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中， 用拍击式均质器拍打1 min-2 min ，制成1:10 的样品匀液。 、 液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品，置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内 预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀液。
国家标准
国家标准采用三步法，即乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。 乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发 酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。 分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，
菌量、其他方法不能检测的食品，如水、乳制品及其其他食品中大 肠菌群的计数。
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材料
• 3.1食品样品：乳、肉、果汁、糕点、发酵调味品及其他食品。 • 3.2 菌种 阳性对照菌
– 大肠杆菌 3.3除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
– 恒温培养箱、恒温水浴箱、 均质器、振荡器、无菌吸管或微量移液器及吸头、无 菌锥形瓶、无菌培养皿、菌落计数器等。
当前11页，总共14页。
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当前13页，总共14页。
第二法大肠菌群平板计数
8、 操作步骤 8.1、 样品的稀释 按6.1 进行。 8.2、 平板计数 、 选取2 个～3 个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1ml。同时分别取1ml生 理盐水加人两个无菌平皿作空白对照。 、 及时将15 mL-20ml冷至46℃ 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA ）约倾注于每个平皿中。小心旋 转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL-4mlVRBA 覆盖平板表层。翻转平板 ，置于36℃±l℃ 培养18h-24h 。
、 固体和半固体样品：称取25g 样品，放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8
00or/min-10 000r/min 均质1 min-2 min ，或放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中， 用拍击式均质器拍打1 min-2 min ，制成1:10 的样品匀液。 、 液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品，置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内 预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀液。
大肠菌群检验方法课件
平板计数
证实实验
分离培养
证实试验
↓ 报告
两步法
MPN计数法
1.推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个 稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃ 培养48±2h，观察是否产气。 2.证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐 （BGLB）肉汤管中，36±1℃培养 48±2h，观察是否产气。以BGLB产 气为阳性。查MPN表，报告每ml(g) 样品中大肠菌群的MPN值。
大肠菌群检验方法
介绍
由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组 与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性 厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰 氏阴性无芽胞杆菌。 因此大肠菌群的检测一般都是按照它的 定义进行。有两步法、三步法
大肠菌群
两部法 三步法
↓
MPN计数法
↓
平板计数法
↓
↓
乳糖发酵试验
↓
↓
推测试验
证实实验
三步法
乳糖发酵试验、分离培养和证实试验
三步法：
1.乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个释 度接种三管乳糖蛋白胨发酵管。36±1℃ 培 养 48±2h，观察是否产气。 2.分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平 板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。
3.证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观 察，同时接种普通乳糖发酵管36±1℃， 24±2h，观察产气情况。
主题一
示例一，引出主题 解释细节 进行练习以巩固所学内容
主题二
示例二，引出主题 解释细节 进行练习以巩固所学内容
总结
回顾所学内容 总结学习方法 与学员的互动交流，获取反馈信息
其它信息
参考书籍、电子文档等 咨询服务联系方式 ……
《大肠菌群测定》PPT课件
GB4789.3-2010 大肠菌群测定
GB4789.3-2010 大肠菌群测 定
• 定义：大肠菌群：一群在36℃培养48h可发酵 乳糖、产酸产气的需氧和 兼性厌氧革兰氏染色阴性 无芽孢杆菌。该菌主要来 源自人畜粪便，作为粪便 污染指标评价食品的卫生 状况，推断 食品中肠道致 病菌污染的可能。
2
大肠菌群的食品卫生学意义
标准MPN表有64个组合，而现标准MPN表只有40个 组合。 3 报告单位不同。现报告单位为g/ml，而原报告单 位是100g/ml。
10
关于新国标大肠菌群MPN表的理解问题
新国标的MPN表的基准问题。
1、新国标的MPN表采用了3个稀释度，分别是十 倍－百倍－千倍，加样量是3管，每管1毫升，意 味着加入样品的量为0.333克。
大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语， 它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的 一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方 面并非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸
杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠杆菌是人和温血动物肠道 内普遍存在的细菌，是粪便中 的主要菌种产。气一克般雷生白活氏在菌人大 肠中并不致病，但它侵入人体 一些部位时，可引起感染 。
4
第一法 大肠菌群MPN计数法
• 初发酵：月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤（LST）替代 了乳糖胆盐发酵培基
• 确证实验：煌绿乳糖胆盐肉汤 （BGLB）替代了乳糖复发酵培 养基，取消了革兰氏染色实验
• 培养时间：由24h延长至48h • 单位：由MPN/100g变为
MPN/g
5
第一法 大肠菌群MPN计数法
12
关于新国标大肠菌群MPN表的理解问题
改变加样量的问题。 这样查表得到的数值，应该降低10倍。
GB4789.3-2010 大肠菌群测 定
• 定义：大肠菌群：一群在36℃培养48h可发酵 乳糖、产酸产气的需氧和 兼性厌氧革兰氏染色阴性 无芽孢杆菌。该菌主要来 源自人畜粪便，作为粪便 污染指标评价食品的卫生 状况，推断 食品中肠道致 病菌污染的可能。
2
大肠菌群的食品卫生学意义
标准MPN表有64个组合，而现标准MPN表只有40个 组合。 3 报告单位不同。现报告单位为g/ml，而原报告单 位是100g/ml。
10
关于新国标大肠菌群MPN表的理解问题
新国标的MPN表的基准问题。
1、新国标的MPN表采用了3个稀释度，分别是十 倍－百倍－千倍，加样量是3管，每管1毫升，意 味着加入样品的量为0.333克。
大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语， 它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的 一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方 面并非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸
杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠杆菌是人和温血动物肠道 内普遍存在的细菌，是粪便中 的主要菌种产。气一克般雷生白活氏在菌人大 肠中并不致病，但它侵入人体 一些部位时，可引起感染 。
4
第一法 大肠菌群MPN计数法
• 初发酵：月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤（LST）替代 了乳糖胆盐发酵培基
• 确证实验：煌绿乳糖胆盐肉汤 （BGLB）替代了乳糖复发酵培 养基，取消了革兰氏染色实验
• 培养时间：由24h延长至48h • 单位：由MPN/100g变为
MPN/g
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第一法 大肠菌群MPN计数法
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关于新国标大肠菌群MPN表的理解问题
改变加样量的问题。 这样查表得到的数值，应该降低10倍。
微生物大肠菌群检测ppt
平板分离：将产酸产气及只产酸的发酵管，接种于伊红美蓝 （紫黑色有金属光泽）或远滕氏（淡粉红色）、麦康凯 （玫瑰红色）琼脂平板上，35-37度培养24小时。
证实试验：将革兰氏染色阴性无芽孢杆菌菌落接种于单料乳 糖发酵管中， 35-37度培养24小时，产酸产气，即证实 有大肠菌群存在。
水源水 严重污染水：1，0.1,0.01,0.001mL 中度污染水：10，1，0.1,0.01mL 轻度污染水：100，10，1，0.1mL 大肠菌群变异不大的水源水：10mL10份 接种量1mL及1mL以内用单料乳糖胆盐 发酵管，接种量在1mL以上者，应保证接 种后发酵管中的总液体为单料培养液。
3.注意事项
乳糖发酵试验—分离培养—证实试验三步中，初发酵与证 实试验可能相差较大。
抑菌剂如胆盐等对大肠菌群中的某些菌株会有抑制作用。 猪、牛、羊的胆盐效果较好，去氧胆酸钠对结果影响较大， 胆盐剂量以0.5%较适宜。
挑选菌落时，EMB平板上，紫色菌落检出率较高，红色、 粉色较低；无典型菌落时，宜多挑选。
第二节 测定方法
1、测定程序
检样 稀释 乳糖胆盐发酵管
胆盐、或去氧胆酸钠
不产气 阴性 报告
革兰氏染色
产气 EMB、远腾氏等
乳糖发酵管
革兰氏阳性 革兰氏阴性无芽孢
阴性 报告
阳性 报告
产气
不产气 阴性 报告
2.多管发酵法测定方法
发酵试验：在2个装有50mL的3倍浓缩（三料）乳糖胆盐蛋 白胨培养液（含溴钾酚紫指示剂）的大试管或烧瓶中，无 菌操作加水样100mL.在10支装有5mL的三料乳糖胆盐发 酵管中（内有倒置小管），以无菌操作各加水样10mL,摇 匀后，37度培养24小时。
其它粪便污染指示菌 分支杆菌、拟杆菌、乳酸菌、梭状芽孢杆菌、粪链球菌 克雷伯菌、变形杆菌、副大肠杆菌
证实试验：将革兰氏染色阴性无芽孢杆菌菌落接种于单料乳 糖发酵管中， 35-37度培养24小时，产酸产气，即证实 有大肠菌群存在。
水源水 严重污染水：1，0.1,0.01,0.001mL 中度污染水：10，1，0.1,0.01mL 轻度污染水：100，10，1，0.1mL 大肠菌群变异不大的水源水：10mL10份 接种量1mL及1mL以内用单料乳糖胆盐 发酵管，接种量在1mL以上者，应保证接 种后发酵管中的总液体为单料培养液。
3.注意事项
乳糖发酵试验—分离培养—证实试验三步中，初发酵与证 实试验可能相差较大。
抑菌剂如胆盐等对大肠菌群中的某些菌株会有抑制作用。 猪、牛、羊的胆盐效果较好，去氧胆酸钠对结果影响较大， 胆盐剂量以0.5%较适宜。
挑选菌落时，EMB平板上，紫色菌落检出率较高，红色、 粉色较低；无典型菌落时，宜多挑选。
第二节 测定方法
1、测定程序
检样 稀释 乳糖胆盐发酵管
胆盐、或去氧胆酸钠
不产气 阴性 报告
革兰氏染色
产气 EMB、远腾氏等
乳糖发酵管
革兰氏阳性 革兰氏阴性无芽孢
阴性 报告
阳性 报告
产气
不产气 阴性 报告
2.多管发酵法测定方法
发酵试验：在2个装有50mL的3倍浓缩（三料）乳糖胆盐蛋 白胨培养液（含溴钾酚紫指示剂）的大试管或烧瓶中，无 菌操作加水样100mL.在10支装有5mL的三料乳糖胆盐发 酵管中（内有倒置小管），以无菌操作各加水样10mL,摇 匀后，37度培养24小时。
其它粪便污染指示菌 分支杆菌、拟杆菌、乳酸菌、梭状芽孢杆菌、粪链球菌 克雷伯菌、变形杆菌、副大肠杆菌
大肠菌群检测操作规范培训51页PPT
大肠菌群检测操作规范培训
56、极端的法规，就是极端的不公。 ——西 塞罗 57、法律一旦成为人们的需要，人们Байду номын сангаас就不再 配享受 自由了 。—— 毕达哥 拉斯 58、法律规定的惩罚不是为了私人的 利益， 而是为 了公共 的利益 ；一部 分靠有 害的强 制，一 部分靠 榜样的 效力。 ——格 老秀斯 59、假如没有法律他们会更快乐的话 ，那么 法律作 为一件 无用之 物自己 就会消 灭。— —洛克
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
60、人民的幸福是至高无个的法。— —西塞 罗
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
56、极端的法规，就是极端的不公。 ——西 塞罗 57、法律一旦成为人们的需要，人们Байду номын сангаас就不再 配享受 自由了 。—— 毕达哥 拉斯 58、法律规定的惩罚不是为了私人的 利益， 而是为 了公共 的利益 ；一部 分靠有 害的强 制，一 部分靠 榜样的 效力。 ——格 老秀斯 59、假如没有法律他们会更快乐的话 ，那么 法律作 为一件 无用之 物自己 就会消 灭。— —洛克
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
60、人民的幸福是至高无个的法。— —西塞 罗
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
菌落总数和大肠菌群数测定PPT讲稿
当前你正在浏览到的事第三十五页PPTT，共四十二页。
液体接种
当前你正在浏览到的事第三十六页PPTT，共四十二页。
复发酵
• 复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产
生
当前你正在浏览到的事第三十七页PPTT，共四十二页。
大肠菌群数测定
• 注意事项：
1.无菌操作 2.吸管使用 3.洗去染液的方法 4.显微镜保养 5.液体接种
灭菌接种环
分区划线法
• 操作要点
1.划下一个区前必须灭菌接种环 2.划线时接种环同平板呈30-40°角 3.每次划线应该压到上一个区域的2-3条线 4.用接种环的“面”而不是“弧”在平板上
滑动
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大肠菌群数测定
• 实验步骤
2.分离培养：
（5）菌落特征：
• 实验步骤
3.复发酵
（1）选取产气试管
（2）接种至10mlBGLB肉汤中 （3）培养：36℃，48h （4）观察指标：若产气则报告大肠菌群阳 性。
当前你正在浏览到的事第十九页PPTT，共四十二页。
大肠菌群数测定
• 实验步骤
2.分离培养 （1）制备伊红美蓝平板： 45 ℃，无菌，倾注，15ml （2）选产酸产气的发酵管 （3）接种至伊红美蓝平板
当前你正在浏览到的事第十一页PPTT，共四十二页。
初发酵
• 器材与试剂
样品、225ml无菌生理盐水、9ml无菌生理盐水、双料LST肉汤，单料 LST肉汤，10ml吸管、1ml吸管、吸球
当前你正在浏览到的事第十二页PPTT，共四十二页。
大肠菌群数测定
• 实验步骤：
1.初发酵
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液体接种
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复发酵
• 复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产
生
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大肠菌群数测定
• 注意事项：
1.无菌操作 2.吸管使用 3.洗去染液的方法 4.显微镜保养 5.液体接种
灭菌接种环
分区划线法
• 操作要点
1.划下一个区前必须灭菌接种环 2.划线时接种环同平板呈30-40°角 3.每次划线应该压到上一个区域的2-3条线 4.用接种环的“面”而不是“弧”在平板上
滑动
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大肠菌群数测定
• 实验步骤
2.分离培养：
（5）菌落特征：
• 实验步骤
3.复发酵
（1）选取产气试管
（2）接种至10mlBGLB肉汤中 （3）培养：36℃，48h （4）观察指标：若产气则报告大肠菌群阳 性。
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大肠菌群数测定
• 实验步骤
2.分离培养 （1）制备伊红美蓝平板： 45 ℃，无菌，倾注，15ml （2）选产酸产气的发酵管 （3）接种至伊红美蓝平板
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初发酵
• 器材与试剂
样品、225ml无菌生理盐水、9ml无菌生理盐水、双料LST肉汤，单料 LST肉汤，10ml吸管、1ml吸管、吸球
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大肠菌群数测定
• 实验步骤：
1.初发酵
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食品中大肠菌群的测定(共59张PPT)可编辑全文
应增加或减少。
➢酱油〔GB/T2717-2003〕
➢细菌菌落总数： ≤30000cfu/ml
➢大肠菌群：
≤30MPN/100ml
➢肠道致病菌： 不得检出
➢全脂奶粉、脱脂奶粉〔GB5410-1999〕
➢ 二级
特级
一级
➢细菌菌落总数：≤20000 ≤30000 ≤50000
➢〔cfu/ml〕
➢大肠菌群 ≤90
2、 初发酵试验
➢ 每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液 〔液体样品可以选择原液〕，每个稀释度接种3 管月 桂基硫酸盐胰蛋白胨〔LST〕肉汤，每管接种1mL〔如 接种量超过1mL，那么用双料LST肉汤〕, 36℃±1℃ 培养24h±2h ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产 气那么继续培养至48h±2h 。
➢ 〔2〕 液体样品
➢ 以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液 或生理盐水的无菌锥形瓶〔瓶内预置适当数量的无菌 玻璃珠〕中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀液。
➢ 〔3〕 样品匀液的pH 值应在6.5-7.5 之间，必要 时分别用1mol/L 氢氧化钠〔NaOH 〕或1 mol/L 盐 酸〔HCI 〕调节。
➢ 2 、别离培养 将产气的发酵管分别在伊红美兰琼脂
〔EMB琼脂〕平板上划线别离。然后置 36±1℃温箱内，培养18～24小时后取出， 观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实 试验。
➢可疑菌落特点： ➢具有金属光泽的深紫黑色菌落； ➢不带或略带金属光泽的菌落； ➢中心色较深的淡紫黑色菌落。
➢3 、证实试验 在上述平板上挑取可疑大肠菌落1～2
➢
3、接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆
盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆
_食品中大肠菌群的测定64页PPT
谢谢！
_食品中大肠菌群的测定
1、纪律是管理关系的形式。——阿法 纳西耶 夫 2、改革如果不讲纪律，就难以成功。
3、道德行为训练，不是通过语言影响 ，而是 让儿童 练习良 好道德 行为， 克服懒 惰、轻 率、不 守纪律 、颓废 等不良 行为。 4、学校没有纪律便如磨房里没有水。 ——夸 美纽斯
5、教导儿童服从真理、服从集体，养 成儿童 自觉的 纪律性 ，这是 儿童道 德教育 最重要舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
大肠菌群检验技术ppt课件
大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研 讨阐明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的 场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大 肠菌群在自然界存在的主要缘由。粪便中多以典型大肠杆菌为主， 而外界环境中那么以大肠菌群其他型别较多。
大肠菌群是作为粪便污染目的菌提出来的，主要是以该菌群 的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，阐 明了粪便污染的程度，也反映了对人体安康危害性的大小。粪便 是人类肠道排泄物，其中有安康人粪便，也有肠道患者或带菌者 的粪便，所以粪便内除普通正常细菌外，同时也会有一些肠道致 病菌存在〔如沙门氏菌、志贺氏菌等〕，因此食品中有粪便污染， 那么可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的能够性，埋伏着 食物中毒和流行病的要挟，必需看作对人体安康具有潜在的危险 性。
1．MPN检索表 2．初发酵和证明实验 பைடு நூலகம்．产气量与倒管 4．挑选菌落 5．抑菌剂
1．MPN检索表： MPN 为最大能够数(Most
Probable Number)的简称。这 种方法，对样品进展延续系列进
展稀释，参与培育基进展培育， 从 M释P度N规，检那定索么表的表只内给反数了响字三应个呈相稀应阳释降度性低，或管如添改数加用1不的0倍同出。的留稀现 率 意国，家规用范概和行率业论规范来中所推附算MP样N表品所用中稀菌释度数 最 是不近同的似，的而且数结值果报。告单位也不一样。
可以看到在发酵倒管内极微少的气 泡〔有时比小米粒还小〕，有时可 以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有 渐渐上浮的小气泡。实验阐明，大 肠菌群的产气量，多者可以使发酵 倒管全部充溢气体，少者可以产生 比小米粒还小的气泡。假设对产酸
4．挑选菌落： 国家规范中，需求对初发酵阳性培
大肠菌群是作为粪便污染目的菌提出来的，主要是以该菌群 的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，阐 明了粪便污染的程度，也反映了对人体安康危害性的大小。粪便 是人类肠道排泄物，其中有安康人粪便，也有肠道患者或带菌者 的粪便，所以粪便内除普通正常细菌外，同时也会有一些肠道致 病菌存在〔如沙门氏菌、志贺氏菌等〕，因此食品中有粪便污染， 那么可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的能够性，埋伏着 食物中毒和流行病的要挟，必需看作对人体安康具有潜在的危险 性。
1．MPN检索表 2．初发酵和证明实验 பைடு நூலகம்．产气量与倒管 4．挑选菌落 5．抑菌剂
1．MPN检索表： MPN 为最大能够数(Most
Probable Number)的简称。这 种方法，对样品进展延续系列进
展稀释，参与培育基进展培育， 从 M释P度N规，检那定索么表的表只内给反数了响字三应个呈相稀应阳释降度性低，或管如添改数加用1不的0倍同出。的留稀现 率 意国，家规用范概和行率业论规范来中所推附算MP样N表品所用中稀菌释度数 最 是不近同的似，的而且数结值果报。告单位也不一样。
可以看到在发酵倒管内极微少的气 泡〔有时比小米粒还小〕，有时可 以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有 渐渐上浮的小气泡。实验阐明，大 肠菌群的产气量，多者可以使发酵 倒管全部充溢气体，少者可以产生 比小米粒还小的气泡。假设对产酸
4．挑选菌落： 国家规范中，需求对初发酵阳性培
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理盐水或磷酸盐缓冲液、1mol/L氢氧化钠（NaOH ) 、 1mol/L 盐酸
ห้องสมุดไป่ตู้（HCI ) 。
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第一法大肠菌群MPN 计数
操作步骤 6.1、样品的稀释 6.1.1、 固体和半固体样品：称取25g 样品，放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水 的无菌均质杯内，8 00or/min-10 000r/min 均质1 min-2 min ，或放人盛有225ml磷酸 盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min-2 min ，制成1:10 的 样品匀液。 6.1.2、 液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品，置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水 的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀 液。 6.1.3、 样品匀液的pH 值应在6.5-7.5 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH ） 或1 mol/L 盐酸（HCI ）调节。 6.1.4、 用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml磷酸 盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试 管或换用1 支1ml无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
– 大肠杆菌 3.3除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
– 恒温培养箱、恒温水浴箱、 均质器、振荡器、无菌吸管或微量移液
器及吸头、无菌锥形瓶、无菌培养皿、菌落计数器等。
– 3.4培养基和试剂：月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST ）肉汤、 煌绿乳
糖胆盐（BGLB ）肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA ) 、无菌生
将3个稀释梯度的待检验样品稀释液接种于9支或15支试管培
养基中，每个稀释梯度试液接种3或5支。经过培养后，根据
结果查阅MPN检索表，就可以得到原样品中微生物的估计数
量。MPN检测方法尤其适用于带菌量、其他方法不能检测的
食品，如水、乳制品及其其他食品中大肠菌群的计数。
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材料
• 3.1食品样品：乳、肉、果汁、糕点、发酵调味品及其他食品。 • 3.2 菌种 阳性对照菌
大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌 群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。
大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对 人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康 人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正 常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志 贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存 在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威 胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。
大肠菌群测定
小组成员：蔡川川 金思利 杜梦娇 叶岳成 郑文龙
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讨论的问题
依据GB4789．3-2010，讨论若进行 食品中大肠菌群的测定，需准备好哪 些材料，且如何进行测定？
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大肠菌群的概述
大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细
菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，一般认为该 菌群细菌可包括大肠杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
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原国家商检局制定的行业标准
原国家商检局制定的行业标准采用美国FDA的标准方法，用于对出口食 品中的大肠杆菌进行检测。
推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉 汤。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。
证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中， 36±1℃培养48±2h，观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查MPN表，报 告1mL(g)样品中大肠菌群的MPN值。
国家标准 国家标准采用三步法，即乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。 乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆 盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。 分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养 18-24h，观察菌落形态。 证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发 酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。 报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN最大可能数表，报告每 100mL（g）大肠菌群的MPN值。具体操作参见GB4789.3—94 《中华人民共和 国国家标准 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定》
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食品中查出大肠菌群超标
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检验方法
由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即需氧及兼性 厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。因此大肠菌群的检 测一般都是按照它的定义进行。
中国采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制 定的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。
❖ 三步法：（1）发酵乳糖，产气产酸发酵试验；（2）初发酵 阳性管通过伊红美兰平板进行分离；（3）复发酵对分离菌 做证实实验。
❖ 食品中大肠菌群数系以每100g（或100ml）检样内大肠菌群
最近数(the most probable number 简称MPN)表示。最近数
MPN法是一种将样品“多次（管）稀释至无菌”的计数方法。
具体操作参见 SN0169—92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标 准 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》
检验流程
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大肠菌群的测定的原理
❖ 大肠菌群之一群能在37℃经24h能发酵乳糖，产生气体，需 氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人 畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量， 具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同 时间结指出食品是否有肠道致病菌污染的可能。
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6.1.5、 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10 倍递增系列稀 释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1ml无菌吸管或吸头。从制备样品匀液 至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。 6.2、 初发酵试验 每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液）， 每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml（如接 种量超过1ml，则用双料LST肉汤）, 36℃±1℃ 培养24h±Zh ，观察倒管内是 否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。记录在24h 和48h 内产气的 LST 肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。 6.3、 复发酵试验 用接种环从所有48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中分别取培养物l环，移种 于煌绿乳糖胆盐( BGLB）肉汤管中，36℃±1℃ 培养48h±2h ，观察产气情 况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 6.4、 大肠菌群最可能数（MPN ）的报告 根据大肠菌群阳性管数，检索MPN 表（见附录B ) ，报告每克（或毫升）样品 中大肠菌群的MPN 值。