(完整版)实验9水中总大肠菌群的测定—多管发酵法
水质 总大肠菌群的测定
水质总大肠菌群的测定多管发酵法方法学报告起始日期：2018年月日结束日期：2018年月日一、实验目的掌握水中总大肠菌群的测定方法及原理。
二、依据标准文献GB/T 5750.12-2006生活饮用水标准检验方法微生物指标 2 多管发酵法三、适用范围生活饮用水及水源水总大肠菌群的测定。
四、方法原理总大肠菌群是指一群需氧及兼性厌氧的,在37℃生长时能使乳糖发酵,在24h内产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
多管发酵法的原理是根据统计学理论，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数，估计水体中大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。
试验结果以最可能数，简称MPN 表示。
计算出数量/L。
（most probable number）五、仪器设备(1)立式压力蒸气灭菌器型号：YXQ-LS-50SII 容积：50升(2)恒温培养箱，超净工作台。
(3)酒精灯、镍铬丝接种棒。
(4)培养皿（直径100mm）、试管（5×150mm），吸管（1、5、10mL）、烧杯(5)（200、500、2000mL）、锥形瓶（250、1000mL）、采样瓶。
六、试剂材料培养基：乳糖蛋白胨培养液、伊红美蓝培养基，营养琼脂。
七、实验步骤 1. 试验准备乳糖蛋白胨培养液：按瓶上标志配制好液体培养基后，取10支20毫升试管，5支30毫升试管，内置小导管。
5支30毫升试管加入10 mL 2倍浓度的乳糖蛋白胨培养液，10管加入10 mL 单倍浓度的乳糖蛋白胨培养液，试管加硅胶塞。
伊红美蓝培养基：按瓶上标志配制好300 mL 液体培养基后，倒入锥形瓶500mL 中，加硅胶塞。
营养琼脂：按瓶上标志配制好200mL 液体培养基后，倒入锥形瓶500mL 中，加硅胶塞。
取采样瓶多个，接种棒，培养皿35对，密封包装。
以上物品材料于 121℃高压灭菌器中灭菌 30min 备用。
2. 样品测定取500mL 锥形瓶内的营养琼脂液体培养基，倒入约20mL 灭菌好的培养皿中，超净工作台不同位置各放1对，共10对，操作间不同位置各各放1对，共10对。
实验九 多管发酵法测定水中大肠菌群
证实有大肠菌群存在后，再根据复发酵的阳性管
（瓶）数查表，即得每升水样中的大肠菌群数。
▲ 将100、10、1、0.1（10-1）ml水样的发酵管 结果查表3 ▲ 将10、1、0.1（10-1）、0.01（10-2）ml水 样的发酵管结果查表4
五 实验报告
实验课程论文
封面格式 《水处理微生物学》课程实验
3 复发酵试验
以上大肠菌群阳性菌落，经涂片革兰氏染 色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再 进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸 又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
水样 接种
初步 发酵
产酸 产气
大肠菌群
厌氧芽孢杆菌
好氧芽孢杆菌
平 板 分 离
鉴 别 培 养 基
产酸 复发酵
大肠菌群
二 基本原理
多管发酵法包括三个部分
▲ 初发酵试验 ▲ 平板分离 ▲ 复发酵试验
1 初发酵实验
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置杜氏小套管。 乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群 能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基 内加有溴甲酚紫作为PH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来 的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的 作用。 水样接种于发酵管内，37℃下培养： （1）24h内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变 ，说明水中存在大肠杆菌，疑为阳性结果； （2）在量少的情况下，也可能延迟48h后才产酸产气，此时应 视为可疑结果。
（1） 稀释水样：原水样 10-1
10-2
（2） 初步发酵试验
——接种水样
混匀后，37℃培养24h，24h未产气的继续培养至48h。
水样稀释及接种
微生物实验报告水中细菌总数和大肠菌群的检测
实验六水中细菌总数和大肠菌群的检测摘要:本实验以测定公园河流水的细菌总数和大肠菌群的数量，来测定特定地点的水质情况.初步介绍了一种通用的方法来检测水源的健康指标，判定水体的质量。
对该实验点的水源作出了定性的评价，以及关于试验中如何提高梯度重复的精度的分析。
关键字：河流水；细菌总数测定；大肠菌群;EMB培养前言各种天然水中常含有一定数量的微生物。
水中细菌总数往往同水体受有机污染程度呈正相关,因而是评价水质污染程度的重要指标之一。
细菌总数是指1mL水样中所含细菌菌落的总数[cfu/g（mL)],可用稀释平板计数法检测.水中大肠菌群的数量可用来判断水源是否被粪便污染，并可间接推测水源受肠道病原菌污染的可能。
特征:G—无芽孢杆菌，兼性厌氧、在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气。
多管发酵法初发酵:适当稀释样品,乳糖发酵培养，产酸产气;分离培养:伊红美蓝(EMB）平板上划线分离，出现紫色、粉红色特征性菌落；复发酵验证：挑取特征性菌落进行乳酸复发酵验证。
材料和方法牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：用于水中细菌总数测定牛肉膏5g，蛋白胨10g， NaCl 5.0 g，琼脂8g，蒸馏水1000ml; pH 7。
0乳糖胆盐蛋白胨培养基：用于初发酵1×：蛋白胨 20g、牛胆盐 5g、乳糖 10g、0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL（调pH值后加）、水1000mL、pH 7。
2－7。
4三倍浓缩液（3×）:除水以外,其余成分取三倍用量分装：1×的培养基分装9ml/管, 3×的培养基分装5ml/管或50ml/瓶，均装上德汉氏小管。
灭菌条件：115℃ ,15min。
EMB培养基：用于大肠菌群菌落鉴定脱水培养基,按说明书操作，水用量为90％.水源：紫竹院河水仪器：高压灭菌锅、无菌培养皿、试管、吸管、接种环、德汉氏小管、温箱、载玻片、酒精灯、显微镜等。
试剂：牛肉膏,蛋白胨,NaCl,琼脂粉，伊红美兰琼脂培养基、水、乳糖、0.04%溴甲酚紫水溶液、胆盐、革蓝氏染色试剂具体实验步骤：1)，相关器械的灭菌操作，以及前往紫竹院取少量的样品水。
多管发酵法测定水中大肠菌群
综合实验报告书（2014~2015 学年）实验题目多管发酵法总测定水中大肠菌群学院名称生物与食品工程学院专业（班级）2012级生物工程姓名（学号）孙大林20122151032015年01 月13日多管发酵法测定水中大肠菌群摘要：利用多管发酵法检测自来水和池塘水中大肠菌群的数量，以对不同水样的大肠菌群污染情况做出初步判断。
根据«中华人民共和国国家标准生活饮用水标准检验法»中有关大肠菌群的检测方法与指标对上述水样进行检测。
通过记录阳性管数并查最大可能数表（MPN）查出不同水样中大肠菌群的可能含量。
多管发酵法的原理是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验等三个步骤进行实验，得出水样中总大肠菌群数，实验结果以最大可能数MPN表示。
关键词：多管发酵法、大肠菌群、最大可能数（MPN）Abstract: the use of multiple tube fermentation test of tap water and the number of coliform group, pond water in different water samples of coliform bacteria pollution make a preliminary judgment.According to "the People's Republic of China national drinking water standard inspection » in the fecal coliform detection method and index of the water samples fortesting.Tube by a positive record number (MPN) maximum possible log tables and check of coliform bacteria may content in different water samples.Multi-tube fermentation principle is based on fecal coliform bacteria can ferment lactose produce acid gas and possess a gram negative, no spore, assumes the rods and so on characteristics, through the early (step) fermentation test, plate separation and the complex fermentation test three steps of the experiment, it is concluded that the total number of coliform bacteria in water samples, the experimental results with the greatest possible number of MPN said.Key words: multi-tube fermentation coliform groupthe greatest possible number (MPN)由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。
多管发酵法检测水中的大肠菌群的实验报告
学院：环境科学与工程学院班级：11级环境科学（2）班姓名：李宝携学号：3111007398实验3 多管发酵法检测水中的大肠菌群一、实验目的（1）了解饮用水和水源水大肠菌群的原理和意义。
（2）学习检测水中大肠菌群的方法。
二、实验原理大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。
大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48小时内发酵乳糖并产酸产气。
我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过三个。
多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。
当发酵产酸时，溴甲酚紫可由紫色变为黄色，乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
三、实验材料1、水样中心湖湖水2、试剂三倍浓缩乳酸蛋白胨培养液3、仪器及其他用品试管、发酵管、烧杯、量筒、移液枪、高压灭菌锅四、操作过程1、取16支发酵管，其中5支加入5mL三倍乳糖蛋白胨培养液。
取35mL三倍乳糖蛋白胨培养液于烧杯中，量取70mL水进行稀释，将三倍乳糖蛋白胨培养液稀释成一倍的乳酸蛋白胨培养液，分别取10mL一倍的乳酸蛋白胨培养液与10支试管中，最后，1支加入9ml自来水。
2、完成后包装好，于121℃高压灭菌锅中灭菌30min左右。
3、灭菌完毕，冷却后，在无菌操作条件下，向装有三倍的乳酸蛋白胨培养液的5支试管加入10ml水样，向装有一倍的乳糖蛋白胨培养液的5支试管中加入1ml水样。
取1mL的水样于装有9mL自来水的试管中，混合摇匀，并分别移1mL于另外的5支10mL的试管中。
4、将各试管充分混均，包装完成，将其置于37℃恒温箱中培养24h。
5、取出培养液，观察试管的颜色及其中的气泡数并记录数据。
6、观察完毕，清洗仪器并整理数据。
五、实验结果实验现象：有些试管的颜色变成黄色，并且有些试管中的发酵管的底部存在气泡，说明存在产酸产气的大肠杆菌。
多管发酵法测定水中大肠菌群实验报告
多管发酵法测定水中大肠菌群摘要：初步发酵实验中将水样接种与乳糖蛋白胨液体培养基的发酵管内，37度下培养，24内小管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性如果，如果出现产生气泡但不变色或者变色但不产气的情况，应该延长培养至48小时，若仍不的为阴性反应。
平板分离实验中把初实验产期产酸的试管的菌接到伊红美兰琼脂平板上然后培养24小时。
复发酵实验中将以上大肠杆菌阳性菌落，经涂色染色为革兰阴性无芽孢杆菌，通过次试验进一步证实原理：初发酵实验：发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一个杜氏小管。
乳糖能其选着作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠杆菌能发酵乳糖而产气产酸。
为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为指示剂，细菌产酸后培养基由原来的紫色变为黄色。
初步发酵实验中将水样接种与乳糖蛋白胨液体培养基的发酵管内，37度下培养，24内小管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性如果，如果出现产生气泡但不变色或者变色但不产气的情况，应该延长培养至48小时，若仍不产气的为阴性结果。
平板分离：伊红美兰琼脂培养基有伊红和美兰两种染料，在此作为指示剂，大肠杆菌发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料及结合，使培养基产生有金属光泽的深紫色菌落。
复发酵实验：以上大肠杆菌阴性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢的，通过此试验进一步证实。
原理与初发酵实验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠杆菌阴性结果。
材料与用具：1.培养基乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置杜氏小管）三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（内有杜氏小管）伊红美兰琼脂平板2．无菌水3. 用具载玻片灭菌带玻璃塞空瓶灭菌试管灭菌吸管方法：1水样的采取从不同水体（自来水、河水）中采集样品2自来水检查（1）初发酵实验在2个含有50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入100ml水样。
在10支含有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样。
实验九水中总大肠菌群的测定
5 复发酵试验 上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌;则挑选该菌落的另一
部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中内有倒置管;每管可接 种分离自同一初发酵管的最典型菌落1～3个;然后置于37℃恒温箱中培养24h; 有产酸 产气者;即证实有大肠菌群存在; 根据证实有大肠菌群存在的阳性管瓶 数查附表1大肠菌群检数表;报告每升水样中的大肠菌群数;
30min; 对热不稳定的培养基如含有葡萄糖 氨基酸等物时;应适当降低压力;
延长时间;
5灭
菌时间一到;切断电源;待压力降至零时;才能打开排气阀;然后打开灭菌器盖;
取出物品;
手提式高压蒸 汽灭菌锅
高压蒸汽自动 灭菌锅
斜面摆放与冷凝 倒平板操作法示意图
五 操作步骤 1 水样的采取 1检测自来水
先将自来水龙头用火焰烧灼3 min灭菌;再开放水龙头使水流5 min后;在 火焰旁打开灭菌三角瓶塞;以其接取水样;迅速地进行分析; 2检测池水 河水或湖水
培养基配制操作图示：
用漏斗分装培养基及摆斜面
培养基的分装：一般制作斜面培养基时;每只15×150毫米的试管;约装 3～4毫升1/4～1/3试管高度;如制作深层培养基;每只20×220毫米的试 管约装12～15毫升; 每只锥形瓶装入的培养基;一般以其容积的一半为宜;
包扎
1 培养皿：以旧报纸密密包紧;一般以6套做一包;待灭菌; 2 吸管：在距其粗头顶端约0 5cm处;塞一小段1 5cm长的棉花; 棉花要 塞得松紧恰当过紧;吹吸液体太费劲；过松;吹气时棉花会下滑;然后 分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端;与报纸约呈60º角; 并将右端多余的报纸打一小结; 3 三角玻扒：跟包扎吸管相似;将三角部分斜放在报纸条的近左端;与 报纸约呈45º角;并将右端多余的报纸打一小结; 4 玻璃器皿 金属器械包扎完毕后置干燥箱160170℃灭菌2 h
水中大肠杆菌的检测(多管发酵法)
水中大肠杆菌群书的检测（发酵法）一、试验目的：1.了解和学习水中大肠杆菌的测定原理和测定意义。
2.学习和掌握水中大肠杆菌的检测方法。
二、试验原理：水的微生物学的检验，特别是大肠杆菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水的标准规定饮用水中大肠杆菌群书每升中不超过3个，细菌总数每毫升不超过100个。
水中大肠杆菌的检验方法，常用多管发酵发和滤膜法。
多管发酵发可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。
滤膜法仅用于自来水和深井水。
操作简洁快速，但不适用于杂质较多，易于阻塞滤孔的水样。
三、实验器材：1. 水样：自来水2.试剂：乳糖蛋白胨发酵管内有倒置小套管三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管瓶内有倒置小套管伊红美蓝或复红亚硫酸钠琼脂平板革兰氏染液。
3.仪器及其它用品：载玻片灭菌带玻璃塞空瓶灭菌吸管灭菌试管革兰氏染液显微镜香柏油二甲苯擦镜纸吸水纸灭菌三角瓶等四、实验步骤：第一步：1.水样的采集自来水洗将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，在开放水龙头取水流5ｍｈ，以灭菌山角瓶接水取样以备分析。
2.用发酵法检查大肠杆菌（1）生活饮用水的检验①初步发酵试验：在2个各装有50ｍｈ的3倍乳糖蛋白胨培养液的三角瓶中，以无菌操作各自加水样10ｍｈ。
摇匀后，37℃培养24ｈ第二步：②平板分离：经24ｈ培养后。
特产酸产气及只产酸的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板（EMD培养基上），37℃培养18～24ｈ。
大肠杆菌群在EMD平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深，挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。
第三步：③复发酵试验：将革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同一类型菌群1～3个，37℃培养24ｈ，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。
第四步：④报告：根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管，查表，报告每升水样品中大肠菌群数（MPN）.。
水中总大肠菌群的测定法(多管发酵法)
1适用范围本标准适用于天然水和生活水中总大肠菌群的测定。
2方法概要总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37C 生长时能使乳糖发酵，在 24h 内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
总大肠菌群数系指每升水样中所含有的总大肠菌群的数目。
总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。
本标准参照GB 5750-85制订。
3试剂和材料 3.1乳糖蛋白胨培养液：外购商品培养基或按下列方法自行配制。
3.1.1 组分蛋白胨 10.0g 牛肉膏 3.0g乳糖 氯化钠1.6 %溴甲酚紫乙醇溶液蒸馏水3.1.2 配制将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于 节pH为7.2〜7.4，再加入1ml 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，置于高 压蒸汽灭菌器中，以 115C 灭菌20分钟，贮存于冷暗处备用。
3.2 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液: 按上述乳糖蛋白胨培养液（ 3.1 ）各组分的称量增加三倍配制。
3.3 品红亚硫酸钠培养基（供多吕发酵法用） :外购商品培养基或按卜列万法自行配制。
3.3.1组分蛋白胨 10.0g乳糖10.0g磷酸氢二钾3.5g琼脂10〜30g蒸馏水1000ml无水亚硫酸钠5g 左右 5.0g 5.0g 1.0ml 1000ml1000ml 蒸馏水中加热溶解，用 1mol/L 的NaOH 或HCI 调332 贮备培养基的配制先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，用1mol/L的NaOH或HCI调节pH为7.2〜7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置于高压蒸汽灭菌器中，以115C灭菌20分钟，贮存于冷暗处备用。
3.3.3平皿培养基的配制将上法制备的贮备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中。
再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解后，置于沸水浴中煮沸10分钟以灭菌。
九龙江水大肠杆菌群测定的实验报告1
九龙江水大肠杆菌群的测定林淑丽（漳州师范学院10级生物系食品科学与工程 101304116）摘要：本文通过多管发酵法、革兰氏染色法两种不同的方法测定九龙江水大肠杆菌群数量。
初步掌握多管发酵法及革兰氏染色法。
了解大肠杆菌在饮水中的重要性和革兰氏染色原理在细菌分类鉴定的重要性。
关键词：多管发酵法大肠杆菌九龙江水革兰氏阴性无芽孢杆菌THE DETERMINATION OF COLIFORM BACTERIA WHICH IN THEJIULONG RIVERLin Shuli(10Food science and engineering in Biology department, Zhangzhou NormalUniversity 101304116)Abstract: this article through multiple tube fermentation and gram's staining method two different methods to determine the Kowloon river escherichiacoli group of quantity. Preliminary grasp tube fermentation and gram'sstaining method. Understand the importance of e. coli in drinking waterand gram stain principle in the importance of bacteria classificationand identification.Keywords: much tube fermentation; E. Coli; the water of Jiulong River;gram-negative; sporeless bacterium大肠杆菌（学名：Escherichia coli，通常简写为E. coli）)是生活在温血动物（包括鸟类和哺乳动物）大肠中的重要细菌种类，对食物正常消化具有重要作用。
总大肠菌群多管发酵法测定步骤
总大肠菌群多管发酵法测定步骤1. 什么是总大肠菌群？总大肠菌群，这个名字听上去是不是有点拗口？其实它就是咱们肚子里的一种细菌，主要生活在肠道里。
别看它们个头小，作用可大着呢！总大肠菌群可以帮助消化食物，维护肠道健康。
不过，如果它们出现在不该出现的地方，比如水里或者食物中，那可就麻烦了。
所以，监测总大肠菌群的数量，就显得尤其重要。
2. 为什么要用多管发酵法？说到检测总大肠菌群，咱们就不得不提到“多管发酵法”了。
这种方法简单易行，适合各种实验室使用，关键是准确度也杠杠的。
用这方法，咱们可以快速判断出样本中是否含有大肠菌群，真是一箭双雕嘛！而且，这个过程就像做个小实验，感觉就像是科学家在实验室里调配药水，嘿嘿，兴奋得很。
2.1 准备工作首先，咱得准备一些工具和材料。
首先，你得有样本，可能是水或者食物，随便哪个都行。
然后，你需要一些培养基，像是琼脂培养基或者液体培养基。
接着，准备一组试管，最好是八个，这样可以多做几组对比。
最后，别忘了准备好接种环和无菌操作的工具，保证你的实验环境洁净卫生，万一有其他细菌混入，那就得不偿失了。
2.2 实验步骤好啦，准备工作做得差不多了，接下来就进入核心步骤。
首先，咱得将样本取出，记得用无菌的方式哦，这可是科学的基本要求。
然后，把样本稀释，比如取1毫升样本，加9毫升的生理盐水，轻轻摇匀。
接着，咱就开始接种了！用接种环轻轻地从稀释液中取出一些，接种到试管里的培养基中。
哇，感觉像是在给细菌开派对一样，嘿嘿！然后，把试管放在温控箱里，一般温度设定在3537度，这样有利于大肠菌群的生长。
等个24小时，咱们就可以来看结果了。
结果出来后，看看试管里的液体是否变成浑浊状态，这就是发酵的表现哦。
如果有气泡产生，那就说明有总大肠菌群在派对上欢乐地唱歌跳舞啦！3. 结果分析实验结果出来之后，咱们可得好好分析一下。
要是有发酵的现象，那就得进一步确认大肠菌群的具体数量。
这里面有个技巧，就是要用不同的稀释倍数进行多次接种，这样可以帮助咱们更准确地估算出总大肠菌群的数量。
实验九 水中大肠菌群数的测定
实验九水中大肠菌群数的测定一、目的要求学习大肠菌群数的检测原理和方法。
二、实验材料1.样品：水样2. 培养基：乳糖胆盐发酵管(单料及双料)，伊红美兰琼脂(EMB)平板，乳糖发酵管。
3. 其他：显微镜，酒精灯，无菌吸管(10m1、1m1)，接种环，载玻片等三、基本原理水中的病原菌多数来源于病人和病畜的粪便。
由于病原菌的数量少，检测过程复杂，因此，直接测它们的存在是非常困难的专业化工作。
由于大肠菌群在粪便中数量大，在体外存活时间与肠道致病菌相近，且检验方法比较简便，因此一般采用测定大肠菌群或大肠杆菌的数量来作为水被粪便污染的标志。
如果水中大肠菌群的菌数超过一定的数量，则说明此水已被粪便污染，并有可能含有病原菌。
大肠菌群的定义是指一群好氧和兼性厌氧、革染氏阴性、无芽孢的杆状细菌，并能在乳糖培养基中，经37℃24~48h培养能产酸产气。
我国规定每升自来水中大肠菌群不得超过3个。
检测大肠菌群的方法有稀释培养法和膜滤法两种，其中稀释培养法是标准分析法，为我国大多数卫生单位和水厂所使用。
它包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
四、方法与步骤1.采样：取100ml磨口带塞玻璃瓶，包扎后，干热灭菌备用。
取自来水样时，至少应先放水5min，以冲去龙头口所带的微生物，获得主流管中有代表性的水样。
取样时，用右手握瓶，左手启开瓶塞，用覆盖瓶口的纸托住瓶塞，收集样品后，连同覆盖纸一起将瓶口塞好，并用线绳在原处扎好。
注意手指不得触及瓶口内部。
在静水中取样时，先用右手揭去塞子，瓶口朝下浸入水下约30cm处，然后将瓶子反转过来，待水注满后，取出塞好瓶口。
如果水在流动，瓶口必须迎着水流，以免手上的细菌被水冲进瓶子。
2.水样放置过程中，内含的细菌数目和类型会发生变化，所以要求水样品应于6~10℃贮存，并不超过6h。
3.初发酵试验：吸取待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，10ml接种量采用双料发酵管，而lml及lml以下接种量采用单料管。
实验九多管发酵法测定水中大肠菌群
证实有大肠菌群存在后，再根据复发酵的阳性管
（瓶）数查表，即得每升水样中的大肠菌群数。
▲ 将100、10、1、0.1（10-1）ml水样的发酵管 结果查水 样的发酵管结果查表4
五 实验报告
实验课程论文
封面格式 《水处理微生物学》课程实验
水样管/ml 100 10 1 0.1 0.01
发酵结果
2 思考题
(1) 大肠菌群的定义是什么? (2) EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查 大肠菌群时，各起什么作用？
存在于肠道中的正常菌群,在正常生理情 况下不致病.
（1）大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli） E.coli
（2）产气杆菌（Aerobacter aerogenes） （3）枸橼酸盐杆菌（Coli citrovorum） （4）副大肠杆菌（Paracoli） 大肠菌群的生理习性与病原菌相似，并且外界 存活时间基本一致.
经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢 杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通 浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一 初发酵管的同类型菌落1--3个，37℃培养24h，结果 若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。
同类型菌落① 深紫黑色、有金属光泽。 ② 紫黑色、不带或略带金属光泽。 ③ 淡紫红色、中心颜色较深。
3 复发酵试验
以上大肠菌群阳性菌落，经涂片革兰氏染 色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再 进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸 又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
水样 接种
初步 发酵
产酸 产气
大肠菌群
厌氧芽孢杆菌
好氧芽孢杆菌
平 板 分 离
鉴 别 培 养 基
产酸 复发酵
多管发酵法测定水中大肠菌群
多管发酵法测定水中大肠菌群一、目的要求1．学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。
2．了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。
二、基本原理多管发酵法包括初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
1．初（步）发酵试验发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。
乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。
溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽胞菌生长的作用。
水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果。
在量少的情况下，也可能延迟到48小时后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
2．平板分离平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endo＇s medium）或伊红美蓝琼脂（eosin methylene blueagar，EMB agar），前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。
亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。
伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。
初发酵管24小时内产酸产气和48小时产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。
3．复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽胞杆菌者，通过此试验再进一步证实。
实验九 水中总大肠菌群的测定
（2）检测池水、河水或湖水
应取距水面10－15cm的深层水样，先将灭菌带玻璃塞的空瓶瓶口向下 浸入水中，然后翻转过来，拨开玻璃塞，水即流入瓶中，满后将玻璃塞塞
好，再从水中取出。有时需用特制的采样器取水样。采取的水样最好立即
维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降
低压力，延长时间。 5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打 开灭菌器盖，取出物品。
手提式高压蒸 汽灭菌锅
高压蒸汽自动 灭菌锅
斜面摆放与冷凝
倒平板操作法示意图
五 操作步骤 1 水样的采取
（1）检测自来水
4 分离培养
将初发酵的阳性管(产酸产气)的菌液分别划线接种于伊红美蓝琼脂培 养基平板。置36±1℃温箱内，培养18～24h，然后取出，观察菌落形态。 选择符合大肠菌群菌落特征的菌落:① 深紫黑色，有金属光泽；② 紫黑色， 不带或略带金属光泽；③ 淡紫红色，中心颜色较深, 挑取一部分，进行革 兰氏染色。
思考题
1. 何谓大肠菌群？它主要包括哪些细菌属 ？ 2. 假如水中有大量致病菌，如：痢疾、伤 寒、霍乱等病原菌，用多管发酵法检测总 大肠菌群，能否得到阳性结果？为什么？ 3. 为什么接种100、10 mL水样，用的是3 倍 浓缩的乳糖蛋白胨培养基，而接种1.、 0.1、0.01、0.001 mL水样，则用乳糖蛋白 胨培养基？
（2）水源水
在装有5ml 3倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基的试管中加入10ml水样品；于各装有 10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL水样；再于各 装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL 1：10 稀释的水样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养 48h。 （可以根据水的污染程度选择3个稀释度）
多管发酵法测定水中大肠菌群
多管发酵法测定水中大肠菌群
第1页
多管发酵法测定水中大肠菌群
一、试验目标 二、试验原理 三、试验材料 四、试验步骤 五、试验汇报
多管发酵法测定水中大肠菌群
第2页
一、试验目标
1、学习测定水中大肠菌群数量多管发酵法。 2、了解大肠菌群数量在饮水中主要性。
多管发酵法测定水中大肠菌群
划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37 ℃培养 18～24 h，将符合以下特征菌落进行染色镜检。
深紫黑色，有金属光泽；
紫黑色，不带或略带金属光泽；
淡紫红色，中心颜色较深。
多管发酵法测定水中大肠菌群
第9页
（3）复发酵试验 将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌菌株重复初
步发酵试验。并依据初发酵管试验阳性管查表， 即得大肠菌群数。
多管发酵法测定水中大肠菌群
第4页
2）平皿分离（证实试验）
水中除大肠菌群外，还有其它细菌可能引 发糖类发酵，所以需要深入证实。
将初发酵管中已发酵菌液接种于伊红美兰 培养基，37 ºC培养24 h，依据菌落特征（带关 键、有金属光泽深紫色菌落），挑取可能为大 肠菌群菌落制片，经革兰氏染色，深入证实是 否为大肠菌群。
水样稀释： 10-1与10-2
接种：分别吸收1ml 10-2 、 10-1和原水样接入装 有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管 ；另取10ml原 水样接入装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管 ， 混匀后，37 ℃培养24 h，24 h未产气继续培养48 h。
多管发酵法测定水中大肠菌群
第8页
（2）平板分离 将经24 h和48 h培养后产酸产气发酵管，分别
2.思索题
（1） 何谓大肠菌群，它主要包含哪些细菌属？
总大肠菌群多管发酵法测定步骤
总大肠菌群多管发酵法测定步骤总大肠菌群多管发酵法测定步骤，这可是个不简单的活儿。
咱们得一步一步来，不能马虎。
先说说第一步，准备工作。
1.1 准备实验器材和试剂咱们得准备好实验用的器材和试剂。
实验器材包括：多管发酵装置、恒温水浴锅、磁力搅拌器、显微镜、比色计等。
试剂方面，主要有大肠杆菌培养基、胰蛋白胨、酵母提取物等。
这些器材和试剂都是实验成功的关键，可不能马虎。
1.2 准备大肠杆菌培养基接下来，咱们要准备大肠杆菌培养基。
这个过程可不像吃火锅那么简单，需要耐心和细心。
将胰蛋白胨和酵母提取物分别加入到适量的水中，加热至120°C左右，然后冷却至50°C左右。
接着，将培养基中的氯化镁、硫酸铜等成分加入到上述溶液中，搅拌均匀。
将培养基倒入培养皿中，放入恒温箱中进行灭菌处理。
第二步，大肠杆菌的接种与培养。
2.1 接种大肠杆菌在完成了培养基的制备后，接下来就是接种大肠杆菌了。
这个过程可不能让大肠杆菌逃跑哦！将待测样品加入到培养基中，然后用无菌吸管轻轻搅拌均匀。
接着，将搅拌好的样品转移到多管发酵装置中，进行后续的发酵操作。
2.2 培养大肠杆菌将大肠杆菌接种到培养基中后，接下来就是等待它们成长的过程了。
这个过程可不像看电影那么轻松，需要耐心等待。
一般来说，大肠杆菌在适宜的温度和湿度条件下，大约需要24-48小时才能开始繁殖。
在这个过程中，我们可以观察到大肠杆菌的数量随着时间的推移而逐渐增加，这是一个很好的信号。
第三步，发酵过程的控制与监测。
3.1 控制发酵条件在完成了大肠杆菌的接种与培养后，接下来就是控制发酵条件了。
这个过程可不像玩游戏那么简单，需要我们时刻关注。
我们需要将多管发酵装置放入恒温水浴锅中进行恒温培养。
我们需要使用磁力搅拌器对发酵液进行搅拌，以保证发酵过程的顺利进行。
我们还需要定期检测发酵液中的大肠杆菌数量、营养物质含量等指标，以便及时调整发酵条件。
3.2 监测发酵过程在控制好发酵条件后，接下来就是监测发酵过程了。
实验三（设计性实验）九龙江水大肠菌群的测定
实验三（设计性实验）九龙江⽔⼤肠菌群的测定九龙江⽔⼤肠菌群的测定周涛（闽南师范⼤学⽣科院⾷品科学与⼯程14级）摘要：本⽂通过多管发酵法测定⽔源⽔⼤肠菌群数量，初步发酵试验检测⽔源⽔存在⼤肠杆菌菌群，平板分离得到单⼀菌群群落，复发酵试验通过⾰兰⽒染⾊确定为⼤肠菌群阳性结果。
关键词：九龙江⽔、⼤肠菌群、多管发酵法、初步发酵试验、平板分离、复发酵试验、⾰兰⽒染⾊、DETERMINATION OF COLIFORM BACTERIA JIULONGRIVER WATERTao ZhouAbstract:In this paper, multiple tube fermentation method determined by the number of coliform source water, preliminary fermentation tests detect the presence of E. colibacteria source water, flat flora isolated single community, complex fermentation testby Gram stain identified as coliform positive results.Key words:Jiulong River water, coliform, multi-tube fermentation method, preliminary fermentation tests, flat separated, complex fermentation test, Gram stain,1材料与⽅法1.1 基本原理多管发酵法包括初步发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
1.1.1初步发酵试验(48h ，需2天)发酵管内装有乳糖胆盐蛋⽩胨液体培养基，并倒置⼀德汉⽒⼩导管。
乳糖能起选择作⽤，因为很多细菌不能发酵乳糖，⽽⼤肠菌群能发酵乳糖⽽产⽣酸产⽓。
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实验九水中总大肠菌群的测定—多管发酵法一．实验目的和要求
1．掌握多管发酵法测定水中大肠菌群的技术。
2．预习第六章细菌学检验法的关内容。
二．原理
总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。
多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。
试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN表示。
三．仪器
(1)高压蒸气灭菌器。
(2)恒温培养箱、冰箱。
(3)生物显微镜、载玻片。
(4)酒精灯、镍铬丝接种棒。
(5)培养皿（直径100mm）、试管（5×150mm），吸管（1、5、10mL）、烧杯（200、500、2000mL）、锥形瓶（500、1000mL）、采样瓶。
四．培养基及染色剂的制备
1．乳糖蛋白胨培养液：将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节溶液pH为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，贮存于冷暗处备用。
2．三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。
除蒸馏水外，各组份用量增加至三倍。
3．品红亚硫酸钠培养基：
①贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20～30g琼脂加到900mL 蒸馏水中，加热溶解，然后加入3.5g磷酸氢二钾及10g蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水补充到1000mL，调节溶液pH为7.2～7.4。
趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀，定量分装于250mL或500mL锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在121℃灭菌15min，贮存于冷暗处备用。
②平皿培养基的制备：将上法制备的贮备培养基加热融化。
根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌试管中；再按比例称取无水亚硫酸钠，置于另一灭菌试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（灭菌）。
用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色再褪至淡红色为止（不宜加多）。
将此混合液全部加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。
立即将此培养基适量（约15mL）倾入已灭菌的平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用，但保存时间不宜超过两周。
如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。
4．伊红美培养基：
①贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20～30g琼脂加到900mL 蒸馏水中，加热溶解。
再家人2.0g邻酸二氢钾及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至1000mL，调节溶液pH值为7.2～7.4。
趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀后定量分装于250mL或500mL锥形瓶内，于121℃高压灭菌15min，贮于冷暗处备用。
②平皿培养基的制备：将上述制备的贮备培养基融化。
根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液（0.4g伊红溶于20mL水中）和一定量已灭菌的0.5%美蓝水溶液（0.065g美蓝溶于13mL水中），加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此培养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用。
5．革兰氏染色剂：
①结晶紫染色液：将20mL结晶紫乙醇饱和溶液（称取4～8g结晶紫溶于100mL95%乙醇中）和80mL 1%草酸铵溶液混合、过滤。
该溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。
②助染剂：将1g碘与2g碘化钾混合后，加入少许蒸馏水，充分振荡，待完全溶解后，用蒸馏水补充至300mL。
此溶液两周内有效。
当溶液由棕黄色变为淡黄色时应弃去。
为易于贮备，可将上述碘与碘化钾溶于30mL蒸馏水中，临用前再加水稀释。
③脱色剂：95%乙醇。
④复染剂：将0.25g沙黄加到10mL95%乙醇中，待完全溶解后，加90mL蒸馏水。
五．测定步骤
1．生活饮用水：
①初发酵试验：在两个装有已灭菌的50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中（内有倒管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样100mL。
在10支装有已灭菌的5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样10mL混匀后置于37℃恒温箱内培养24h。
②平板分离：上述各发酵管经培养24h后，将产酸、产气及只产酸的发酵管分别接种于伊红美蓝培养基或品红亚硫酸钠培养基上，置于37℃恒温箱内培养24h，挑选符合下列特征的菌落：
a．伊红美蓝培养基上：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。
b．品红亚硫酸钠培养基上：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落。
③取上述特征的群落进行革兰氏染色：
a．用以培养18～24h的培养物涂片，涂层要薄；
b．将涂片在火焰上加温固定，待冷却后滴加结晶紫溶液，1min后用水洗去；
c．滴加助色剂，1min后用水洗去；
d．滴加脱色剂，摇动玻片，直止无紫色脱落为止（约20～30s），用水洗去；
e．滴加复染剂，1min后用水洗去，晾干、镜检，呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者为阴性菌。
④复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管（瓶）的最典型菌落1～3个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产酸、产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证实有大肠菌群存在。
根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查附表1“大肠菌群检数表”，报告每升水样中的大肠菌群数。
2．水源水
①于各装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分
别加入10mL 水样；于各装有10mL 乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL 水样；再于各装有10mL 乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL 1∶10稀释的水样。
共计15管，三个稀释度。
将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养24h 。
②平板分离和复发酵试验的检验步骤同“生活饮用水检验方法”。
③根据证实总大肠菌群存在的阳性管数，查附表2“最可能数（MPN ）表”，即求得每100mL 水样中存在的总大肠菌群数。
我国目前系以1L 为报告单位，故MPN 值再乘以10，即位1L 水样中的总大肠菌群数。
例如，某水样接种10mL 的5管均为阳性；接种1mL 的5管中有2管为阳性；接种1∶10的水样1mL 的5管均为阴性。
从最可能数（MPN ）表中查检验结果5～2～0，得知100mL 水样中的总大肠菌群数为49个，故1L 水样中的总大肠菌群数为49×10=490个。
对污染严重的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应做1∶10、1∶100、1∶1000或更高倍数的稀释，检验步骤同“水源水”检验方法。
如果接种的水样量不是10mL 、1mL 和0.1mL ，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN 指数，再经下面公式换算成每100mL 的MPN 值：
)
()
(10mL mL MPN MPN 接种量最大的一管指数值⨯
=
附表1 大肠菌群检数表
接种水样总量300mL （100mL2份，10mL10份）
附表2 最可能数（MPN）表
（接种5份10mL水样、5份1mL水样、5份0.1mL水样时，不同阳性及阴性情况下100mL
水样中细菌数的最可能数和95%可信限值）。