大肠菌群测定方法
食品中大肠菌群的测定附mpn检索表
实验六食品中大肠菌群的测定一、概述(一)大肠菌群的定义及范围根据国家1994年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。
表5-4 大肠菌群生化特性分类表产气克雷伯氏菌+ + +n阴沟肠杆菌+ —+ + ——+/——注：+,表示阳性；一，表示阴性；+/-,表示多数阳性，少数阴性。
由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌i型和ni型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。
(二)大肠菌群的测定意义1、粪便污染的指标细菌早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。
一年后，塞乌博耳德“斯密斯(Theobold. Smith)氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。
据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108个/g —109个/g。
若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。
根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。
所以目前为评定食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。
当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只要被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。
2.粪便污染指标菌的选择作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确的指标作用。
大肠菌群测定能力验证技术方案
大肠菌群测定能力验证技术方案大肠菌群测定能力验证是指验证分析实验室的技术能力以测定大肠菌群（也称为肠道菌群）的项目。
大肠菌群是指人体消化道中的一类菌群，对维持肠道健康和消化系统正常功能起着重要作用。
因此，准确测定大肠菌群的能力对于研究肠道健康和疾病的发生机制具有重要意义。
下面将详细介绍大肠菌群测定能力验证的技术方案。
一、能力验证目标和内容：1.验证实验室准确测定大肠菌群的能力，包括测定菌群的种类、数量、多样性等指标。
2.验证实验室对样品的处理和分析方法的准确性和可重复性。
二、样品准备：1.采集肠道样品，可以是粪便样品或直肠拭子样品。
2.样品采集后应尽快进行处理，最好在4小时内完成。
三、实验室操作步骤：1.样品处理：（1）将样品加入消化液中，利用机械分散器将其均匀混合。
（2）将混合液离心，分离菌群所需的细胞沉淀。
（3）去除上清液，保留细胞沉淀。
2.提取DNA：（1）采用商用DNA提取试剂盒，按照说明书进行DNA提取。
（2）检测DNA的浓度和质量，确保提取的DNA质量良好。
3.扩增16SrRNA基因：（1）设计合适的引物，用于扩增16SrRNA基因片段。
（2）利用聚合酶链反应（PCR）技术进行扩增。
（3）检测PCR产物的大小和纯度，确保扩增效果良好。
4.高通量测序：（1）将扩增得到的PCR产物进行纯化和定量。
（2）将样品测序准备好的文库送至测序中心进行高通量测序。
（3）获取测序数据，准备进行下一步的数据分析。
5.数据分析：（1）对测序得到的原始数据进行质量控制和去除低质量序列。
（2）利用生物信息学方法对高质量序列进行聚类分析和物种注释。
（3）根据分析结果计算大肠菌群的多样性指数、物种组成和数量等重要指标。
四、能力验证方法：为验证实验室测定大肠菌群的能力，可以采用以下两种能力验证方法之一：1.实验室内对照：（1）从分析实验室中随机选取若干研究人员进行大肠菌群测定。
（2）研究人员之间相互进行样本交换，对测定结果进行比对和统计分析。
地下水总大肠菌群的测定方法
地下水总大肠菌群的测定方法
地下水中总大肠菌群的测定是非常重要的，因为它可以反映出
水质的卫生状况。
以下是一些常用的测定方法：
1. 膜过滤法，这是一种常用的测定方法，通过将地下水样品通
过0.45微米的膜过滤器，然后将膜放置在含有大肠菌群特异培养基
的琼脂平板上进行培养。
培养后，通过计数形成的菌落来确定水样
中大肠菌群的数量。
2. 荧光素基因定量PCR法，这是一种分子生物学方法，通过提
取地下水中的DNA，使用荧光素基因特异引物进行PCR扩增，然后
使用荧光素探针进行定量检测。
这种方法可以快速准确地测定大肠
菌群的数量。
3. 色素培养基法，使用含有某种特定底物的琼脂平板进行培养，通过大肠菌群对底物的特异反应产生的颜色变化来测定其数量。
4. 流式细胞术，这是一种高通量的测定方法，通过将水样中的
微生物染色标记，然后通过流式细胞仪进行快速准确地测定大肠菌
群的数量。
总的来说，测定地下水中总大肠菌群的方法有多种，可以从不同的角度对水质进行评估。
在实际应用中，可以根据实际情况选择合适的方法进行测定。
食品中大肠菌群的测定实验报告
食品中大肠菌群的测定实验报告一、实验目的。
本实验旨在测定食品中的大肠菌群数量，以评估食品的卫生安全水平。
二、实验原理。
食品中的大肠菌群是指能在37℃条件下在Lauryl Tryptose Broth培养基中生长产气的革兰氏阴性杆菌的总数。
大肠杆菌是大肠菌群的代表性菌种，因此其数量可以作为食品卫生安全的指标之一。
三、实验步骤。
1. 取样，从不同来源的食品中取样，如肉类、蔬菜、水果、奶制品等。
2. 样品处理，将取样的食品样品进行处理，如洗涤、研磨等，以获得可检测的样品。
3. 菌落计数，将处理后的样品接种在Lauryl Tryptose Broth培养基中，培养一定时间后，进行菌落计数。
4. 数据分析，根据菌落计数结果，计算出食品中的大肠菌群数量。
四、实验结果。
经过实验测定，不同食品样品中的大肠菌群数量有所不同。
其中，肉类制品中的大肠菌群数量较高，蔬菜水果中次之，奶制品中较低。
这表明食品的卫生安全水平存在一定差异。
五、实验结论。
食品中的大肠菌群数量是评估食品卫生安全水平的重要指标之一。
通过本实验的测定，可以初步评估食品的卫生安全状况，为食品生产和消费提供参考依据。
未来可以结合其他指标和方法，进一步完善食品卫生安全评估体系。
六、实验注意事项。
1. 在取样和处理过程中，要注意避免外源污染，以保证实验结果的准确性。
2. 在菌落计数过程中，要严格按照操作规程进行，避免误差的产生。
3. 实验结束后，要及时清洗和消毒实验器材，以确保实验室的卫生安全。
七、参考文献。
1. 《食品微生物学实验指导》，XXX，XXX出版社，200X年。
2. 《食品卫生与安全》，XXX，XXX出版社，200X年。
以上为食品中大肠菌群的测定实验报告内容，谢谢阅读。
食品中大肠菌群的检测及分离纯化
实验8: 食品（饮用水）中大肠菌群的检测（滤膜法）及分离纯化（6学时）一、目的要求1.利用滤膜法测定食品中大肠菌群。
2.掌握分离微生物的基本操作。
二、基本原理1.滤膜法是采用过滤器过滤水样，使其中的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜放在适当的培养基上进行培养，大肠菌群可直接在膜上生长，从而可直接计数。
所用滤膜是一种多孔硝化纤维膜或乙酸纤维膜，用水系过滤膜即可，其孔径约0.45μm。
2.在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。
得到纯培养的过程称为分离纯化。
三、试验原料及器材实验原料：伊红美蓝琼脂平板或远藤氏琼脂平板，乳糖蛋，蛋白胨，灭菌水，饮用水等；器材：镊子；夹钳；烧杯；真空泵；滤膜；过滤器等。
四、操作步骤1.大肠菌群的检测（1）滤膜灭菌将滤膜放入装有蒸馏水的烧杯中，加热煮沸15分钟，共煮沸三次，前两次煮沸后换水洗涤2—3次再煮，以洗去滤膜上残留的溶剂。
（2）过滤器装置用无菌手续将已灭菌的过滤器基座、滤膜、漏斗和抽滤瓶安装好，其中滤膜用灭菌镊子(浸在95%酒精内，用时通过火焰灭菌)移至过滤器的基座上。
其他可直接用手或夹钳操作，但不要碰到伸入抽滤瓶的橡皮塞部分，以免染菌。
（3）将抽滤瓶接上真空泵。
（4）加水样过滤直径50mm的滤膜，所过滤的水量以培养后长出的菌落数一般需要较多过滤器装置，多于50个为适宜，所以采用多联过滤器最好，可以减少误差。
一般清洁的深井水或经处理过的河水与湖水等可取样 300—500 ml；对比较清洁的河水或湖水，可取样1-100ml；严重污染的水样可先进行稀释；未知的水样可做三个稀释度，选择菌落数合适的稀释度进行计算。
本次实验于过滤器漏斗内加入比较河水或湖水100ml，加盖。
（5）开动真空泵进行油滤。
（6）抽完后，加入等量的灭菌水继续抽滤，目的是冲洗漏斗壁。
（7）滤毕，关上真空泵，用灭菌镊子取滤膜边缘，将没有细菌的一面紧贴在伊红美蓝琼脂平板上。
滤膜与培养基之间不得有气泡。
大肠菌群测定检验标准
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值（见表一）。
XXXXXXX有限公司
文件编号
3-QC-TS-006
制定单位
质检部
页 码
4/7
文件名称
大肠菌群测定方法及标准
版 本
大肠菌群最可能数(MPN)检索表（表一）
阳性管数
MPN
100mL(g)
95﹪可信限
制定单位
质检部
页 码
2/7
文件名称
大肠菌群测定方法及标准
版 本
5.5 0.85%灭菌生理盐水。
6.检验程序
大肠菌群检验程序如下：
检样
稀释
乳糖胆盐发酵管
36±1℃，24±2h
不产气 产气
伊红美蓝琼脂平板
大肠菌群阴性 36±1℃，24±2h
报告 革兰氏染色 乳糖发酵管
36±1℃，24±2h
革兰氏阳性 革兰氏阴性无芽胞杆菌
1mL(g)×3
0.1mL(g)×3
0.01mL(g)×3
下限
上限
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
2
3
＜30
30
60
90
＜5
90
0
0
0
0
1
1
1
1
0
1
2
3
30
60
90
120
＜5
130
0
0
0
0
2
2
2
2
0
1
2
3
60
90
120
大肠菌群测定方法
大肠菌群测定方法大肠菌群是人体内肠道中的一类细菌群，对人体具有重要的生理功能。
测定大肠菌群的方法有很多种，包括传统的培养法、分子生物学方法以及肠道菌群DNA测序等。
传统的培养法是测定大肠菌群的一种常用方法。
这种方法主要是将肠道样本采集后，通过在培养基上培养细菌来测定大肠菌群的分布情况。
首先，将采集到的样本放入富营养培养基中培养，然后通过对细菌在培养基上的生长情况以及染色特性进行观察和鉴别。
通过这种方法可以初步了解肠道中细菌的类型和数量，但是存在着一些限制，比如只能培养出一些特定的细菌，而有些细菌无法通过这种方法来测定。
分子生物学方法是一种较新的测定大肠菌群的方法。
这种方法主要是通过分析肠道样本中的细菌DNA来测定大肠菌群的类型和数量。
首先，将肠道样本中的细菌进行裂解，提取其中的DNA。
然后利用特定的引物对DNA进行扩增，最后通过凝胶电泳等方法分析扩增产物的大小和数量来判断肠道中细菌的组成。
与传统的培养法相比，分子生物学方法可以测定更多种类的细菌，并且更加准确和快速，但是也有一些限制，比如需要复杂的实验操作和设备，以及对样本的处理要求较高。
肠道菌群DNA测序是一种较新的测定大肠菌群的方法。
这种方法是在分子生物学方法的基础上发展而来的，主要是利用高通量测序技术对肠道样本中的细菌DNA进行全面的测序分析。
首先，将肠道样本中的细菌DNA进行提取和净化，然后对DNA进行测序，得到大量的序列数据。
最后通过对序列数据进行比对和分析，可以得到肠道中细菌的种类和数量，进一步了解整体的菌群结构和功能。
与前两种方法相比，肠道菌群DNA测序具有更高的准确性和分辨率，可以得到更全面和详细的信息，但是也需要更多的实验和数据处理，并且成本相对较高。
总的来说，大肠菌群测定方法包括传统的培养法、分子生物学方法和肠道菌群DNA测序等。
每种方法都有其优缺点，选择合适的方法需要根据具体的研究目的和经济条件来决定。
而随着科学技术的不断进步，相信未来还会有更多更先进的方法出现来帮助我们更好地测定大肠菌群。
大肠菌群测定检验标准
XXXXXXXXXXXXXXX文件编号3-Q C-TS-006 制定单位质检部页码1/7大肠菌群测定方法及标准版本 A 文件名称1.范围本标准规定了食品中大肠菌群的测定方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的测定。
2.引用标准以下标准所包含的条例，通过在本标准中引用而成为本标准的条文。
本标准出版时，所示版本均为有效。
全部标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用以下标准最版本的可能性。
GB/T4798.3-2023 食品卫生微生物学检验大肠菌群测定方法及标准GB/T4789.28-2023 食品卫生微生物学检验染色法、培育基和试剂3.术语和定义大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指数来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群系以 100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
4.设备和材料4.1 恒温培育箱：36℃±1℃4.2 冰箱：0℃--4℃4.3 恒温水浴锅：46℃±1℃4.4显微镜4.5均质器或乳钵4.6灭菌培育皿：直径为 90mm4.7 灭菌试管：16×1604.8灭菌吸管：1mL〔具 0.01mL 刻度〕、10mL〔具0.1mL 刻度〕4.9灭菌锥形瓶或三角瓶： 500mL4.10灭菌玻璃珠：直径约为 5mm4.11架盘药物天平：0g～100g 准确至 0.1g4.12灭菌剪子、镊子等。
5.培育基和试剂5.1乳糖胆盐发酵管：见附录一中 15.2伊红美蓝琼脂平板：见附录一中 25.3乳糖发酵管：见附录一中 35.4革兰氏染色液：见附录一中 4XXXXX文件编号3-QC-TS-006 制定单位质检部页码2/7 文件名称大肠菌群测定方法及标准版本 A5.50.85%灭菌生理盐水。
6.检验程序大肠菌群检验程序如下：检样稀释乳糖胆盐发酵管36±1℃，24±2h不产气产气伊红美蓝琼脂平板大肠菌群阴性36±1℃，24±2h报告革兰氏染色乳糖发酵管36±1℃，24±2h 革兰氏阳性革兰氏阴性无芽胞杆菌大肠菌群阴性产气不产气大肠菌群阴性报告7.操作步骤：7.1检样稀释大肠菌群阳性报告报告7.1.1以无菌操作，将检样25g(或 25mL)放于含有 225 mL 灭菌生理盐水或其它稀释液的灭菌玻璃瓶内 (瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成 1：10 的均匀稀释液。
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大肠菌群及检验
一、大肠菌群介绍
大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。
调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。
粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。
大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。
大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。
粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。
大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工
作中。
二、大肠菌群检验方法：由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。
目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。
两个标准方法在检测程序上略有不同。
（一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。
乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。
36±1℃培养48±2h，观察是否产气。
分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。
证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。
同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。
报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。
具体操作参见GB4789.3-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》
（二）原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。
本方法采用两步法：推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。
36±1℃培养48±2h，观察是否产气。
证
实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48±2h，观察是否产气。
以BGLB产气为阳性。
查MPN表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的MPN值。
具体操作参见SN0169-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》三、说明：
1．MPN检索表：MPN 为最大可能数(Mos t Probable Numbe r)的简称。
这种方法，对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。
MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。
注意国家标准和行业标准中所附MPN表所用稀释度是不同的，而且结果报告单位也
不相同。
2．初发酵和证实试验：无论是国家标准的三步法还是行业标准的两步法，都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验，培养基的配制略有不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。
初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。
有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。
因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。
3．产气量与倒管：在乳糖发酵试验工作中，经常可
以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。
实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。
如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。
4．挑选菌落：国家标准中，需要对初发酵阳性培养物接种伊红美蓝平板分离，对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。
由于大肠菌群是一群细菌的总称，在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。
国家标准方法规定伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时，检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低。
另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典型时，很难避免假阴性的出现。
所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。
5．抑菌剂：大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。
抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。
国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，B GLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。
抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠
菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。
有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法进行。
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